骨髓移植物促成骨作用的应用研究

目的:骨髓除了具有造血功能外,还具有成骨作用,对骨髓促成骨作用的应用研究可指导临床实践.资料来源:应用计算机检索骨髓移植物促成骨作用相关研究和应用方面的文献.①通过美国国立医学图书馆网上免费资源(www.nlm.nih.gov)对1976-01/2004-12文献进行检索,检索词为“bone marrow,bone defect or bone nonunion”,限定文章语言种类为English.司时检索www.wangfangdata.com.cn1998-01/2004-12文献,检索词为““骨髓血,骨缺损或骨不连““,限定文章语言种类为中文.资料选择:纳入条件:①随机对照实验研究.②前后对照临床研究.③个案报告.排除条件:重复研究和综述类文献.资料提炼:共收集30篇文献,通过查找全文,重点引用文献25篇.排除的5篇为重复研究和综述文献.资料综合:①骨髓移植物的成骨机制:1987年一项研究发现在塑料培养皿中培养出的贴壁骨髓单核细胞在一定条件下可以分化成成骨细胞、成软骨细胞,此种单核细胞为骨髓间充质干细胞.②骨髓及浓缩骨髓成骨作用的临床应用:15例骨不连患者应用经皮自体骨髓移植治疗,13例在5～9个月愈合,2例未愈合.据报道每毫升骨髓中只有约2 000个间充质干细胞,通过骨髓血浓缩办法很难将注射骨髓血中的间充质干细胞数目提高到骨组织工程骨间充质干细胞接种的数量级,因此骨髓血促进骨折愈合可能与骨髓血凝固过程中释放的促成骨因子有关.③经体外扩增间充质干细胞成骨作用:研究发现间充质干细胞随传代次数的增加成骨能力呈下降趋势.结论:基于骨髓移植物具有促成骨作用的机制,临床应用研究有两个方向.①不经体外培养扩增骨髓基质干细胞.②经体外扩增骨髓基质干细胞、成骨诱导,然后经皮注射或者复合载体组织工程骨来修复骨创.     

老年人股骨近端骨髓基质干细胞成骨分化功能的研究

目的：通过对来自干全髋置换术中的股骨近端骨髓基质干细胞生物特性尤其是成骨分化潜能的研究，以期为将其应用于骨、软骨损伤修复和老年人骨关节疾患发病机理的研究提供细胞生物学依据。方法：运用 Ficoll密度梯度离心分离得到骨髓基质干细胞。分别在含10％FBS的LG—DMEM和含10％FBS的DMEM（10^-8M地塞米松，50μg／ml维生素C，10mMβ-甘油磷酸钠）中培养。用Von Kossa染色、四环素荧光染色证实特征性骨结节的形成，用ALP染色来区分MSC中向成骨细胞分化的细胞，收集处于不同分化时期的细胞和上清液，应用PNPP法测定碱性磷酸酶活性、放免法检测骨钙素活性，RT—PCR检测骨髓基质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化的基因的表达情况。结果：股骨近端来源的骨髓基质干细胞增殖迅速，在成骨诱导液中表现出更强的成骨分化能力。培养至13天时，ALP染色强阳性；普通培养液中培养至35天时，相差显微镜下可见细胞结节形成，继续培养则形成肉眼可见结节，直径达1mm。经Van Kossa染色、四环素荧光标记进一步证实为钙盐沉积、特征性骨结节。随着细胞诱导时间的延长，碱性磷酸酶活性逐渐增强，至12天时活性最大；骨钙素活性也是逐渐增强，至15天时最大。骨髓基质干细胞在诱导条件下，成骨细胞和脂肪细胞的特异性基因在mRNA水平没有明显随着诱导时间变化。结论：股骨近端来源的骨髓基质干细胞取材方便、在体外培养增殖迅速，在地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠诱导下细胞向成骨细胞的分化能力增强，和正常成人髂骨来源的骨髓基质干细胞成骨分化时相一致。为股骨近端骨髓基质干细胞的进一步应用提供了细胞生物学依据。     

从脐血和骨髓中诱导成骨样细胞的体外研究

目的：探讨脐血和骨髓单个核细胞(monocytes，MNC)体外培养过程中的生长特性及诱导贴壁细胞向成骨细胞分化。方法：分离脐血和骨髓MNC，按培养基不同分成3组：分别为Mesencult^TM无血清培养基。CellGRO培养基 100mL／L胎牛血清。DMEM／F12培养基 100mL／L FBS。体外培养以获得贴壁细胞。观察不同培养条件下细胞扩增的效果。获得的贴壁细胞培养基中加入地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸，诱导细胞向成骨细胞分化。检测诱导后细胞成骨细胞标志物碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和骨钙素的表达。结果：脐血和骨髓MNC在含有血清的培养基中可以获得更多的贴壁细胞。骨髓MNC贴壁细胞形态均一，呈典型的成纤维细胞样，而脐血贴壁细胞未获得典型的成纤维细胞样细胞，混有大量的圆形细胞。骨髓中获得的细胞可以持续传代10代以上仍保持良好的增殖状态；脐血贴壁细胞最多可以传代2次，细胞总数和纤维样细胞均逐代减少。诱导后的脐血和骨髓细胞均呈碱性磷酸酶阳性，免疫组化染色显示Ⅰ型胶原和骨钙素表达阳性。结论：骨髓MNC体外培养可以获得典型的间充质干细胞且可以持续多代扩增，向成骨细胞诱导后，形态和标志物检测都呈典型的成骨细胞样。脐血MNC体外培养可获得贴壁细胞，但不呈间充质干细胞样，向成骨细胞诱导后，虽形态与成骨细胞不相似，但成骨细胞的标志物表达均呈阳性。     

混合骨髓移植的实验研究

目的：探讨在异基因骨髓移植治疗白血病中既控制移植物抗宿主病（ＧＶＨＤ）又同时保留移植物抗白血病（ＧＶＬ）作用的移植方案。方法：采用近交系小鼠移植模型，在异基因骨髓、脾细胞移植物中混合一定比例的同基因脾细胞，观察移植后受鼠ＧＶＨＤ死亡率、脾结节数、移植后不同时间骨髓造血重建细胞来源以及受鼠脾脏淋巴细胞对供、受鼠双方来源的刺激细胞增殖反应；采用Ｌ６１５小鼠白血病模型观察混合移植对荷瘤小鼠生存时间及死亡原因的影响。结果：混合移植可以有效减轻ＧＶＨＤ，异基因造血免疫细胞在受鼠体内一过性存留并发挥移植物抗宿主反应，使荷瘤小鼠生存时间明显延长。结论：异基因骨髓、脾细胞移植物中混合一定比例的同基因脾细胞使移植受鼠体内既具有主要组织相容性抗原复合物（ＭＨＣ）不合的免疫活性细胞发挥一过性ＧＶＬ作用，同时减轻了异基因骨髓移植的严重ＧＶＨＤ。     

混合骨髓移植治疗急性白血病7例疗效观察

目的：探讨应用混合骨髓移植(MBMT)治疗急性白血病的疗效。方法；采用化疗加全身照射方案预处理后，回输自体骨髓及HLA部分相合的同胞兄妹少量骨髓，重建造血及免疫功能，诱导移植物抗白血病(GVL)作用治疗7例急性白血病患者。结果：所有病例均获得造血重建及出现一过性移植物抗宿主病(GVHD)，4例长期无病存活，分别为99、91、80、66个月，3例因重度GVHD而在半年至1年内死亡。结论：MBMT治疗急性白血病疗效满意。     

自体骨髓移植复合人工骨治疗骨缺损

背景：到目前为止,国内人工骨联合自体骨髓移植治疗新鲜骨折、骨缺损方面的基础与临床研究尚未见报道。目的：分析自体骨髓移植复合人工骨修复四肢粉碎性骨折骨缺损的作用途径。方法：42例四肢骨缺损患者按治疗方法分为3组,均采用内固定方法修复骨折骨缺损。复合组采用自体骨髓移植复合人工骨,人工骨移植组仅作单纯的人工骨移植,自体骨髓移植组仅将单纯的自体骨髓注射入骨缺损处。所有患者均行骨特异性碱性磷酸酶活性检测和影像学随访,观察骨痂形成及骨折愈合情况。结果与结论：在内固定后第3,4,6周,复合组伤肢骨痂形成率、骨特异性碱性磷酸酶活性均显著高于人工骨移植组及自体骨髓移植组（P〈0.01）。提示自体骨髓移植复合人工骨较单纯的人工骨移植或自体骨髓移植更能促进早期骨痂反应,加速骨折后骨缺损愈合,缩短骨愈合时间及住院时间。     

自体骨髓移植复合人工骨治疗骨缺损

背景:到目前为止,国内人工骨联合自体骨髓移植治疗新鲜骨折、骨缺损方面的基础与临床研究尚未见报道。目的:分析自体骨髓移植复合人工骨修复四肢粉碎性骨折骨缺损的作用途径。方法:42例四肢骨缺损患者按治疗方法分为3组,均采用内固定方法修复骨折骨缺损。复合组采用自体骨髓移植复合人工骨,人工骨移植组仅作单纯的人工骨移植,自体骨髓移植组仅将单纯的自体骨髓注射入骨缺损处。所有患者均行骨特异性碱性磷酸酶活性检测和影像学随访,观察骨痂形成及骨折愈合情况。结果与结论:在内固定后第3,4,6周,复合组伤肢骨痂形成率、骨特异性碱性磷酸酶活性均显著高于人工骨移植组及自体骨髓移植组(P<0.01)。提示自体骨髓移植复合人工骨较单纯的人工骨移植或自体骨髓移植更能促进早期骨痂反应,加速骨折后骨缺损愈合,缩短骨愈合时间及住院时间。     

联合应用地塞米松和维甲酸诱导兔骨髓基质细胞向成骨方向的转化

目的：观察维甲酸和地塞米松对兔骨髓基质细胞的成骨诱导影响，探讨二者联合诱导兔骨髓基质细胞向成骨细胞分化的可能性和适当条件，使兔骨髓基质细胞向成骨诱导得以优化，从而为临床治疗骨缺损提供实验基础。方法：实验于2005—12／2006—3在锦州医学院附属第一医院骨科实验室完成。①体外培养兔骨髓基质干细胞。②用不同的诱导剂将其向类成骨细胞诱导。实验分非诱导组（用DMEM培养基培养），地塞米松诱导组（培养基中加入地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C），维甲酸诱导组（培养基中加入维甲酸），地塞米松与维甲酸联合诱导组（培养基中加入地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C和维甲酸）。③通过倒置相差显微镜对细胞的形态进行观察；于第4，6，8，10，12天定量检测其分泌的碱性磷酸酶；应用原位杂交技术检测Ⅰ型胶原的表达情况。结果：①原代和传代培养时不同组别兔骨髓基质细胞的生长情况：地塞米松诱导组细胞形态向类成骨细胞转化，维甲酸诱导组细胞与神经干细胞类似，地塞米松与维甲酸联合诱导组细胞与地塞米松诱导组细胞形态变化大体一致，但细胞更饱满，多角形细胞比例更高，部分区域细胞呈现漩涡状分布。②各组碱性磷酸酶活性检测结果：非诱导组碱性磷酸酶表达量低，随时间略有增加；地塞米松诱导组碱性磷酸酶表达呈曲线升高[6，8．10，12d依次为（265．9&;#177;47．3），（445．4&;#177;69．4），（650．3&;#177;52．0），（703．6&;#177;62．5）nkat／L]；维甲酸诱导组基本无碱性磷酸酶表达；地塞米松与维甲酸联合诱导组碱性磷酸酶表达趋势与地塞米松诱导组相似，但绝对值有所增高[6，8，10，12d依次为（355．4&;#177;62．2），（631．3&;#177;84．4），（925．0-69．0），（1039．5&;#177;85．2）nkat／L]。（固各组原位杂交技术检测Ⅰ型胶原结果：地塞米松诱导组和地塞米松、维甲酸联合诱导组检测Ⅰ型胶原结果发现胞浆内可见大量棕黄色颗粒，非诱导组与维甲酸诱导组为阴性。结论：适当浓度地塞米松可成功的将兔骨髓基质细胞向成骨细胞诱导，维甲酸与地塞米松联合诱导可使成骨能力进一步加强，表现为碱性磷酸酶表达明显增高，并表达Ⅰ型胶原，具体浓度条件有待进一步研究。     

从脐血和骨髓中诱导成骨样细胞的体外研究

目的:探讨脐血和骨髓单个核细胞(monocytes,MNC)体外培养过程中的生长特性及诱导贴壁细胞向成骨细胞分化。方法:分离脐血和骨髓MNC,按培养基不同分成3组:分别为MesencultTM无血清培养基。CellGRO培养基+100mL/L胎牛血清。DMEM/F12培养基+100mL/LFBS。体外培养以获得贴壁细胞。观察不同培养条件下细胞扩增的效果。获得的贴壁细胞培养基中加入地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸,诱导细胞向成骨细胞分化。检测诱导后细胞成骨细胞标志物碱性磷酸酶、I型胶原和骨钙素的表达。结果:脐血和骨髓MNC在含有血清的培养基中可以获得更多的贴壁细胞。骨髓MNC贴壁细胞形态均一,呈典型的成纤维细胞样,而脐血贴壁细胞未获得典型的成纤维细胞样细胞,混有大量的圆形细胞。骨髓中获得的细胞可以持续传代10代以上仍保持良好的增殖状态;脐血贴壁细胞最多可以传代2次,细胞总数和纤维样细胞均逐代减少。诱导后的脐血和骨髓细胞均呈碱性磷酸酶阳性,免疫组化染色显示I型胶原和骨钙素表达阳性。结论:骨髓MNC体外培养可以获得典型的间充质干细胞且可以持续多代扩增,向成骨细胞诱导后,形态和标志物检测都呈典型的成骨细胞样。脐血MNC体外培养可获得贴壁细胞,但不呈间充质干细胞样,向成骨细胞诱导后,虽形态与成骨细胞不相似,但成骨细胞     

骨髓间充质干细胞对异基因骨髓移植后aGVHD和GVL的影响

为了观察骨髓间充质干细胞(BMMSC)对异基因骨髓移植(allo-BMT)后急性移植物抗宿主病(aGVHD)和移植物抗白血病(GVL)效应的影响，以急性淋巴细胞白血病(ALL)小鼠为动物模型，对其进行allo-BMT的同时，静脉输注体外培养的供鼠BMMSC，同时设立单纯allo—BMT对照组。记录受鼠存活时间；观察受鼠发生aGVHD一般反应及病理学变化；用流式细胞术检测受鼠CD4^ 、CD8^ T细胞亚群的差异；采用性染色体检查检测嵌合状况。结果显示：BMMSC推迟aGVHD发生的时间；降低CD4^ T细胞的同时增加CD8^ T细胞的数量；明显延长受鼠allo—BMIT后的生存时间。结论：BMMSC与allo-BMT联合进行具有一定的GVL效应；BMMSC能抑制allo—BMT后aGVHD的发生，但同时具有一定的GVL效应。     

Bone marrow graft rejection as a function of antibody-directed natural killer cells

There is conclusive evidence that acute bone marrow transplant rejection in lethally irradiated mice is caused by natural killer (NK) cells. The rejection of marrow allografts is exquisitely specific and is controlled by antigenic determinants encoded in or near the H-2 gene complex. The specificity of in vivo marrow graft rejection contrasts with the in vitro specificity pattern of NK cells in cytotoxicity assays. We therefore examined how NK cells cause H-2-specific marrow graft rejection in vivo. Several experimental approaches are presented that suggest that natural antibody, present in responder strains of mice, specifically directs NK cells in an antibody-dependent cytolytic and/or cytostatic reaction, resulting in marrow graft rejection. The following evidence for this mechanism is documented. The ability to reject a marrow graft can be passively transferred by serum from responder to allogeneic nonresponder mice and the specificity of rejection can be mapped within the H-2 region. Serum-induced marrow graft rejection is abrogated following depletion of immunoglobulin, and the serum of responder mice is able to induce a specific antibody-dependent cytotoxic reaction in vitro.     

Bone marrow

This article describes the composition of bone marrow and the normal progression of bone marrow changes as they occur throughout the aging process, and provides examples of pitfalls and variants that may simulate disease.     

Bone marrow suppression

Bone marrow suppression is one of the most popular side effects of cancer chemotherapy. Bone marrow suppression includes neutropenia, anemia and thrombocytopenia. Clinical application of cytokine is useful in the treatment of bone marrow suppression due to cancer chemotherapy. Granulocyte colony-stimulating factor(G-CSF) is useful in the treatment of neutropenia. Erythropoietin(EPO) is useful is the treatment of anemia. However, EPO is not widely used in Japan yet. Clinical application of varions cytokines will bring forth much improvement in the treatment of bone marrow suppression due to cancer chemotherapy.     

Bone marrow sampling

Bone marrow sampling may be indicated in the evaluation of iron metabolism, fever of unknown origin, anemia, leukocytosis and other hematologic abnormalities. The commonly accepted means of marrow sampling are needle aspiration and needle biopsy. The preferred site for obtaining the sample is the iliac crest. Contraindications to the procedure include infection or previous radiation therapy at the sample site, poor patient cooperation and major coagulation defects. The assistance of a skilled technician, use of a prepackaged tray, thorough patient education, use of local anesthesia and attention to aseptic technique help simplify bone marrow sampling.