LHR真核表达载体构建及表达

目的构建黄体生成素受体（LHR）真核表达质粒载体和建立稳定高表达LHR的乳腺癌细胞株。方法KpnI／Hpa工双酶切LHR-cDNA质粒载体获得目的基因,定向克隆构建pcDNA3．1（4-）真核表达载体,酶切图谱和序列分析鉴定;重组质粒载体经脂质体转染MCF-7乳腺癌细胞,G418筛选,RT-PCR、细胞内cAMP测定,筛选鉴定高表达LHRMCF-7细胞。结果重组质粒pcDNA3．1（4-）-LHR酶切图谱分析结果、序列分析证明pcDNA3．1（4-）-LHR载体中LHR序列与GenBank的LHR基因序列完全相符。RT-PCR检测MCF-7细胞LHRmRNA,MCF-7细胞内cAMP浓度测定,证实MCF-7细胞高表达LHR。结论构建并转染pcDNA3．1（4-）-LHR真核表达载体,在MCF-7细胞中稳定表达,为探讨hCG对乳腺癌细胞的作用提供实验基础。     

携EGFP的人低氧诱导因子-1α真核表达载体的构建及表达

目的 构建携EGFP的人低氧诱导因子（HIF-1α）真核表达载体，为研究人HIF-1α基因对冠心病的血管新生作用奠定基础。方法 采用分子克隆技术，KpnⅠ、XbaⅠ双酶切pcDNA3．1／V5-Hin—HIF-1仅获得HIF-1仅cDNA，克隆到质粒pcDNA3．1（＋），得到质粒pcDNA3．1（＋）-HIF-1α，以KpnⅠ，ApaⅠ双酶切质粒pcDNA3．1（＋）-HIF-1仅获得HIF-1α cDNA，克隆到质粒pEGFP—c1得到pEGFP-HIF-1α-c1质粒。脂质体法转染HEK293细胞，用荧光显微镜和Western blotting检测EGFP和HIF-1α 在HEK293细胞的表达。均显示融合蛋白在细胞中表达。结果经酶切鉴定及PCR证实重组pEGFP-HIF-1α-c1质粒构建成功。荧光显微镜和Westom blotting显示EGFP和HIF-1α融合蛋白在HEK293细胞中表达。结论 成功构建重组真核表达载体pEGFP—HIF-1α—c1并在HEK293细胞表达，为冠心病的HIF-1基因治疗研究奠定更直观的基础。     

优化密码沙眼衣原体主要外膜蛋白基因的设计合成与表达

目的：设计合成优化密码沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP）基因，克隆构建优化密码MOMP(HuMOMP)基因的真核表达质粒及EGFP—HuMOMP融合基因表达质粒。方法：利用软件分析比较鼠肺炎沙眼衣原体(MoPn)与人类等哺乳动物基因组密码子使用的差异，根据所得数据对MOMP基因进行优化设计与合成。双酶切pUC—HuMOMP质粒，游离HuMOMP片段，定向克隆入pcDNA3的相应位点，构建重组真核表达质粒pcDNA3-HuMOMP；双酶切游离pcDNA3-HuMOMP中的HuMOMP片段，定向克隆入pEGFP—Cl的相应位点，构建重组真核表达质粒pEGFP—HuMOMP；pEGFP-HuMOMP质粒体外脂质体转染COS—1细胞，24h后观察荧光蛋白的表达。结果：合成的HuMOMP基因全长1125bp，经DNA测序无误。酶切鉴定pcDNA3-HuMOMP及pEGFP—HuMOMP质粒获得预期分子量DNA片段：EGFP—HuMOMP融合基因在COS—1细胞中获得明显表达，表达产物定位于胞浆。结论：设计合成的优化密码HuMOMP基因能够在哺乳动物细胞中成功表达。     

以HBc颗粒为呈现载体的真核表达载体pcDNA3．1-HBc^Hhel的构建

目的构建含乙肝核心C基因的真核表达载体pcDNA3．1-HBc^Hhel探索其作为DNA疫苗载体的可能性。方法采用分子克隆技术在原核表达质粒pTrc—core的HBcAg el—loop处添加Nhel酶切位点，双酶切此重组载体pTrc-core^Nhel及真核表达载体pcDNA3．1，产物经纯化、T4DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选抗Amp^＋克隆并提取质粒进行酶切及PCR鉴定。结果成功构建了真核表达质粒pcDNA3．1-HBc^Hhel。结论该重组质粒可作为治疗性及预防性疫苗的候选载体，为深入研究预防性及治疗性疫苗奠定了基础。     

乙肝病毒X基因真核表达载体pEGFP-X的构建及其表达

目的：构建pEGFP—X真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达。方法：从质粒pcDNA3．1（＋）-X酶切获HBVX基因片段,克隆至pEGFP—N1;用酶切、PCR和测序鉴定pEGFP—X载体;用脂质体法,将重组载体（pEGFP—X）和空载体（pEGFP-N1）瞬时转染肝癌细胞细胞株BEL-7402;分别用RT—PCR、荧光显微镜鉴定HBVX和EGFP基因表达。结果：鉴定证实pEGFP-X载体构建成功;该质粒瞬时转染的BEL-7402有HBVX基因表达,并发绿色荧光。结论：构建的pEGFP—X真核载体能在BEL-7402中表达,绿色荧光蛋白示踪利于表达HBVX基因稳定细胞株的筛选,并为探讨HBVX基因在HCC中的致瘤机理提供实验模型奠定基础。     

真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建

目的：构建含MAGE—1基因的重组真核表达质粒。方法：用RT—PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列，克隆至pGEM—T载体，测序证实基因碱基序列无误后，再克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )，构建了pcDNA3.1—MAGE—1重组质粒。结果与结论：RT—PCR获得长度为927bp的阳性产物，经T载体和pcDNA3.1( )真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后。证实真核表达质粒pcDNA3．1—MAGE—1构建成功。     

人血管内皮生长因子C基因真核表达载体的构建

目的：构建人血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)基因的真核表达载体，以便进一步研究VEGF-C基因在淋巴管生成中的作用。方法：根据人VEGF-C的cDNA序列，设计合成一对5′端分别含有EcoR I和BamH I酶切位点的特异性引物，运用RT-PCR方法克隆人乳腺癌细胞MDA-MB-231中的VEGF-C cDNA(1．26Kb；回收PCR产物(1．28Kb），并将其连接至克隆载体pMDl8-T中；重组的pMDl8-T在大肠杆菌DH5α内扩增后，经质粒提取、EcoR I和BamH I酶切，筛选出阳性重组子，并进行基因测序鉴定；琼脂糖凝胶电泳回收含有VEGF-C cDNA全长的酶切片断(1．27Kb)，然后在DNA连接酶作用下将其与真核表达载体pcDNA3．1(-)连接，重组质粒经EcoR I和BamH I酶切予以鉴定。结果：RT-PCR产物合有VEGF-C cDNA，基因测序显示重组的pMDl8-T中含有正确的人VEGF-C cDNA全长序列，重组的pcDNA3．1（-)中含有人VEGF-C cDNA全长序列。结论：成功构建了人类VEGF-C真核表达载体VEGF-C／pcDNA3．1（-)。     

重组人白介素27真核表达载体的构建

目的克隆人IL-27基因,构建其真核表达载体。方法从人外周血单核细胞诱导而成的树突状细胞中提取总RNA,采用RT-PCR克隆人IL-27亚基EBI3和p28基因,Xho I和EcoR I双酶切后插入真核表达质粒pcDNA3.1（-）,构建人IL-27真核表达载体pcDNA3.1-EBI3和pcDNA3.1-p28。结果双酶切及测序结果表明构建载体中的EBI3与p28序列与文献报道一致。结论重组人IL-27真核表达载体的构建成功,为表达出有活性的重组人IL-27奠定了基础。     

MAGE-1基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建MAGE-1基因重组真核表达质粒并在细胞系NIH-3T3中高效表达。方法用RT-PCR方法从人肝细胞肝癌（HCC）组织全RNA中扩增出MAGE-1基因cDNA序列,克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）,构建pcDNA3．1-MAGE-1重组质粒．重组质耗用脂质体转染NIH-3T3细胞,经RT-PCR和Western-blot鉴定转化细胞中MAGE-1的表达。结果RT-PCR获得长度为927bp的MAGE-1基因,经T载体和pcDNA3．1（＋）真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实重组质粒构建正确,并存转化细胞中检测到了MAGE-1的表达。结论 真核表达质粒pcDNA3．1-MAGE-1构建成功,并建立了稳定表达人MAGE-1的NIH-3T3细胞株。     

人乳头瘤病毒16型E5蛋白真核载体的构建及表达

目的构建人乳头瘤病毒115型（HPV16）E5蛋白真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5,分析E5在HeLa细胞及BALB／c小鼠肌肉组织中的表达。方法设计HPV16E5基因引物,PCR扩增E5基因。经Bam-HI、EcoR1酶切后将其连接入pcDNA3．1（＋）,PCR及双酶切筛选阳性克隆并测序。将构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5转染HeLa细胞,利用RT—PCR测定HPV16E5mRNA表达。将6只BALB／c小鼠分为3组,分别取100mgpcDNA3．1（＋）／HPV16E5、100mgpcDNA3．1（＋）、100mLPBS经肌肉注射小鼠,2周1次,共4次;末次接种后第14天取小鼠股四头肌制成石蜡切片,免疫组织化学法检测E5蛋白在小鼠肌肉组织中的表达。结果PCR扩增得到252bpHPV16E5基因片段,DNA测序结果显示E5基因片段正确地连入pcDNA3．1（＋）。构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5在HeLa细胞表达大小为252bp的HPV16E5mRNA。小鼠股四头肌细胞膜被染成棕黄色。结论构建的真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5能在HeLa细胞及小鼠肌肉组织中表达HPV16E5蛋白。     

结核分枝杆菌PPE68基因真核表达载体的构建、表达和鉴定

目的：建立结核分枝杆菌PPE68蛋白基因重组质粒的真核表达载体,为以后对PPE重组蛋白的免疫原性分析奠定基础。方法：提取结核分枝杆菌总DNA,PCR法扩增出PPE68编码基因,通过线性T克隆载体pGEM—T连接,亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）后,转染至I-IeLa细胞中表达,Westernblot鉴定表达产物。结果：PCR产物、pGEM-T—PPE68及pcDNA3．1（＋）一PPE68分别经双酶切后均获得同一大小基因片段,表达产物经Westernblot鉴定相对分子质量约为40000。结论：成功构建了结核分枝杆菌PPE68基因真核表达载体,并获得了表达产物。     

pcDNA3.1(+)gpc-5真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建pcDNA3.1（＋）磷脂酞肌醇蛋白5（gpc-5）基因真核表达载体。方法：根据gpc-5基因序列设计一对引物,利用RT-PCR法扩增出gpc-5基因的编码区（CDS）,连接在PGM-T载体上,并进行pcDNA3.1（＋）gpc-5真核表达载体的构建、酶切鉴定以及测序。结果：gpc-5基因的体外扩增目的片段为2 083 bp。所构建的重组体pcDNA3.1（＋）gpc-5经双酶切鉴定,与预期片段大小一致,测序结果与NCB I收录gpc-5基因的CDS序列一致。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）gpc-5,为研究gpc-5基因在原发性肺癌的发生发展中的作用奠定了基础。     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白真核载体的构建与表达

目的构建人乳头瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白真核载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E2基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,双酶切及测序鉴定。将质粒pcDNA3.1（＋）与pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2分别转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E2基因在HeLa细胞中的表达。结果 HPV16 E2基因片段插入到pcDNA3.1（＋）相同酶切位点,即构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2;转染pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2的细胞,检测到HPV16 E2 mRNA。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2能在HeLa细胞内有效表达。     

Granulysin真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建颗粒溶解素(granulysin)cDNA真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)中扩增出颗粒溶解素蛋白cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的相应酶切位点,将此重组质粒进行序列测定,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。结果:重组质粒插入基因序列测定证实为颗粒溶解素cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。结论:成功构建颗粒溶解素真核表达载体,为进一步研究其抗结核作用奠定了基础。     

肺炎衣原体0308基因真核表达载体构建及表达检测

目的构建肺炎衣原体AR39株Cpn0308基因真核表达重组质粒,体外转染HeLa细胞并检测表达情况,为Cpn核酸疫苗的研制做准备。方法应用PCR技术从CpnAR39株基因组中扩增Cpn0308全长基因,重组入pcDNA3.1/HisA真核表达载体相应位点,进行酶切鉴定和序列分析后,运用脂质体介导重组质粒转染HeLa细胞,间接免疫荧光技术检测目的蛋白在真核细胞中表达情况。结果 PCR扩增得到393bp的特异性Cpn0308基因,筛选鉴定出pcDNA3.1/HisA-Cpn0308真核表达重组体,序列测定证实与GeneBank登录的CpnAR39株Cpn0308基因一致;间接免疫荧光法检测到重组质粒转染的HeLa细胞能够表达目的蛋白。结论成功构建pcDNA3.1/HisA-Cpn0308真核表达重组体,且该重组体能够在体外真核细胞中表达目的蛋白,为进一步研究CpnDNA疫苗以及研究该蛋白的生物学功能提供实验基础。     

携带FLAG标签的人BTG2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达 

目的：构建人B细胞易位基因2（BTG2）真核表达载体,并在HeLa细胞中表达携带FLAG标签的BTG2蛋白,为阐明BTG2基因的功能提供实验工具。方法：利用PCR法获得全长BTG2片段,将扩增得到的片段插入真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点;然后按照FLAG序列设计并合成寡核苷酸片段,插入pcDNA3.1(+)-BTG2载体,构建pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2载体;将以上重组质粒转染HeLa细胞,将细胞分为转染pcDNA3.1(+)空载体组、转染pcDNA3.1(+)-BTG2组和转染pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2组,采用抗FLAG抗体的Western blotting法,检测FLAG-BTG2融合蛋白在HeLa细胞中的表达水平。结果：将全长BTG2片段链接于pcDNA3.1(+)质粒,经限制性核酸内切酶BamH Ⅰ酶切分析及DNA测序证实载体序列准确;该载体转染HeLa细胞后用抗FLAG 抗体进行Western blotting法检测,在空载体组和pcDNA3.1(+)-BTG2组HeLa细胞中检测不到FLAG融合蛋白的表达,而在转染pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2组中检测到FLAG-BTG2融合蛋白的表达。结论：成功构建了pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2真核表达载体,并能在HeLa细胞中有效表达携带FLAG标签的BTG2蛋白。     

重组人半乳糖苷结合凝集素-9质粒的构建及表达

目的构建人半乳糖苷结合凝集素-9(Galectin-9)的真核表达质粒pGalectin-9,并检测其表达。方法通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆Galectin-9基因,插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pGalectin-9瞬时转染中国仓鼠卵巢(Chinesehamster ovary,CHO)细胞,通过Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光方法检测Galectin-9的表达。结果 DNA测序和酶切鉴定证明Galectin-9基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点;以重组质粒pGalectin-9瞬时转染CHO细胞,通过Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光方法,在分子和细胞水平证实Galectin-9的表达。结论成功构建pGa-lectin-9的重组质粒,并证实其在CHO细胞中可以成功表达。     

登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列pcDNA3.1载体的构建

目的：克隆登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,构建NS1基因部分序列的真核表达载体。方法：用PCR技术扩增登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,并定向克隆入pcDNA3.1（＋）的kpnⅠ、xhoⅠ位点,构建真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1,转化EcoliDH5a。阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。电穿孔法将真核重组载体转染COS-7细胞,RT-PCR鉴定其表达情况。结果：阳性质粒经kpnⅠ及xhoⅠ双酶切及PCR获得了1个核苷酸长度为413 bp的基因,序列测定证实与NGC株NS1基因部分基因序列有99%同源,重组真核质粒转染COS-7细胞经RT-PCR鉴定证实有表达。结论：成功构建了含有登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列基因的真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1。     

人巨细胞病毒IE1-GFP融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建增强型绿色荧光蛋白(GFP)与人巨细胞病毒(HCMV)IE1融合蛋白真核细胞表达载体,为IE1基因的表达和功能研究提供基础.方法 将质粒pNEB193-IE1和载体pEGFP-C1分别进行双酶切获得目的基因IE1片段和空载体,回收纯化后用T4连接酶将两者连接并转化E.coli JM109,用salⅠ、BamHⅠ双酶切后琼脂糖电泳鉴定阳性克隆.结果 双酶切pEGFP-C1-IE1后,琼脂糖电泳可见到大小约1476 bp的片段,与IE1预期片段大小一致,即IE1亚克隆入pEGFP-C1.结论 成功地构建了HCMV IE1-GFP融合蛋白真核表达载体pEGFP-C1-IE1.