Heymann肾炎致病原受体相关蛋白羧基端多肽表达…

本研究中，用ＰＣＲ方法扩增了受体相关蛋白基因第６３３－９５７碱基ｃＤＮＡ片段。将编码成熟分子量为４４×１０＾３受体相关蛋白和羧基端１０８氨基酸多肽的ｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１内，限制性图谱分析测定了插入子的方向并用ＤＮＡ序列分析加以证实。     

Heymann肾炎致病原受体相关蛋白羧基端多肽表达的研究

本研究中，用ＰＣＲ方法扩增了受体相关蛋白基因第６３３～９５７碱基ｃＤＮＡ片段。将编码成熟分子量为４４×１０３受体相关蛋白和羧基端１０８氨基酸多肽的ｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１内，限制性图谱分析测定了插入子的方向并用ＤＮＡ序列分析加以证实。带有质粒ｐＧＥＸ－Ｒ９３（包含完全ＲＡＰｃＤＮＡ９５７碱基）的重组菌过度表达了分子量为６５×１０３融合蛋白，其含量占总蛋白的３９．４％。带有质粒ｐＧＥＸ－Ｒ３５（包含ＲＡＰｃＤＮＡ３２４碱基）表达了４０×１０３的融合蛋白，蛋白含量３２．２％。通过谷胱甘肽亲和层析柱，从细菌溶解物中纯化了融合蛋白，每升培养物能纯化到１０～２０ｍｇ的蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析证明抗Ｒ９３和抗Ｒ３５两种抗血清特异性结合到大鼠肾皮质微绒毛提取物中的４０×１０３的带。间接免疫荧光显示抗Ｒ９３和抗Ｒ３５两种抗体标记肾近曲小管刷状缘抗原。文中对表达的受体相关蛋白的意义和其抗原性进行了讨论。     

Heymann肾炎受体相关蛋白融合蛋白的实验研究

通过Heymann肾炎受体相关蛋白的研究 ,探讨Heymann肾炎的分子发病机制。运用基因重组技术 ,将编码受体相关蛋白羧基端 10 8个氨基酸多肽 (RAP3 2 4 )的cDNA克隆到大肠杆菌高效表达载体pGEX。通过异丙基硫代 β D半乳糖苷 (IPTG )诱导 ,表达了分子量为 44× 10 3 的融合蛋白。经GST Sepharose4B亲和层析柱 ,纯化了融合蛋白。表达产物经Westernblot分析。羧基端受体相关蛋白融合蛋白在pGEX中得到高效表达 ,其分子量为 44× 10 3 。每升培养液纯化到 2 0～ 30mg的融合蛋白。Westernblot分析表明抗RAP3 2 4 融合蛋白的抗血清识别天然肾小管刷状缘膜抗原FXIA中分子量约 44× 10 3 的带。间接免疫荧光显示该融合蛋白抗体结合于肾小管刷状缘。表明受体相关蛋白羧基端 10 8氨基酸多肽链上存在致肾炎的病理性表型。     

Heymann肾炎致病原受体相关蛋白cDNA分子克隆及其m…

Ｈｅｙｍａｎｎ肾炎是一种用于人类膜性肾病的自身免疫病模型。ｇｐ３３０糖蛋白和４４ｋｄ受体相关蛋白（ＲＡＰ）组成Ｈｅｙｍａｎｎ肾炎抗原复合物（ＨＮＡＣ），被证明是ＨＮ的主要致病原。本研究中，我们用ＲＴ－ＰＣＲ技术，克隆了ＲＡＰ基因，用Ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ技术克隆了ＲＡＰ羧基端１１８个氨基酸的基因，ＤＮＡ序列分析克隆基因与ＲＡＰ相同，原位杂交发现ＲＡＰ ｍＲＮＡ在肾小球上皮细胞表达。     

Heymann肾炎致病原受体相关蛋白cDNA分子克隆及其mRNA在肾小球上皮细胞的表达

Ｈｅｙｍａｎｎ肾炎是一种用于人类膜性肾病的自身免疫病模型。ｇｐ３３０糖蛋白和４４ｋＤ受体相关蛋白（ＲＡＰ组成Ｈｅｙｍａｎｎ肾炎抗原复合物（ＨＮＡＣ），被证明是ＨＮ的主要致病原。本研究中，我们用ＲＴ－ＰＣＲ技术，克隆了ＲＡＰ基因，用Ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ技术克隆了ＲＡＰ羧基端１１８个氨基酸的基因，ＤＮＡ序列分析克隆基因与ＲＡＰ相同，原位杂交发现ＲＡＰｍＲＮＡ在肾小球上皮细胞表达。     

表皮生长因子与假单胞菌外毒素融合蛋白在大肠杆菌中的表达研究

目的和方法：应用基因工程技术，将ＥＧＦｃＤＮＡ克隆到ｐＬＹ５／ＩＬ２－ＰＥ４０载体的ＥｃｏＲⅠ、ＳｍａⅠ位点之间ＩＬ２基因位置上，再将重组融合基因亚克隆到表达载体ｐＢＶ２２０的ＥｃｏＲⅠ、ＰｓｔⅠ位点上，以探索ＥＧＦ－ＰＥ４０融合基因在大肠杆菌ＤＨ５ａ中的进行表达及其生理功能。结果：ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ表明：ＥＧＦ－ＰＥ４０融合蛋白获得表达，并且具有ＥＧＦ和ＰＥ４０的免疫学活性。结论：这为进一步研究该融合的蛋白功能和肿瘤治疗打下基础     

Heymann肾炎受体相关蛋白羧基端融合蛋白的表达及其对nephrin表达和分布的影响

目的 探讨Heymann肾炎(HN)受体相关蛋白(RAP)羧基端抗原决定簇在HN发病机制中的作用.方法 通过PCR及分子克隆技术,构建RAP全长和羧基端多肽的原核融合表达载体,表达融合蛋白,制备针对RAP全长和羧基端融合蛋白的抗血清,免疫荧光法检测其在肾组织中的定位.利用该抗血清制备两种HN模型,测定24 h尿蛋白定量,免疫荧光法检测肾组织中nephrin表达和分布,并比较组间差异.结果 成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1-RAP1083/324,表达了RAP全长(相对分子质量,70×103)和羧基端(40×103)的融合蛋白,并制备了相应的抗血清,免疫荧光显示制备的两种抗血清均对肾小管上皮细胞有高亲和性.利用两种抗血清成功制备了HN模型,模型组大鼠24 h尿蛋白定量分别达(21.31±4.15)mg和(19.05±3.72)mg,与正常对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01).nephrin在RAP324诱发的大鼠HN肾组织中表达较RAP1083中减弱明显.结论 Heymann肾炎RAP羧基端存在病理性抗原决定簇,能够诱发大鼠HN模型.nephrin在两种HN中表达减少,推测RAP作用机制与减少肾小球内nephrin的表达有关.     

胰高血糖素衍生物在大肠杆菌的克隆表达和纯化

 目的 通过基因工程途径获得胰高血糖素衍生物。 方法 根据胰高血糖素基因及凝血酶酶切位点序列，分段合成引物行 PCR 扩增，以 PCR 扩增得到的胰高血糖素-甘氨酸基因序列和 pET-30a 质粒转化 E.coli DH5α，获得重组质粒 pET-G。将重组质粒 pET-G 转化至 E.coli BL21(DE3)，重组菌株命名为 E.coli BL21[pET-G]。以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，对表达产物进行SDS-Tricine- PAGE[十二烷基硫酸钠-三（羟甲基）甲基甘氨酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳]分析和蛋白质印迹分析。对表达产物行Ni2+-NTA亲和层析纯化、凝血酶酶切和高效液相色谱（HPLC）纯化后，行 SDS-Tricine-PAGE分析和飞行质谱分析，并以 ELISA 方法检测其免疫活性。 结果 PCR 扩增获得的条带与预期的DNA表达片段大小一致，重组质粒 pET-G 测序结果与预期完全一致。SDS- Tricine-PAGE 和蛋白质印迹分析显示 E.coli BL21（DE3）的表达产物相对分子质量与预期相符。经亲和层析纯化、凝血酶酶切和 HPLC 纯化后得到了完整的重组胰高血糖素-甘氨酸衍生物，SDS-Tricine-PAGE 分析显示其相对分子质量约为 3500，飞行质谱分析相对分子质量为 3531，二者基本一致。ELISA 检测表明重组胰高血糖素-甘氨酸衍生物具有胰高血糖素免疫活性。 结论 采用基因工程技术在大肠杆菌中成功表达了胰高血糖素-甘氨酸衍生物，为通过体外酰胺化途径研制酰胺化胰高血糖素奠定了基础。     

单链抗体与力达霉素融合蛋白在链霉菌中的表达

 目的 构建可表达力达霉素（LDM）辅基蛋白基因与抗 IV型胶原酶单链抗体（scFv）融合蛋白的重组菌株，获得既具有靶向性、又具有抗肿瘤活性的 scFV-LDM。方法 以大肠埃希菌-链霉菌穿梭质粒 pBS03 为基础构建同源双交换质粒 pBS-scFv，利用接合转移将该质粒转入球孢链霉菌（S. globisporus）C-1027，根据抗性差异筛选获得重组菌株。用 PCR、DNA 印迹法对重组菌株进行验证。用 SDS-PAGE 检测重组菌株中目的融合蛋白的表达。用抑菌圈试验检测重组菌株发酵液的抑菌活性。 结果 经同源重组得到重组菌株 S. globisporus C-1027- scFv。PCR 显示重组菌株扩增产物与预期一致，DNA 印迹分析显示重组菌株得到与预期吻合的杂交片段，表明 scFv-LDM 融合蛋白基因已经成功取代 LDM 辅基蛋白基因。SDS-PAGE 结果显示重组菌株不再产生辅基蛋白。抑菌圈试验显示重组菌株发酵液在第 5 天能够检测到抑菌活性。初步结果表明，重组菌株可产生 scFv-LDM 融合蛋白。 结论 成功构建了可产生 scFv-LDM 融合蛋白且具有分泌活性的重组菌株。这对改造和研发新型单抗导向药物有实际意义。     

乳腺癌特异性转导小肽融合表达载体的构建以及目的蛋白的表达

目的构建乳腺癌特异性转导小肽PI-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白的原核表达载体,并进行目的蛋白的表达、分离和纯化。方法合成PI的DNA序列,将其定向插入到p EGFPN2中,经双酶切获取PI-EGFP的核苷酸序列,再将其克隆入原核表达质粒pET-28a(+),构建出pET-28a(+)-PI-EGFP的原核表达载体;重组质粒转化BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导表达,利用His-tag对蛋白进行分离纯化,SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹免疫分析(Western blot)鉴定纯化蛋白质。结果成功构建了pET-28a(+)-PI-EGFP的原核表达载体;其经诱导后,在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白以可溶性形式存在;SDS-PAGE分析显示,在相对分子量约33kD的位置出现目的蛋白条带,与理论值相符;经His TALONTM Cartridge亲和层析纯化获得了高纯度的重组的PI-EGFP融合蛋白,Western blot鉴定结果显示获得了目的蛋白。结论成功构建出乳腺癌特异性转导小肽PI-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白原核表达载体,并能够表达出PI-EGFP的融合蛋白,为进一步研究小肽的乳腺癌特异性转导功能奠定基础。     

自身抗原PDC-E2融合蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫学鉴定

目的：用基因工程的方法克隆表达丙酮酸脱氢酶复合体E2（PDC-E2）融合蛋白,以用于人原发性胆汁性肝硬化（PBC）的早期发现和临床诊断.方法：针对PDC-E2的cDNA序列设计引物,从正常人的淋巴细胞中提取RNA,通过反转录PCR方法扩增得到相应的基因片段,经测定序列验证后插入表达载体pET28a（＋）,构建重组表达载体pET28a（＋）-PDC-E2,转化大肠杆菌BL21（DE3）后诱导表达蛋白质.表达蛋白经SDS-PAGE、Western blot鉴定.结果：经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了PDC-E2重组质粒.IPTG诱导表达后,获得PDC-E2融合蛋白.经免疫学鉴定,重组抗原片段具有抗线粒体抗体二亚型（AMA-M2）的免疫原性.结论：获得PBC特异性靶抗原的多肽片段,为PBC的早期发现和临床诊断提供有力工具.     

胶原沉积抑制因子在大肠杆菌DH5α中的表达特性

目的： 研究人胶原沉积抑制因子（decorin）在大肠杆菌DH5α中的表达特性。方法： 用SDS-PAGE法检测pGEX-4T-1-decorin融合克隆在大肠杆菌DH5α中表达，选择阳性表达克隆；测定1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）最佳诱导时间；用超声波裂解法分析GST-decorin融合蛋白的可溶性。用Western blotting进行定性分析。结果： 用1mmol/L IPTG诱导时，融合蛋白可在大肠杆菌DH5α中表达；最佳诱导时间为4h；大部分融合蛋白以包涵体的形式存在；所表达蛋白为GST融合蛋白。结论： GST-decorin融合蛋白可在大肠杆菌DH5α中大量表达，但以包涵体的形式存在。     

单克隆抗体c3～6诱导被动型Heymann肾炎病理机制

目的和方法：Ｈｅｙｍａｎｎ肾炎（ＨＮ）是一种用于研究人类膜性肾病的大鼠动物模型。用主动型ＨＮ模型大鼠的淋巴细胞与小鼠ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，制备针对ＨＮ致病原的单克隆抗体ｃ３～６（ＭｃＡｂｃ３～６），并用它诱导大鼠被动型ＨＮ。结果：免疫酶组织化学及免疫电镜显示，ＭｃＡｂｃ３～６特异性识别肾小球上皮足突细胞膜抗原并与其结合形成免疫复合物。     

人精子蛋白SP17基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:获得人精子蛋白SP17基因(hSP17),构建重组表达载体并在大肠杆菌中表达。方法:获取人睾丸组织,提取总RNA,通过RT-PCR获得hSP17的全长cDNA;将该cDNA克隆入TA载体,并亚克隆进融合蛋白型重组表达载体pGEX-3b;转化大肠杆菌DH5α并诱导表达之。结果:获得了全长hSP17的cDNA,构建了重组表达子hSP17/pGEX-3b,获得了预期大小的融合蛋白hSP17-GST的表达。结论:通过构建重组表达质粒hSP17/pGEX并转化大肠杆菌,获得了融合蛋白hSP17-GST的高效表达。     

组氨酸标签人β干扰素在E.coli BL21(DE3)中的表达、纯化和活性测定

目的 在大肠杆菌中高效表达组氨酸标签与人β干扰素融合蛋白,并进行蛋白纯化和生物活性测定.方法 提取人Bel-7402细胞总DNA为模板,经PCR获得人β干扰素编码基因片段.将此基因插入表达载体pET-16b,重组克隆,经酶切与测序确认后转化至大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达和条件优化.表达产物经West...     

人ureb1在大肠杆菌中高效表达及其抗体的制备

目的：构建人的ureb1(hureb1）原核高效表达重组质粒,以此表达的外源蛋白为抗原制备抗urb1的抗体。方法：用XhoI/NotI从pGU-2质粒酶切得到hureb1的ORF与pGEX-4T-2的XhoI/NotI大片段连接,构建表达GST-hureb1融合蛋白的重组载体。转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,以粗制的GST-hureb1融合蛋白免疫大白兔和小鼠,制备抗hureb1的多克隆抗体和单克隆抗体,采用WesternBlot进行特异性鉴定。结果：构建了高效表达GST-hureb1融合蛋白的原核表达载体。融合蛋白的表达量占菌体蛋白质总量的33.45%。以大肠杆菌表达的GST-hureb1融合蛋白免疫动物制备了高滴度、高特异性的抗hureb1的抗体。结论：利用重组GST-hueb1融合蛋白免疫动物可获得高滴度的抗hureb1抗体。重组GST-hureb1融合蛋白和抗hureb1的抗体可用于hureb1的生物学功能研究。     

神经营养肽NP14基因的合成及其在大肠杆菌中的高表达

目的：根据鞘脂激活蛋白原神经营养序列设计并构建短肽（neurotrophic peptide,NP）多拷贝串连表达载体，利用基因工程的方法制备短肽NP。方法： 根据大肠杆菌的偏爱密码子设计并合成NP的碱基片段，通过PCR方法合成串联双拷贝2NP片段，经平端连接克隆到载体pUC18中。利用EcoT14I酶切pUC18－2NP后可产生非镜相对称黏性末端,与表达载体pETEcoT一次连接反应，得到一系列含有不同片段拷贝数的表达载体pETEcoT－multiNP，经PCR－array方法进行阳性克隆筛选、测序鉴定后转化入大肠杆菌BL21（DE3）进行原核表达。结果： 经IPTG诱导后，在BL21(DE3)菌中高效表达了2、4、8拷贝融合蛋白，并在每个单拷贝之间加入了溴化氢的切割位点，使融合蛋白切割后能够得到单拷贝的短肽。结论： 短肽NP在大肠杆菌中获得高效表达，为进一步研究其生物活性奠定了基础。     

人免疫缺陷病毒1(HIV-1)膜蛋白基因片段在酵母中的克隆表达

目的为获得足够量的膜糖蛋白,以便于对不同ＨＩＶ分离株膜糖蛋白的结构与功能进行进一步的研究。方法从人免疫缺陷病毒１（ＨＩＶ－１）ＨＸＢ２分离株原病毒基因组的重组质粒ｐＨＸＢ２中克隆了两段膜糖蛋白基因（ＥＮＶ）片段。以酵母穿梭诱导表达质粒ｐＹＥＳ２为载体,构建了两个相应的重组表达质粒ｐＹＥＮＶ１和ｐＹＥＮＶ２;进一步利用大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因（β－ｌａｃＺ）构建了ＨＩＶ－１膜外糖蛋白ＤＮＡ片段与β－ｌａｃＺ基因的融合表达质粒。将此３种质粒分别转化单细胞真核生物酿酒酵母ＢＪ１９９１,得到的转化子经半乳糖诱导表达后进行菌体全蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。结果克隆的基因片段在酿酒酵母中产生了分子质量为５０×１０３的特异性诱导蛋白;对含此融合表达质粒的酵母转化子半乳糖诱导后表达产物的免疫检测表明,与对照菌株相比,融合表达产物具有和ＨＩＶ－１阳性血清抗体反应的抗原性。结论可通过β－半乳糖苷酶活性的测定直接指示抗原片段的表达;为表达的膜糖蛋白片段的进一步分离纯化打下了一定基础     

登革病毒1～4型E蛋白结构域Ⅲ融合蛋白的表达纯化及功能研究

目的 了解原核表达的登革病毒（Dengue virus,DV）1～4型融合的E蛋白结构域Ⅲ直接抑制登革病毒感染及其抗体的中和作用.方法 通过连接肽将1～4型登革病毒包膜蛋白Ⅲ区串联的基因产物插入PET30a在大肠埃希菌中进行表达、纯化后,应用Western Blot及间接ELISA验证表达产物.将融合蛋白免疫新西兰大白兔制备免疫血清,应用间接免疫荧光检测多抗血清的活性.将融合蛋白及多抗血清分别进行阻断实验和中和实验,对抗原及抗体的功能进行研究.结果 在大肠埃希菌中成功表达了串联的登革病毒1～4型E蛋白结构域Ⅲ融合蛋白,并得到兔抗免疫血清,分别对融合蛋白及兔抗免疫血清进行验证.融合蛋白能够阻断1～4型DV感染,兔抗免疫血清能中和1～4型DV,但中和抗体效价不同.结论 串联表达的登革病毒包膜蛋白Ⅲ区可抑制登革病毒感染,串联rEⅢ蛋白免疫新西兰大白兔产生的针对DV1～4型包膜蛋白结构域Ⅲ区的抗体对登革病毒具有中和作用.     

甘氨酸和 Triton X-100 对 ZZ-EGFP 融合蛋白分泌表达影响的初步研究

 目的 考察不同浓度的甘氨酸和 Triton X-100 对葡萄球菌蛋白质 A ZZ 亲和肽-增强型绿色荧光蛋白（ZZ-EGFP）融合蛋白在大肠杆菌分泌表达的影响。 方法 研究设计为两因素三水平析因设计。向液体培养基中分别加入终浓度 0、1%、2% 的甘氨酸和 0、1%、2% 的 Triton X-100（共 9 种组合方式，终浓度均为 0 者为对照组），诱导大肠杆菌周质腔内 ZZ-EGFP 融合蛋白泄漏到液体培养基中，以培养上清液荧光强度为观察指标，通过 ZZ- EGFP 融合蛋白浓度-荧光强度标准曲线快速检测培养基中 ZZ-EGFP 融合蛋白表达量。 结果 培养基中分别加入 1%、2% 甘氨酸或 1%、2% Triton X-100 培养后，培养上清液荧光强度分别为 283 ± 11、711 ± 19 和 622 ± 25、733 ± 25，与对照组（74 ± 5）比较，组间差异均有统计学意义（甘氨酸：F = 10.881，P = 0.024；Triton X-10：F = 12.848，P = 0.018）；而且甘氨酸与 Triton X-100两者之间有交互效应（F = 5.441，P = 0.005），其中培养基中同时含有终浓度 2% 甘氨酸及 1% Triton X-100 时培养上清液荧光强度最高（1854 ± 45），ZZ-EGFP 融合蛋白分泌表达量达到 10.4 mg/L，与对照组（0.94 mg/L）相比提高了 11 倍。 结论 甘氨酸和 Triton X-100 能提高 ZZ-EGFP 融合蛋白在液体培养基中的分泌表达量。