FoxM1 shRNA慢病毒载体构建及感染人前列腺癌细胞的稳定细胞株筛选

目的构建携带绿色荧光蛋白（GFP）的人FoxM1 shRNA重组慢病毒载体,并构建筛选FoxM1敲低的人前列腺癌稳定细胞
株,检测FoxM1的表达及对细胞增殖能力的影响。方法设计并合成3对特异性针对人FoxM1基因的shRNA靶序列,构建到
pHBLV-U6-ZsGreen-Puro 慢病毒载体中,测序鉴定载体构建情况,利用慢病毒三质粒系统转染包装293T细胞,荧光显微镜下观
察转染效率。收集到的病毒上清转染人前列腺癌DU-145细胞,Real-time PCR检测各组细胞FoxM1 mRNA水平,经嘌呤霉素
筛选建立FoxM1敲低稳定细胞株,用Western blotting法检测细胞中FoxM1表达,并用MTT法观察稳转细胞的生长增殖活性,
流式细胞术观察稳转细胞凋亡情况,平板克隆实验观察稳转细胞的克隆形成能力。结果经测序鉴定成功构建了3对FoxM1
shRNA慢病毒载体,并进行包装,感染DU-145细胞后Real-time PCR检测结果表明第1对慢病毒载体干扰效率最佳,嘌呤霉素
抗性筛选建立了FoxM1敲低稳定细胞株,荧光显微镜观察感染效率较高,Western blotting结果显示细胞中FoxM1蛋白表达明
显受到抑制,细胞的生长增殖能力明显受限,流式细胞术结果显示FoxM1敲低组细胞凋亡率高于对照组,平板克隆实验结果表
明FoxM1敲低组细胞克隆形成能力下降。结论本研究成功构建了FoxM1 shRNA慢病毒载体,建立了FoxM1敲低稳定前列腺
癌细胞株,抑制细胞内FoxM1的表达能够抑制前列腺癌细胞DU-145的生长增殖、克隆形成能力,并能诱导细胞凋亡。
     

S100P基因慢病毒表达载体的构建及对结肠癌Caco-2细胞的影响

目的:通过构建S100P慢病毒表达载体,研究其对结肠癌Caco-2细胞的影响.方法:以DLD-1细胞cDNA为模版,PCR扩增S100P基因序列,然后将该序列克隆插入慢病毒载体中,构建S100P慢病毒表达载体,包装产生慢病毒颗粒.将慢病毒颗粒感染Caco-2细胞,荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白表达;应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹(Western blot)技术检测S100P的表达情况;MTT法检测细胞生长变化;细胞平板克隆培养检测其细胞克隆形成能力.结果:构建的慢病毒表达载体Lenti-S100P经酶切和测序鉴定结果正确;携带S100P基因的慢病毒颗粒感染Caco-2后,细胞中S100P基因和蛋白过表达,促进细胞克隆形成能力.结论:本研究成功构建S100P慢病毒表达载体,为深入研究S100P基因的相关功能提供了一定的实验基础.     

IGF1R-shRNA重组慢病毒的构建及对肺癌A549细胞增殖的影响

目的 构建IGF1R基因的shRNA慢病毒载体,转染A549细胞鉴定沉默效率,观察其对A549细胞增殖能力的影响.方法 设计IGF1R干扰序列,与pGC-LV慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,包装shRNA慢病毒颗粒,感染A549细胞,应用RT-PCR和Western blot检测IGF1R干扰效果;细胞生长抑制实验、克隆形成实验及细胞周期检测评价其对A549细胞增殖的影响. 结果 成功构建了IGF1R-shRNA重组慢病毒并高效感染A549细胞,IGF1R mRNA及蛋白表达量分别下降74.51％,70.53％;细胞群体倍增时间显著延长,克隆形成能力显著降低,细胞周期阻滞于G0/G1期. 结论 本研究构建的重组慢病毒能显著抑制IGF1R表达,抑制A549细胞增殖.     

ALR基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建及其在肝癌细胞中对ALR表达的抑制

目的：构建肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration,ALR）基因RNA干扰（RNA interference,RNAi）慢病毒载体,并检测其对人肝癌细胞株HepG2和QGY中ALR基因表达的干扰效率。方法：针对ALR基因RNAi的有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ双酶切线性化的GV118慢病毒载体连接产生LV-ALR-shRNA重组慢病毒载体,经转化感受态细胞后筛选出阳性克隆,并进行测序鉴定。用293T细胞包装产生慢病毒,逐孔稀释法测定病毒滴度。再将包装浓缩后的慢病毒转染人肝癌细胞株HepG2和QGY,应用Real-time PCR和Western blot方法检测HepG2和QGY细胞中ALR基因mRNA和蛋白的表达情况。结果：酶切鉴定证实成功构建了针对人ALR基因的RNAi慢病毒载体,包装并浓缩慢病毒,病毒滴度为 8E+8TU/ml。将病毒感染人肝癌细胞株HepG2和QGY后,2种细胞的干扰组ALR的mRNA表达水平较阴性对照组及空白对照组均明显下降（HepG2细胞,P干扰组vs. 阴性病毒对照组=0.004,P干扰组vs. 空白对照组=0.001;QGY细胞,P干扰组vs. 阴性病毒对照组=0.005,P干扰组vs. 空白对照组=0.001）,同样,干扰组ALR在蛋白水平的表达也明显减降低。结论：成功构建ALR基因RNAi慢病毒载体,该载体能有效干扰人肝癌细胞株HepG2和QGY中ALR基因的表达。     

BAD慢病毒载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的探讨促凋亡基因BAD(Bcl-2-associated death protein)重组慢病毒表达载体构建及其对肺癌A549细胞株增殖的影响。方法应用PCR法从含有目的基因的质粒pAV-MCMV-BAD-GFP中扩增BAD基因片段,克隆至慢病毒载体(pLVX-IRES-ZsGreen 1),应用PCR、酶切和测序鉴定正确后,经病毒包装,感染A549细胞,经流式细胞仪筛选稳定表达细胞株,Western blot鉴定重组慢病毒感染的A549细胞BAD的表达。采用CCK-8试剂盒定点检测细胞的光密度(OD)值,分析BAD蛋白过表达对A549细胞增殖能力的影响。结果酶切鉴定和基因测序证实长度为507bp的BAD基因成功克隆至慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1;重组慢病毒通过感染A549细胞株和流式细胞仪筛选出单克隆细胞株BAD-A549,Western blot检测结果显示,细胞培养BADA549细胞可稳定过表达BAD蛋白。体外增殖结果显示,细胞培养120~144h,BAD组的OD值均较对照组低(P<0.05)。结论成功构建了BAD重组慢病毒载体,获得稳定表达BAD的A549细胞株。BAD过表达能有效抑制A549细胞的增殖速度。     

Effect of shRNA interference targeting myeloid leukemia-1 gene on proliferation in lymphoma cell line

目的 研究慢病毒介导的髓细胞白血病基因(Mcl-1)短发夹状RNA(shRNA)干扰对淋巴瘤细胞系SNK-6增殖和凋亡的影响.方法 设计以Mcl-1为靶点的shRNA并构建携带此shRNA的慢病毒载体,转染淋巴瘤细胞系SNK-6,荧光定量PCR(qPCR)及Western blot方法检测病毒感染前后Mcl-1 mRNA及蛋白表达变化,四甲基偶氮唑盐法(MTT法)和流式细胞仪分析细胞增殖和凋亡变化的情况.结果 成功构建Mcl-1-shRNA慢病毒表达载体,并可有效感染淋巴瘤细胞株SNK-6,感染后SNK-6细胞Mel-1基因的mRNA水平及蛋白水平表达明显下调,MTT法检测显示慢病毒介导的Mcl-1基因shRNA干扰与对照病毒组相比可明显抑制SNK-6细胞增殖[(31.6±3.3)％vs(5.8±2.7)％,P＜0.01],流式细胞仪测定感染后细胞凋亡明显高于对照病毒组[(28.9±2.1)％vs(5.3±1.5)％,P＜0.01].结论 慢病毒介导的Mcl-1基因shRNA干扰技术可特异性阻断SNK-6细胞Mel-1基因的表达,抑制细胞的增殖并促进细胞的凋亡.     

人CDH22基因RNAi慢病毒载体的构建及稳定干扰CDH22基因的表达

目的 构建人CDH22基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默大肠癌细胞的CDH22基因表达,为研究CDH22在大肠癌转移中参与的信号转导机制提供研究基础.方法 利用在线软件设计人CDH22基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核酸后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端,测序.得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组,获得真核表达慢病毒干扰载体.在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助质粒和CDH22基因重组慢病毒载体导入293FT细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染大肠癌细胞SW480,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰CDH22基因的细胞亚系.结果 成功构建CDH22真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒滴度为8×105U/ml.荧光定量PCR结果表明,所获得的细胞克隆11中CDH22 mRNA水平的表达显著降低.结论 成功构建出CDH22基因慢病毒RNAi表达载体,并获得CDH22基因稳定干扰的大肠癌细胞亚系,为研究CDH22在大肠癌转移中的作用机制提供了研究基础.     

p53基因真核表达质粒PLJM1-p53-GFP构建及其应用

目的:构建小鼠p53基因真核表达质粒PLJM1-p53-GFP,研究其对前列腺癌细胞株PC3侵袭?增殖能力的影响?方法:从小鼠3T3-L1细胞提取总RNA,经RT-PCR获得cDNA,扩增p53 基因,经酶切纯化后的产物与双酶切后的PLJM1-NRG1-GFP慢病毒载体连接,得到PLJM1-p53-GFP慢病毒载体并转化感受态细菌DH5α,通过PCR筛选阳性克隆,抽提质粒并测序鉴定?将PLJM1-p53-GFP质粒瞬时转染到PC3细胞中,提取RNA,定量PCR鉴定p53高表达水平,采用细胞侵袭实验观察高表达p53的前列腺癌细胞株PC3的侵袭能力,采用流式细胞及划痕试验研究p53对前列腺癌细胞株PC3增殖活性的影响?结果:测序证实,目的基因p53插入完全正确且无任何突变;高表达p53的PC3细胞的侵袭能力?增殖能力明显下降?结论:成功构建小鼠p53基因真核表达质粒PLJM1-p53-GFP,为深入研究肿瘤等相关疾病提供了有效的工具?     

双特异性磷酸酶-1过表达对肾癌细胞株A498增殖和侵袭的影响

目的：构建携带人双特异性磷酸酶-1(dual specificity phosphatase-1,DUSP-1)基因的过表达慢病毒载体并包装病毒,感染人肾癌细胞株A498后观察DUSP-1的过表达对肾癌细胞株A498增殖和侵袭能力的影响。方法从pCMV6-XL5-DUSP-1质粒上获得目的基因片段,采用DNA重组技术将DUSP-1基因插入到慢病毒表达载体质粒Plv-EGFP(2A)Puro中,获得重组plv-EGFP(2A)Puro-DUSP-1载体。重组慢病毒表达质粒及辅助包装质粒pH1、pH2共转染293T细胞进行慢病毒包装,收集病毒上清并感染肾癌细胞株A498,利用Western blot检测细胞DUSP-1蛋白的表达情况。用MTS法检测细胞增殖能力的变化,Transwell法检测细胞侵袭能力的变化。结果成功构建携带DUSP-1过表达载体。包装病毒后成功感染A498细胞株,DUSP-1蛋白表达较对照A498细胞株显著上调。重组质粒组细胞在490 nm吸光值明显上升(P＜0.05);细胞侵袭试验中,重组质粒组的穿膜细胞数明显高于空载体组(P＜0.05)。结论成功构建了人DUSP-1基因的重组慢病毒表达载体pLV-EGFP(2A)Puro-DUSP-1,进行病毒包装后成功培养稳定高表达DUSP-1基因的肾癌细胞株;DUSP-1基因的过表达具有促进肾癌细胞株A498增殖和侵袭的作用。     

慢病毒介导shRNA沉默YAP基因对人前列腺癌LNCaP细胞增殖、凋亡及其雄激素受体的影响

目的:探讨慢病毒介导sh RNA沉默Yes-相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)基因对人激素依赖性前列腺癌细胞株LNCa P细胞增殖、凋亡及其雄激素受体(androgen receptor,AR)的影响。方法:3条针对YAP基因的sh RNA慢病毒干扰载体感染LNCa P细胞,经嘌呤霉素筛选后建立稳定感染细胞系,real-time PCR、Western blot分别检测感染后各组细胞YAP、AR m RNA和蛋白水平;选取沉默效果最佳sh RNA慢病毒干扰载体组,以细胞增殖/毒性检测(cell counting kit-8,CCK-8)、平板克隆形成实验(colony formation)检测LNCa P细胞增殖能力;流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测LNCa P细胞凋亡改变。结果:重组慢病毒成功感染前列腺癌LNCa P细胞,经嘌呤霉素筛选后感染效率达95%以上,获得稳定沉默YAP基因LNCa P细胞系。与空白对照组和阴性对照组比较,感染sh RNA慢病毒干扰载体各组中YAP、AR m RNA及蛋白表达水平明显下调(P=0.000),细胞增殖受到明显抑制(P=0.000),细胞凋亡明显增加(P=0.000)。结论:慢病毒介导sh RNA沉默YAP基因能有效下调YAP在LNCa P细胞中表达,并抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡;YAP可能作为AR配体参与AR信号通路的调节。     

Bloom解旋酶基因RNA干扰载体对前列腺癌PC3细胞的抑制作用

目的 采用RNA干扰(RNAi)技术抑制前列腺癌PC3细胞系中Bloom解旋酶基因的表达,探讨Bloom解旋酶基因表达下调后对PC3细胞的抑制作用.方法 使用实验室前期成功构建的两条针对于Bloom解旋酶基因的RNAi载体shRNA-1和shRNA-2转染前列腺癌PC3细胞,以未转染RNAi载体为对照组,分别在转染24、48、72h后通过MTT法检测细胞增殖情况,转染48 h后通过Transwell小室法检验细胞侵袭、迁移能力,细胞划痕实验检测细胞迁移情况,Hoechst/PI双染法检测细胞凋亡情况.结果 转染RNAi载体后,与未转染对照组相比,各实验时间点的转染组细胞增殖率降低(P＜0.05),Transwell细胞侵袭和迁移实验中穿过室膜的细胞数与对照组比均减少(侵袭:119±24、118±30 vs 227±38;迁移:122±13、121±47 vs 277±32,P＜0.05),划痕愈合率与划痕迁移距离均降低,48 h时差异有统计学意义(P＜0.05),而且细胞凋亡明显增加.结论 以RNAi载体干扰Bloom解旋酶基因的表达可抑制前列腺癌PC3细胞的增殖、迁移和侵袭能力并促进其凋亡,为前列腺癌的靶向基因治疗提供了依据.     

ALDH1高表达对乳腺癌细胞MCF-7干细胞特性的影响

目的 探讨ALDH1高表达对乳腺癌MCF-7细胞干细胞特性的影响,为乳腺癌的治疗提供理论依据。方法 构建慢病毒ALDH1RNA,转染乳腺癌MCF-7细胞,嘌呤霉素筛选稳定高表达ALDH1的亚克隆,命名为MCF-ALDH1细胞株。荧光定量PCR和Western blot法检测MCF-ALDH1细胞株及对照细胞中ALDH1在mRNA和蛋白水平的表达;克隆形成实验、悬浮球形成实验及裸鼠成瘤实验检测MCF-ALDH1及对照组细胞的干细胞特性,MTT法测定细胞的耐药性。结果 与MCF-7组细胞比较,MCF-ALDH1细胞株的ALDH1在mRNA和蛋白表达量明显升高;MCF-ALDH1细胞克隆形成数目为128±22个,高于MCF-ALDH1细胞球克隆形成数（46±15个）;悬浮成球实验,MCF-ALDH1细胞悬浮成球数目明显增多（16±2个）,高于对照细胞悬浮球数（8.0±1.5个）;肿瘤细胞在裸鼠皮下接种后,MCF-7细胞组有3只裸鼠成瘤,MCF-ALDH1有5只成瘤,瘤体积明显大于MCF-7组,差异有统计学意义（P<0.05）。耐药实验显示,MCF-ALDH1对顺铂、紫杉醇的耐药性明显提高。结论 高表达ALDH1的乳腺癌MCF-7细胞干细胞特性增强,ALDH1可能成为乳腺癌治疗的靶点之一。     

核糖体蛋白S3a RNA干扰重组慢病毒载体的构建及其对细胞凋亡的影响

目的 构建表达小鼠核糖体蛋白S3a 特异性RNA干扰重组慢病毒载体(Lenti-shmRPS3a),分析其对细胞凋亡的影响。方法 设计针对小鼠RPS3a mRNA 4条干扰序列,合成相应的发夹序列,连接入慢病毒载体系统 pLLU2G-eGFP中构建重组质粒,将重组质粒与辅助包装质粒共转染293T细胞组装病毒,检测病毒滴度。病毒感染RAW264.7细胞后,RT-PCR和Western blot检测干扰效果,流式细胞术分析其对凋亡的影响。结果 PCR和测序证明成功构建出Lenti-shmRPS3a慢病毒载体,病毒滴度为6-9×10₇TU/ml;RT-PCR表明Lenti-shmRPS3a的沉默效率高达72.64%、Western Blot证明RPS3a蛋白水平表达降低;流式细胞术证明感染了Lenti-shmRPS3a慢病毒载体的细胞凋亡率较对照组明显升高。结论 表达小鼠核糖体蛋白S3a shRNA慢病毒载体能有效沉默RPS3a基因表达,促进细胞凋亡。     

保留Retzius间隙机器人辅助腹腔镜根治性前列腺切除术：经膀胱入路与后入路的技术比较和临床效果

目的 比较经膀胱入路与后入路保留Retzius间隙机器人辅助腹腔镜根治性前列腺切除术（RARP）两种手术方法的技术特点及临床疗效。方法 回顾性分析2016年12月至2018年12月收治的35例分别行后入路保留Retzius间隙RARP或经膀胱入路保留Retzius间隙RARP的前列腺癌患者临床资料。后入路RARP组22例,术前总前列腺特异抗原（tPSA）（16.9±7.5）ng/mL,Gleason评分7分（5~8分）,前列腺体积（42.3±11.2）mL,国际勃起功能指数-5（IIEF-5）评分14分（9~20分）,临床分期cT1c期9例、cT2a期4例、cT2b期3例、cT2c期6例;经膀胱入路RARP组13例,术前tPSA（18.6±8.7）ng/mL,Gleason评分6分（5~7分）,前列腺体积（35.4±9.6）mL,IIEF-5评分15分（10~21分）,临床分期cT1c期8例、cT2a期2例、cT2b期2例、cT2c期1例。所有患者术前尿控均正常。两组患者均采用经腹腔途径完成手术。分析比较两种手术方法的手术时间、术中出血量、术后病理分期、术后Gleason评分、尿控恢复时间、术后IIEF-5评分的差异。结果 35例手术均顺利完成,无术中转开放手术者,无输血病例,无严重术中、术后并发症发生。后入路RARP组手术时间（123.4±31.7）min、术中出血量（48.2±12.8）mL,经膀胱入路RARP组手术时间（135.3±25.6）min、术中出血量（65.2±19.8）mL,两组间差异均无统计学意义（P均>0.05）。术后病理结果提示后入路RARP组病理分期pT2a期6例、pT2b期6例、pT2c期8例、pT3a期2例,术后Gleason评分7分（5~8分）,经膀胱入路RARP组病理分期pT2a期8例、pT2b期3例、pT2c期2例,术后Gleason评分6分（5~7分）,两组间差异均无统计学意义（P均>0.05）。后入路RARP组切缘阳性5例（22.7%）,经膀胱入路组RARP切缘阳性3例（23.1%）,两组间差异无统计学意义（P>0.05）。两组患者均于术后7 d拔除导尿管,后入路RARP组18例即刻实现尿控（无需使用尿垫）,4例术后2周实现尿控;经膀胱入路RARP组患者12例即刻实现尿控,1例术后2周实现尿控,两组间差异无统计学意义（P>0.05）。术后2个月,后入路RARP组IIEF-5评分为11分（4~13分）,经膀胱入路RARP组为12分（5~14分）,两组间差异无统计学意义（P>0.05）;两组IIEF-5评分与术前比较差异均无统计学意义（P均>0.05）。两组患者随访3~24个月,均未见肿瘤生化复发表现（tPSA均<0.2 ng/mL）。结论 经膀胱入路保留Retzius间隙RARP治疗体积较小的局限性前列腺癌手术效果与后入路保留Retzius间隙RARP技术相当,具有较好的术后即刻尿控效果,但性功能恢复需要进一步随访。经膀胱入路保留Retzius间隙RARP技术可行,未来有望成为治疗局限性低风险前列腺癌手术方式之一。     

人胶质瘤自杀基因细胞系的建立及其在胶质瘤治疗研究中的应用

目的 构建CD基因工程化人脑胶质瘤细胞并在此基础上进行胶质瘤治疗研究。方法 通过In-fusion基因克隆的方法,构建携带CD基因慢病毒载体;通过293T细胞体外包装获得慢病毒,并测定病毒效价;通过慢病毒体外感染细胞获得CD基因工程化人脑胶质瘤细胞;通过流式分选获得基因稳定表达细胞;通过CCK-8评价加入5-FC前药和(或)HSV-1后细胞存活率。结果 成功构建pLVX-CD-IRES-ZsGreen1慢病毒载体并体外包装获得相应慢病毒;慢病毒感染人脑胶质瘤U87细胞后获得携带CD基因的阳性细胞,并通过体外培养30天后流式分选获得稳定阳性细胞;加入前药5-FC和(或)HSV-1后对携带CD基因的U87细胞杀伤作用明显(P<0.01),其中5-FC联合HSV-1对胶质瘤细胞作用更加高效(P<0.01)。结论 成功获得携带CD基因的人脑胶质瘤细胞;前药5-FC联合HSV-1对胶质瘤细胞具有更加高效的杀伤疗效。     

PRL-3基因RNA干扰慢病毒载体的构建及在SW480细胞中的表达

目的 构建PRL-3基因慢病毒干扰载体及建立PRL-3基因稳定干扰的结直肠癌细胞亚系.为PRb-3基因功能研究奠定基础.方法 设计PRL-3基因特异性RNAi靶序列,与pENTRTM/U6线性载体定向连接,构建pENTRTM/U6真核入门表达载体.通过与pENTRTM/U6 entry clone与pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST载体进行重组,获得pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体.利用包装细胞293FT获得重组的慢病毒,感染大肠癌细胞株SW480细胞,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰PRL-3基因的细胞亚系.结果 成功构建PRL-3 pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为6×105U/L.RT-PCR、Western blotting结果 表明,克隆1 PRL-3mRNA及蛋白显著降低.结论 成功构建人PRL-3基因特异性的慢病毒干扰载体,获得PRL-3基因稳定干扰的大肠癌细胞亚系.     

长链非编码RNA ATB调控miR-144对胶质瘤迁移和侵袭的影响

目的 探讨长链非编码RNA ATB （lncRNA ATB）调控miR-144对胶质瘤迁移和侵袭的影响。方法 采用qPCR检测lncRNA ATB在胶质瘤组织和癌旁正常组织中的表达差异以及慢病毒si-ATB对胶质瘤细胞的转染效率情况;通过双荧光素酶报告基因进行检测lncRNA ATB和miR-144之间的关系;通过平板克隆实验检测lncRNA ATB对胶质瘤细胞株U87和U251增殖能力的影响;流式细胞术检测lncRNA ATB对胶质瘤细胞株凋亡行为的影响;Transwell实验检测lncRNA ATB对细胞株侵袭能力的影响;裸鼠体内实验检测lncRNA ATB对裸鼠移植瘤的体积和质量的影响情况。结果 胶质瘤lncRNA ATB的表达水平高于癌旁正常组织（P<0.05）,高水平lncRNA ATB患者的生存率低于低水平lncRNA ATB患者;使用si-ATB1和si-ATB2分别转染胶质瘤U87和U251细胞后,lncRNA ATB的表达水平降低;过表达miR-144后,野生型lncRNA ATB的荧光素酶活性受到抑制,对突变型lncRNA ATB的荧光素酶活性影响不明显。转染si-ATB 24、48和72小时后,U87[（186.4±12.4）个比（73.6±8.6）个比（62.6±5.6）个,P<0.05]和U251细胞[（192.2±15.3）个比（63.6±6.3）个比（68.3±7.6）个,P<0.05]和U251细胞的增殖能力低于对照组;lncRNA ATB的下调提高了U87和U251凋亡百分比（P<0.05）;抑制lncRNA ATB后,U87细胞和U251细胞的细胞侵袭能力降低;与对照组相比,si-ATB组肿瘤体积和肿瘤重量均小于或低于对照组（P<0.05）。结论 lncRNA ATB通过调控miR-144的表达促进胶质瘤细胞的生物学行为。     

甲状腺相关性眼病患者外周血CD4+、CD8+T细胞百分比及细胞表面程序性死亡蛋白1表达的改变及其意义

目的 观察甲状腺相关性眼病(TAO)患者外周血单个核细胞(PBMC)中CD4+、CD8+T细胞百分比及细胞表面程序性死亡蛋白1(PD-1)的表达水平,探索这两者变化在TAO发病机制及疾病诊断中的意义.方法 收集21例TAO患者、21例Graves病(GD)无眼病患者及20例健康对照者资料,采用流式细胞术检测所有受试者PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比及其表面PD-1的表达率,比较组间差异,分析其与患者病程、甲状腺功能、甲状腺相关抗体及TAO疾病活动性和严重程度之间的关系.结果 (1) TAO患者PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比分别为(35.9±14.5)％、(22.2±8.4)％,GD患者分别为(33.1±13.0)％、(18.6±9.2)％,均高于健康对照者[(17.4±7.4)％、(7.7±4.8)％,P＜0.01].(2) TAO及GD患者PBMC中CD4+T细胞表面PD-1表达率分别为(8.3±6.4)％、(28.0±26.6)％,均低于健康对照者[(52.2±28.6)％,P＜0.01.P＜0.05],且TAO患者低于GD患者(P＜0.05);TAO患者PBMC中CD8+T细胞表面PD-1表达率低于健康对照者r(12.7±13.4)％vs(38.2±24.2)％,P＜0.01].(3) TAO患者PBMC中CD8+T细胞百分比与病程呈正相关(r=0.478,P＜0.05).(4) TAO患者活动期组与非活动期组、轻度组与中重度组间CD4+、CD8+T细胞百分比及其表面PD-1表达率差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 TAO患者PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比及细胞表面PD-1表达存在异常,可能参与TAO的自身免疫过程.     

Ruxolitinib对人红白血病HEL细胞增殖、凋亡作用的研究

目的 探讨JAK2抑制剂Ruxolitinib对人红白血病HEL细胞增殖、凋亡作用的机制.方法 用不同浓度(0、1、5、10、50、100、500 nmol/L)的Ruxolitinib处理HEL细胞,其中0nmol/L为对照组.CCK-8法检测细胞活力;Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡;流式细胞术检测细胞周期;罗丹明123检测线粒体膜电位变化;试剂盒检测Caspase-3/7活性;RT-PCR检测JAK2 mRNA水平;蛋白质印迹法检测p-JAK2、p-ERK、Bcl-2、Bim蛋白表达.结果 不同浓度Ruxolitinib作用HEL细胞48h后,细胞活力分别为(97.0±4.4)％、(92.0±3.9)％、(88.0±3.7)％、(81.0±3.1)％、(64.0±2.9)％、(38.0±2.2)％;Hoechst33342凋亡细胞染色显示100 nmol/L Ruxolitinib处理细胞48 h后,亮蓝色凋亡细胞[(49.21±1.80)％]较对照组[(10.02±1.40)％]增多(P＜o.05);流式细胞术结果显示100 nmol/L Ruxolitinib作用细胞48 h后G0/G1期细胞比率[(73.1±3.6)％]高于对照组[(45.2±3.0)％];1～500 nmol/L Ruxolitinib作用12、24 h后,HEL细胞线粒体膜电位降低,Caspase-3/7活性增强;RT-PCR结果显示,不同浓度Ruxolitinib处理HEL细胞48 h后JAK2 mRNA表达呈剂量依赖性减低;蛋白质印迹检测结果显示,实验组细胞p-JAK2、p-ERK、Bcl-2蛋白表达较对照组降低(均P＜0.01),Bim蛋白表达增加(P＜0.01).结论 Ruxolitinib可能通过抑制JAK2及ERK激酶途径诱导HEL细胞凋亡.