用RT-PCR方法检测登革病毒E基因核酸

目的：应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术建立检测登革2型病毒E基因的方法。方法：分别抽提登革2型病毒NGC株和从登革出血热病人血清中分离得到的2型登革热病毒(DV)核酸(RNA)，合成CD-NA第一链，经过RT-PCR得到cDNA产物，用HinfI限制性内切酶酶切鉴定。结果：通过RT-PCR检测登革2型病毒核酸。结论：登革2型病毒E基因核酸的RT-PCR检测方法的建立为快速诊断登革病毒感染提供了可靠的方法。     

2003年广州市登革1型病毒流行株的分离及NS2基因序列分析

目的对广州市区2003年仲夏—批疑似登革病毒感染的患进行确诊，并从基因水平分析流行株的可能来源。方法用免疫层析法(ICT)检测早期疑似患的DV—IgN和IgG抗体；同时用逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)、细胞培养病毒分离分别进行病原的分离和鉴定；对所分离到的毒株进行基因克隆、测序，并与国际参考株及国内流行株相应的序列进行同源性分析，结合患的流行病学资料推测本次流行株的可能来源。结果发病5d内患DV—IgM抗体阳性率为56．5％(13／23)，发病5～10d的患DV—IgM抗体阳性率为66．7％(16／24)；DV—IgG抗体无1例阳性。从18份发病5d内患的血标本中分离病毒7份，经RT—PCR和基因测序检测证实为DVI感染；用RT—PER检测30份早期患血标本，患的阳性率为83．3％(25／30)。基因序列分析表明，2003年流行株与登革1型病毒柬埔寨流行株及我国1997、1999年登革1型病毒流行株的同源性最高，分别为97％、97％、98％。所有患在发病前两个月均在广州市区某大院内居住，无输血史、无外出史。结论2003年广州登革热流行为登革1型病毒感染所致，推测广东可能存在登革1型病毒的疫源地。     

聚合酶链反应阵列同时定量检测37种白血病融合基因

目的建立一种同时定量检测多种白血病染色体易位形成的融合基因的荧光实时定量聚合酶链反应（real-time PCR）方法,了解阵列式PCR的应用可行性。方法组合使用82条引物,设立66个PCR平行管,同时定量检测37种白血病常见融合基因形成的125种剪切体和4种白血病常见的原癌基因活化。实时定量PCR采用Eva Green荧光染料法,用ABL基因做内参,用比较Ct法进行相对定量。用此方案对31例白血病患者标本进行检测,其中6例慢性粒细胞白血病（CML）患者做治疗前后或治疗过程中不同时间的对比检测,28人次与多重巢式PCR方案的检测结果进行对照。结果我们建立的PCR阵列方案有较大的线性检测范围（10^2～10^8拷贝／μl）,有较高的检测灵敏度（232拷贝／μl）和精确性;在31例患者标本的检测中,共检测到14种融合基因类型和所有4种原癌基因活化;检测到一例同时有5种融合基因阳性和两种原癌基因活化的患者;和多重巢式PCR检测结果的对比显示本方案灵敏度略低于巢式PCR,但差异没有统计学意义（P=0．009）;6例CML患者标本的检测显示治疗后患者标本中BCR／ABL融合基因及WT1和EVI1原癌基因表达量均呈现不同程度的降低,与临床治疗情况符合;基因定量分析的结果表明本方案能够对常见白血病融合基因和癌基因活化情况进行定量分析,在白血病的诊断及疗效监测中有应用价值。结论PCR阵列法同时定量检测多种白血病融合基因适于白血病初诊患者融合基因的筛查及微小残留病（MRD）的检测,对于检测同时有多种融合基因存在的病例及治疗过程中融合基因的变异情况更为有用。     

利用SOE-PCR技术构建eglAp-rhIL-12融合基因的条件优化

目的利用SOE-PCR技术连接丙酮丁醇梭菌内源性β1,4-葡聚糖酶启动子和信号肽(eglAp)与重组人白细胞介素12(rhIL-12)序列,构建融合基因eglAp-rhIL-12;优化SOE-PCR反应中的主要条件,获得具有可重复性的SOE-PCR方法。方法通过PCR得到eglAp的3′端和rhIL-12的5′端重叠的两个基因序列;通过调整SOE-PCR体系中模板eglAp和rhIL-12的量及比例,得到目的产物;通过调整退火温度及引物量提高扩增产物特异性。结果当SOE-PCR满足以下条件时即可获得高纯度高丰度目的产物:25μL PCR反应体系中,eglAp和rhIL-12的两个模板量分别为5～10ng,摩尔比为5∶1(质量比1∶1);在不加引物的情况下,退火温度设定为71℃,扩增3个循环,然后加入0.4μL引物(10μmol/L),退火温度设定为61.3℃,扩增28个循环。结论 SOE-PCR成功的关键在于调整好模板的比例和浓度,即质量比1∶1,模板量不要少于5ng(25μL PCR体系);若要获得高纯度高丰度的连接产物,则需要适当提高退火温度和减少引物量。     

前列腺癌组织中TMPRSS2基因与ETS家族基因的多种融合亚型及其意义

目的 了解前列腺癌组织标本中跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)基因与ETS转录因子家族成员ETS相关基因(ERG)、ETS变异体1(ETV1)及ETS变异体4(ETV4)基因之间的融合情况及意义.方法 采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)琼脂糖凝胶电泳法检测32例前列腺癌患者及34例前列腺良性增生患者前列腺组织中TMPRSS2基因与ETS家族基因融合的TMPRSS2/ERG、TMPRSS2/ETV1、TMPRSS2/ETV4转录体;琼脂糖凝胶电泳阳性者,纯化PCR产物进行直接测序,用BLAST在线软件比对确定融合位点;分析融合基因与Gleason分级关系.结果 在32例前列腺癌患者组织标本中,检测到TMPRSS2/ERG融合基因17例(53.1%),含5种不同融合基因亚型,其中1种为新发现融合基因亚型(GenBank登录号:EU090248),单一标本中可检测到1种以上TMPRSS2/ERG融合基因亚型;检测到TMPRSS2/ETV1融合基因2例(6.3%),为新发现融合基因亚型(GenBank 登录号:EU090249);未检到TMPRSS2/ETV4融合基因型.34例前列腺良性增生组织标本中均未检测到TMPRSS2/ERG、TMPRSS2/ETV1和TMPRSS2/ETV4融合基因型.按Gleason评分值分为中分化与低分化的两组前列腺癌组织标本之间融合基因阳性率差异无统计学意义(P=0.169).结论 前列腺癌组织中存在TMPRSS2/ERG和TMPRSS2/ETV1融合基因及多种亚型;前列腺癌融合基因的发现有望为前列腺癌的发病机制研究提供新的思路.     

诺瓦克病毒ORF1-ORF2序列核酸片段克隆的构建

目的 构建诺瓦克病毒核酸片段克隆.方法 选取诺瓦克病毒阳性标本,应用 RT-PCR方法 扩增目标片段,将其克隆到质粒,通过酶切、测序鉴定.结果 成功构建诺瓦克病毒核酸片段克隆.结论 成功地获得了可作为核酸检测阳性对照的诺瓦克病毒核酸片段克隆,为该病毒的分子生物学检测和进一步研究奠定了基础.     

一种灵敏检测慢性粒细胞性白血病融合基因的方法:RT-nested-PCR

应用RT-nsted-PCR方法检测15例慢性粒细胞性白血病患者的融合基因bcr/abl，检出率高达93％。此方法是当前检测慢性粒细胞性白血病残留细胞较灵敏、较可靠的方法。     

人呼吸道合胞病毒M2-1基因原核表达质粒的构建与表达

目的 构建人呼吸道合胞病毒（hRSV）MS－1基因原核表达质粒载体,使其于原核细胞中表达。方法 利用Hep-2细胞培养hRSV,提取感染细胞总RNA,通过RT－PCR扩增M2－1基因片段。目的片段与质粒pGEX-2Tx EcoRI、XhoI双酶切后,连接、转化,筛选出阳性克隆。阳性克隆菌经诱导剂诱导后,表达M2－1融合蛋白。结果 成功地构建了M2－1基因原核表达质粒载体,实现了其于原核中的表达。结论 建立了hRSV基因M2－1原核表达载体,为进一步研究hRSV奠定基础。     

应用逆转录聚合酶链反应鉴定脊髓灰质炎病毒

应用逆转录聚合酶链反应鉴定脊髓灰质炎病毒孔健，徐爱强，董春明，刘萍，迮文远为了排除急性驰缓性麻痹（ＡＦＰ）病例中的非脊髓灰质炎病例，提高诊断脊髓灰质炎病例的正确性和及时性，我们（应用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）鉴定脊髓灰质炎病毒（简称ＰＶ）的灵...     

licD2基因缺陷导致肺炎链球菌毒力下降

目的:licD2是掌控肺炎链球菌生长所需物质胆碱代谢最重要的基因. 本研究探索licD2基因的缺陷是否影响细菌毒力. 方法:采用插入复制失活的方法缺陷licD2基因,通过相对定量RT-PCR分析其毒力因子表达情况,并利用动物体内试验观察licD2基因缺陷菌株毒力改变. 结果:RT-PCR显示licD2缺陷菌株毒力因子表达低于野生菌,两组比较P＜0.05;转化试验发现缺陷菌株转化力下降甚至消失;小鼠毒力试验结果野生菌株半数致死时间＜1 d,而缺陷菌株半数致死时间为>14 d, P<0.001,差异有显著性;缺陷菌在小鼠体内被清除速度也显著快于野生菌. 结论:结果提示licD2基因的缺陷使自然转化力下降,多种毒力因子表达减弱,细菌毒力降低.     

风疹病毒JR23株包膜糖蛋白E2的基因扩增与序列分析

目的：扩增风疹病毒（RV）JR23株包膜糖蛋白E2的基因片段，分析E2多二级结构特征及E2蛋白跨膜区结果，为研究E2基因结构与蛋白功能的关系。RV结构蛋白之间的相互作用奠定基础。方法：提取感染RV JR23株的BHK21细胞总RNA，利用RT－PCR方法扩增RV JR23株E2基因片段，将PCR产物测序；利用DNAstar软件分析JR23株E2多肽的二级结构特征；利用TmPred软件对E2蛋白的跨膜区进行预测分析。结果：利用BLAST软件分析测序结果，证明扩增产物为RV E2基因片段；DNAstar两个模型对E2多肽的α螺旋、β折叠等区域的分析有较大差异。尤其是β区，G－R模型的预测范围远大于C－F模型，二级结构中带电性与亲水区的分析结果与E2蛋白的已知功能相符；TmPred预测的有意义跨膜区有4个，少于实际值。结论：经RT－PCR扩增，扩增产物的RV JR23株E2基因序列片段，为进一步研究E2基因和蛋白结构与功能奠定基础，软件分析的结果与实际情况有差异，可能是成熟的E2蛋白与E1蛋白形成异二聚体，而部分改变了自身构象。     

RT-PCR扩增人抗HBsAg抗体Fab段基因

目的:采用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)的方法从少量外周血中扩增抗HBsAg抗体重链Fd和κ轻链基因。方法：用RNAex试剂提取细胞总RNA，以Olig(dT)引导合成cDNA第一链．再经PCR扩增的方法，以重链Fd和κ轻链基因简并引物．直接从人外周血混合淋巴细胞中扩增出抗HBsAg抗体重链Fd和κ轻链基因。结果：扩增出分子量为700bp的抗HBsAg抗体重链Fd和κ轻链基因。结论：得到的抗体基因为下一步构建含人抗HBsAg抗体Fab段基因的腺相关病毒载体奠定了基础。     

SEQUENCE ANALYSIS OF THE NS5 REGION OF GBV-C／HGV AND DETECTION OF THE VIRUS BY REVERSE TRANSCRIPTASE PCR

GBV-C/HGV is a newly identified virus associated with human hepatitis.In this study,the nucleotide sequences of the partial NS5 gene of GBV-C/HGV derived from sera of 8 Chinese patients were determined.The nucleotide homology among the 8 isolates were 92% on average.On the basis of sequence analysis,two sets of oligonucleotide primers derived from highly conserved region of GBV-C/HGV NS5 gene were designed to establish both sensitive and specific nested PCR for detection of GBV-C/HGV RNA.253 Chinese patients were examined for the virus RNA.GBV-C/HGV RNA positive rates in patients infected with HBV,HCV and patients with chronic non-B,non-C hepatitis were 18.4%,19.8% and 8.9% respectively.This result suggested that HBV,HCV and GBV-C/HGV shared the same transmission risk factors.8 patients with GBV-C/HGV and HCV coinfection were retrospectively observed for the response to interferon.Coinfection with GBV/HGV did not negatively influence the responsiveness of HCV,and GBV-C/HGV was sensitive to interferon to a certain degree.     

实时荧光定量RT-PCR检测结肠癌中Musashi-1 mRNA的表达

目的:了解正常结肠干/祖细胞标志Musashi-1mRNA在结肠癌中的表达情况.方法:应用实时荧光相对定量RT-PCR的方法检测25例结肠癌组织和18例远端正常结肠组织中Musashi-1mRNA的表达,用2-△△CT的方法计算相对于远端正常组织结肠癌组织中Musashi-1mRNA的表达倍数.结果:经实时荧光定量RT-PCR法检测,结肠癌组织中Musashi-1mRNA的表达与远端正常结肠组织相比有差异(P＜0.01),且是远端正常结肠组织的4.24倍(1.95～9.23).低分化组织与高、中分化组织相比,Musashi-1mRNA的表达有差异(分别为P＜0.001、P＜0.005).低分化组织中Musashi-1的表达是高分化组织的5.54倍(3.07～9.98).结论:正常肠干/祖细胞标志物Musashi-1在结肠癌组织中尤其是低分化组织中的高表达提示Musashi-1可能在结肠肿瘤的发生发展中起着一定的作用.     

人肥胖基因的克隆与原核表达载体的构建

目的：克隆人肥胖基因瘦素蛋白（leptin）编码区cDNA序列，并构建其原核表达载体。 方法：在人体脂肪组织中提取mRNA，利用RT-PCR扩增人肥胖基因，将其插入pMD18-T载体，经双酶切、鉴定后将肥胖基因片段亚克隆入pET-28a表达载体，提取质粒。将阳性重组质粒转化表达受体菌E.coliBL21(DE3)，经IPTG诱导肥胖基因表达产物,以聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测产物蛋白。 结果：经测序证实获得的肥胖基因序列与相关文献报道一致，其表达产物的相对分子质量约为20 000。 结论：利用pMD18-T克隆载体和pET-28a表达载体可以有效地在原核生物中表达重组人类瘦素蛋白。     

逆转录聚合酶链反应检测小鼠MN/CA9基因的表达

目的：克隆、分析ICR小鼠MN/CA9基因序列,并检测MN/CA9基因在ICR小鼠各组织中的表达。方法：分别取ICR小鼠小肠、肝、肾、脾、胃、胸腺、心脏、卵巢、肺、胰腺、肌肉、皮肤、子宫和膀胱新鲜组织,采用胍尼啶异硫氢酸呱酚氯仿提取法（GIT）提取总RNA。合成cDNA的第1链和第2链,连接EcoRⅠ载体,EcoRⅠ末端磷酸化,XhoⅠ消化,将cDNA构建到ZAP express vector进行包装、种植培养,筛选、切取噬菌体,使用引物扩增后进行DNA 序列分析。用逆转录聚合酶链反应检测小鼠MN/CA9基因在上述组织中的表达。结果：使用人类MN/CA9基因片段做探针,用放射性同位素 ³² P 标记探针,筛选1.47×10³大肠埃希菌落,杂交后发现一阳性cDNA信号,序列测定确定其含1 671 bp核苷酸序列（已在GenBank 登录,登录号AB086322）,这个序列与人类的MN/CA9 (基因序列号Z54349)有69.1％的同源性。在引物P521-P1193区间,MN/CA9基因在小鼠小肠、子宫、肌肉、胰腺、心脏、肺、胸腺、脾、肾、卵巢、胃和膀胱组织表达均较强,在皮肤和肝脏不表达。结论：MN/CA9基因在ICR小鼠组织中的表达与人类基本相同,可以用ICR小鼠进行MN/CA9基因的研究。     

通用性引物RT-nPCR扩增不同基因型戊型肝炎病毒基因组的探讨

目的：筛选戊型肝炎病毒(HEV)通用性引物，用于不同基因型HEV基因组的逆转录一巢式聚合酶链扩增(RT-nPCR)。方法：在HEV序列保守区设计和合成A、B、C、D4组引物，用于扩增已知基因型的HEV参考株和HEVIgM阳性的临床标本．探讨扩增区域最小自由能与RT-nPCR扩增效率的关系。结果：4组引物均可扩增出不同基因型HEV基因片段．但得到的PCR滴度有差异，D组引物所得滴度最高，B组最低；54份临床标本的PCR阳性率也以D组最高、B组最低。D组引物扩增区段的RNA模板最小自由能的绝对值最低，B组的最高，与PCR扩增效率相关。结论：在HEV基因组第6296～6603核苷酸之间设计的D组通用性引物可扩增不同基因型HEV以及临床标本，扩增效率高，有较高的应用价值。