IGFBP7促进人脐带间充质干细胞的软骨分化

目的：探究胰岛素样生长因子结合蛋白7（insulin?like growth factor?binding protein 7,IGFBP7）对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord?derived mesenchymal stem cells,hUC?MSCs）软骨分化的影响。方法：用软骨诱导培养基高密度成球培养hUC?MSCs,诱导成软骨分化,通过real?time PCR和Western blot检测软骨分化标志基因Sox9的表达,甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖的表达,以反映细胞外基质沉积情况;real?time PCR和Western blot检测IGFBP7在hUC?MSCs软骨分化过程中的表达情况;在hUC?MSCs中分别瞬时转染IGFBP7的表达质粒和siRNA以改变内源性IGFBP7表达水平,然后成软骨诱导,采用甲苯胺蓝染色,real?time PCR和Western blot检测IGFBP7表达变化对于hUC?MSCs成软骨分化的影响。结果：在hUC?MSCs成软骨分化过程中,IGFBP7 mRNA水平和蛋白水平表达均显著升高。与对照组相比,过表达IGFBP7的hUC?MSCs经成软骨诱导后,Sox9表达量显著升高,甲苯胺蓝染色更深,软骨分化能力更强。反之,敲低IGFBP7表达后,hUC?MSCs的软骨分化能力降低。结论：IGFBP7促进人脐带间充质干细胞成软骨分化。     

间充质干细胞向软骨方向分化的研究

骨髓间充质干细胞(MSC)广泛于人体各个部位,具有多向分化潜能。MSC的多能性,在体外容易分离和扩增培养,使其有望成为组织工程理想的种子细胞。MSC应用于软骨组织工程的过程非常复杂,不仅需要多种生长因子如TGF-βs,IGF-I等的协调作用,还需要将细胞运送到所需部位的特殊支架。     

生长因子诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化的研究

目的 建立一种体外分离兔骨髓间充质干细胞（MSCs)的方法，诱导其表达软骨细胞表型。方法 抽取兔骨髓，经密度梯度离心和粘附分离得到MSCs。用生长因子诱导，观察细胞的增殖情况和软骨特异性基质的表达水平。结果 ①纤维粘连蛋白促进MSCs贴壁，可提高细胞分离率；②TGF－β1，IGF－I和维生素C结合可促进MSCs增殖，表达软骨特异性的Ⅱ型前胶原mRNA和基质蛋白多糖成分。结论 ①密度梯度离心结合粘附分离可提高MSCs的分离效率。②TGF－β，IGF－I和维生素C结合诱导可促进MSCs增殖，表达软骨细胞表型。     

抑制芳香烃受体表达促进人脐带间充质干细胞的增殖和软骨分化

目的 探究芳香烃受体(AhR)对人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)增殖和软骨分化能力的影响.方法 用AhR-homo-1432 inhibitor和AhR-homo-1432 inhibitor阴性对照转染hUC-MSCs,设为si-AhR组和si-NC组.在转染hUC-MSCs后的第1、3、5、7天,CCK-8法测定细胞活力;软骨分化诱导培养hUC-MSCs 7 d,实时荧光定量PCR和Western blot检测软骨分化标志物SOX-9和COL2A1 mRNA和蛋白的表达;阿利新蓝染色检测蛋白聚糖的表达.结果 与si-NC组比较,si-AhR组AhR的mRNA和蛋白水平表达降低,表明转染成功.CCK-8实验结果显示,与si-NC组比较,转染后的第5天和第7天si-AhR组hUC-MSCs活力增强.经软骨分化诱导培养后,与si-NC组比较,si-AhR组hUC-MSCs的SOX-9和COL2A1 mRNA和蛋白表达升高;阿利新蓝染色结果显示,si-AhR组hUC-MSCs表达的蛋白聚糖含量较si-NC组增多,染色更深,软骨分化能力增强.结论 抑制AhR表达可促进hUC-MSCs的增殖和软骨分化.     

滑膜间充质干细胞在软骨修复领域的研究进展

自2001年发现以来,人们对滑膜间充质干细胞(SMSC)的研究已有十多年,在MSCs家族中,SMSC在骨骼肌系统的治疗和再生方面最具前景,尤其在软骨再生方面。由于具有比骨髓、脂肪、肌肉等来源的MSC具有更强自我增殖能力和成软骨能力,滑膜间充质干细胞在未来有可能成为软骨修复领域的种子细胞。本文主要对近年来滑膜间充质干细胞在软骨修复领域的应用及其研究进展进行综述。     

骨髓间充质干细胞的成软骨分化机制及其临床应用

骨髓间充质干细胞具有向软骨分化的能力,并且来源方便、没有免疫排斥等优点,已作为新型种子细胞倍受关注。同时,利用该干细胞进行软骨再造也是近年来软骨组织工程主要的发展方向之一。现将近年来该干细胞向软骨的分化机制及临床应用的研究进展作一综述。     

透明质酸诱导骨髓间充质干细胞治疗骨性关节炎软骨分化研究进展

骨关节炎(OA)是以关节软骨变性、骨质增生为特征的退行性关节病,患病率、致残率高.目前缺乏有效的治疗措施,对患者生活质量和社会经济有很大的影响.骨髓间充质干细胞(MSCs)属于多能干细胞,易从体外提取,增殖能力强,免疫源性低,已经成为一个再生医学重要的细胞来源,特别是对于软骨修复.OA滑膜存在MSCs归巢有关黏附因子,提示MSCs在OA软骨修复中有重要作用.体外透明质酸(HA)和自体滑膜液培养诱导间充质干细胞获得了与TGF-β相似的分化软骨细胞结果,为在体试验奠定基础.亦有报道MSCs治疗OA会加重骨赘的形成.     

间充质干细胞来源外泌体促进软骨再生的研究进展

关节软骨(AC)通常被认为是一种含有大约80％的水的组织,它没有血管、神经和淋巴管,只有一种细胞类型,即软骨细胞.关节软骨损伤是肌肉骨骼医学中最具挑战性的问题之一.关节软骨自身再生能力有限,损伤AC最终会导致骨关节炎(OA)的发生和发展.目前对受损的关节软骨的治疗方法如理疗、改变生活方式、使用药物以及外科手术等均只能短...     

骨髓间充质干细胞治疗大鼠骨关节炎的实验研究

目的：研究不同浓度骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs）对骨关节炎（osteoarthritis,OA）的治疗效果,并探究其治疗机制。方法：8周龄近交系SD大鼠32只随机分成4组,每组8只,均采用自身双侧对照研究：对照组、高浓度组（1×10⁷/mL BM-MSCs）、低浓度组（5×10⁶/mL BM-MSCs）及高/低浓度对比组。应用改良Hulth方法诱导膝关节OA。对照组一侧行手术,另一侧行假手术,其余各组均行双侧手术。术后4周处死对照组大鼠采集双侧膝关节标本。各试验组大鼠膝关节内注入相应浓度的BM-MSCs或磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution,PBS）,切断大鼠双侧坐骨神经及股神经使下肢制动,注射3周后处死各组大鼠并收取双侧膝关节标本。应用Mankin组织学评分评价OA病变程度,RT-PCR检测软骨Ⅱ型胶原mRNA表达,荧光显微镜观察荧光蛋白标记的BM-MSCs在膝关节内分布情况。结果：高浓度组、低浓度组BM-MSCs侧软骨组织标本Mankin评分均明显低于对照侧（5.40±0.51 vs. 9.60±0.51;6.60±0.40 vs. 10.00±0.32;P均<0.05）,高/低浓度对比组高浓度侧Mankin评分略低于低浓度侧（6.40±0.51 vs. 7.60±0.75,P>0.05）。RT-PCR结果显示,高浓度组、低浓度组BM-MSCs侧软骨Ⅱ型胶原mRNA含量分别为对照侧的108%±1%和106%±1%,高/低浓度对比组高浓度侧Ⅱ型胶原mRNA含量是低浓度侧的102%±1%。荧光显微镜显示,在软骨表面未见绿色荧光蛋白表达,而在滑膜组织内可见绿色荧光表达。结论：关节腔内注入BM-MSCs可能通过间接机制对OA软骨病变起到保护作用,两种浓度治疗效果无差异。     

巨噬细胞在间充质干细胞治疗骨关节炎中的作用

间充质干细胞（MSC）治疗骨关节炎(OA)是研究前沿与热点。目前研究证明,巨噬细胞是MSCs治疗OA的重要作用环节,MSCs促进巨噬细胞向M2Mφ极化是MSCs治疗OA的重要机制,MSCs分泌的一些蛋白和miRNA促进Mφ向M2Mφ极化,MSCs旁分泌物质（如外泌体）治疗OA与MSCs有相似的效果与机制等,这为临床积极开展MSCs治疗OA奠定了理论基础。但目前仍有较多问题有待解决,比如,MSCs治疗OA除巨噬细胞途径外,还有什么其它途径,如MSCs与关节软骨直接作用等;MSCs除其分泌的蛋白、miRNA促进M2巨噬细胞极化外,还有什么作用方式,如细胞间直接接触等;如何提高MSCs治疗OA的效果,如增强MSCs某些方面功能,和干细胞分泌组成分、PRP、透明质酸等联合应用,改变MSCs的递送系统等;M2巨噬细胞是否可以直接用于治疗OA;还有积极推进MSCs外泌体治疗OA 的临床研究;探讨其它细胞类型治疗OA的研究等。这些问题都是应当进行深入探讨的。     

OPN诱导小鼠MSCs向表皮细胞分化促进创面愈合的研究

目的 以骨桥蛋白(osteopontin,OPN)基因敲除小鼠及野生型小鼠为研究对象,探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化为表皮细胞的潜能及骨桥蛋白在分化过程中的作用.方法 体外实验:将分离培养的野生型(WT)和基因敲除型(KO)新生鼠(鼠龄1d)MSCs鉴定纯度后分别设为WT组和KO组,取其第3代分别在表皮转化培养体系中孵育,通过镜下观察、流式细胞术、免疫荧光染色、Western blot等方法,比较两组表皮细胞标志物(CK14)表达水平的差异.动物实验:实验分4组,WT组小鼠创周注射GFP-MSCs (WT/MSCs)组,WT小鼠创周注射PBS(WT/PBS)组,KO小鼠创周注射GFP-MSCs (KO/MSCs)组,KO小鼠创周注射PBS(KO/PBS)组,每组各8只雄鼠,鼠龄6～8周,体质量20 ～25 g,按分组将分离培养的GFP-MSCs和PBS注射到创周,观察创面愈合及GFP-MSCs向表皮细胞分化的情况.结果 分离培养的MSCs呈梭形或成纤维细胞样生长,流式细胞术检测MSCs的纯度超过91％;诱导分化第12、17天的两组细胞检测发现,WT组和KO组的细胞均表达CK14;第17天免疫荧光结果示WT组CK14的表达阳性率(0.936 3±0.009 5)明显高于KO组(0.647 5±0.023 1),(P＜0.01);Western blot检测结果也显示KO组的CK14表达量(0.3894±0.016 8)明显低于WT组(0.614 6±0.015 3),(P＜0.01).动物实验WT/PBS组创面愈合速度快于KO/PBS组(P＜0.05),WT/MSCs组的创面愈合速度快于WT/PBS组(P＜0.05),注射的GFP-MSCs向表皮细胞分化的能力WT/MSCs组强于KO/MSCs组(P＜0.05).结论 OPN在体内、体外均可诱导MSCs分化为表皮细胞,进而促进创面愈合.     

Astrocytes Facilitate the Growth and Differentiation of Co-cultured Mesenchymal Stem Cells

The effect of astrocytes on the growth and differentiation of co-cultured mesenchymal stem cells （MSCs） was studied. MSCs of Wistar rats were isolated, cultured and labeled with Hoechst33342. The labeled MSCs were co-cultured with astrocytes in DMEM/F12/10%FBS. The growth status and morphologic change of MSCs were observed. The expression of specific protein NeuN, GFAP and CNP was detected by using immunofluorescence staining. The results showed that the two kinds of co-cultured cells grew well. Some labeled MSCs stretched out long processes with spin, triangle and star shapes. Immunofluorescence stain showed that these cells expressed NeuN, GFAP or CNP. It was suggested that astrocytes could promote the prolifevation of co-cultured MSCs and induce them to differentiate into neural like cells.     

bFGF促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经元转化及机制

目的探讨碱性成纤维生长因子对大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元的作用及信号通路.方法利用bFGF与不同生长因子和化学诱导剂组合诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向神经元转化,观察分化过程中细胞形态、数目的变化,观察免疫细胞化学检测分化后细胞神经细胞标志蛋白和部分神经功能相关蛋白以及FGFR的表达情况,并计算转化率.结果①3组不同条件诱导后,MSCs均能分化为具有典型神经元形态的细胞,并明显表达NSE、MAP2和5-HT1D,但不表达GFAP;②bFGF预诱导组的转化率明显高于未预诱导组;③诱导后的神经元样细胞FGFR3表达明显增强.结论以DMSO和BHA为基础诱导剂,bFGF预处理可明显提高MSCs跨胚层分化为神经元样细胞的转化率,浓度为10 ng/ml的bFGF主要是通过FGFR3作用于MSCs.     

脐带间质干细胞多向分化潜能的鉴定

目的:研究脐带间质干细胞的多向分化潜能,为心血管组织工程研究提供一个新的种子细胞来源?方法:采用胶原酶胰酶消化脐带组织,将获得的细胞传代培养,流式细胞仪鉴定细胞表面分子,再以不同方法使其向骨?脂肪?心肌和内皮细胞方向诱导,分别采用Von Kossa?油红O染色和免疫组化对分化的细胞进行鉴定?结果:脐带间质干细胞分别向成骨细胞和成脂肪细胞诱导培养后,Von Kossa染色和油红O染色阳性?在5-氮胞苷诱导后,心肌特异性抗体肌动蛋白α-actin和肌球蛋白myosin免疫组化染色阳性?在VEGF诱导后,细胞形成网格样结构,免疫荧光示CD31?CD34染色阳性?结论:脐带间质干细胞具有分化为骨?脂肪?心肌和内皮细胞的潜能,是非常有前途的心血管组织工程种子细胞来源?     

EphrinB2基因工程的骨髓间质干细胞对分化成血管内皮细胞的影响

目的 观察研究ephrinB2基因转染对体外诱导环境大鼠骨髓问质干细胞(BMSCs)分化成血管内皮细胞的促进作用.方法 采用密度梯度离心-贴壁培养法从Wistar大鼠骨髓中得到BMSCs.采用lenti-virus载体装载人ephrinB2基因转染大鼠BMSCs.采用流式细胞计数测定CD105、CD73、CD44、八因子(VWF)和血管内皮生长因子受体(KDR)等标志物在ephrinB2-BMSCs中的表达,并探讨其向成骨细胞及脂肪细胞体外分化的多向分化潜能.以2％FBS和50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)的培养条件,体外诱导ephrinB2-BMSCs向血管内皮细胞分化,并测定相应标志物的表达.结果 未经诱导分化的ephrinB2-BMSCs表达CD105、CD73和CD44,不表达血管内皮细胞特异性标志物VWF和KDR.转染后的ephrinB2-BMSCs依然具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的多向分化潜能.经诱导,ephrinB2-BMSCs表达VWF与KDR,并且其生成血管内皮细胞的比率及在Matrix基质上形成毛细血管样结构的比率均显著高于未转染ephrinB2的BMSCs.结论 ephrinB2基因工程的BMSCs具有极高的向血管内皮细胞分化的潜能.这种基因工程细胞为建立冠心病患者的临床治疗新方法提供了有意义的资源.     

低氧增强骨髓间充质干细胞增殖维持分化潜能

目的观察低氧增强人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)体外增殖并维持其多向分化潜能的作用。方法分离10例骨髓血标本BMMSCs,分别进行低氧(低氧组)及常氧(常氧组)培养,观察BMMSCs的形态、增殖能力及成骨、成脂分化能力。结果低氧组BMMSCs保持其长梭形,鱼群样分布,增长状态良好,常氧组BMMSCs形态呈多角形或扁平状,低氧组BMMSCs数量及生长速率较常氧组增加(P0.05),且低氧组BMMSCs具有成骨、成脂分化能力。结论低氧能促进BMMSCs的体外增殖且维持其多向分化潜能。     

胎儿骨髓间充质干细胞在体外无支架下向软骨组织分化的探讨

目的　探讨骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSCs)无支架条件下在体外向软骨组织定向分化的条件。方法　取引产胎儿骨髓悬液 ,经Percoll密度梯度离心 ,获取单个核细胞 ,细胞贴壁、扩增后 ,再以高糖DMEM(TGF β15ng/ml)进行成软骨细胞预诱导 ,4～ 7d后获得成纤维样单层贴壁的MSCs。以此MSCs为种子细胞 ,2× 10 6个细胞离心成团 ,在TGF β1与IGF Ⅰ及其它辅助成分的协同作用下 ,体外培养 3wk后形成组织团块。经固定、包埋、切片后行甲苯氨蓝染色 ,免疫组化方法测定特异性Ⅱ型胶原。通过图象分析软件检测组织块蛋白多糖和Ⅱ型胶原表达强度 ,并与胎儿正常软骨比较。结果　胎儿骨髓单个核细胞经过预诱导 ,细胞表达特异性Ⅱ型胶原 ,甲苯氨蓝染色蓝染明显增强 ;再经离心成团、体外诱导培养后形成有光泽软骨样组织块 ,其甲苯氨蓝染色呈蓝染 ,特异性Ⅱ型胶原为阳性表达 ,图象分析表明其蛋白多糖及Ⅱ型胶原表达强度与胎儿正常软骨相似。结论　胎儿骨髓间充质干细胞经高糖DMEM预诱导后可向软骨细胞分化 ;离心成团后 ,在TGF β1与IGF Ⅰ及其它辅助成分的协同作用下具有形成类软骨组织的能力 ,本实验建立的定向诱导培养系统在无支架条件下可使MSCs向软骨样组织分化。     

人骨髓间质干细胞向脂肪细胞诱导分化过程中端粒酶活性的变化

目的观察体外培养人骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成脂分化过程中端粒酶活性的变化规律,并探讨其可能的机制。方法通过贴壁培养法从人骨髓中分离MSCs,利用造血干细胞相关表面抗体对MSCs进行表型鉴定,利用相应诱导分化剂,诱导MSCs向成骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞分化,分析其多向分化潜能。以端粒重复序列扩增法(TRAP)检测MSCs及MSCs诱导成脂分化过程中端粒酶活性;以Western印迹法检测MSCs及MSCs诱导成脂分化过程中端粒酶反转录酶(hTERT)及端粒相关蛋白[端粒重复序列结合因子1(TRF1)、端锚聚合酶1(Tankyrase 1)]的表达水平。结果 TRAP法检测传代培养的MSCs端粒酶呈阴性表达,而MSCs诱导成脂分化过程中,端粒酶活性明显升高,以第7天最高(P<0.05),其后呈下降趋势;Western印迹法检测显示,hTERT在MSCs中有微弱表达,在MSCs诱导成脂分化过程中,hTERT和Tankyrase 1表达水平升高,以第7天最高,此后逐渐下降,而TRF1表达水平保持不变。结论体外培养的MSCs端粒酶呈微弱表达,MSCs在成脂诱导分化过程中,端粒酶活性先升高,其后逐渐下降,而Tankyrase 1可能在其中发挥重要作用。     

心肌细胞介导骨髓间充质干细胞的心肌样分化

目的探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在不同培养条件下定向分化过程中的生物学特性变化及其机制.方法贴壁法分离大鼠MSCs,培养至第6代.实验分3组:条件培养基组,用新生鼠心肌细胞培养上清液制成的条件培养基处理MSCs48 h 2次,其间间隔48 h;混合培养组,新生鼠心肌细胞和MSCs按1:1的比例混合培养1周;对照组,MSCs常规培养.检测各组MSCs中心肌细胞结构功能蛋白:心肌肌联蛋白(titin)、肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)、心肌组织缝隙连接的特异性组成蛋白质Connexin43(Cx43)的表达情况.结果①条件培养基可诱导MSCs心肌样分化,表达心肌细胞骨架蛋白titin的Z带及A带部分,Cx43大量表达,但在检测期内未观察到MHC的表达;②MSCs在混合培养中与心肌细胞形成连接,表达titin,部分细胞内可检测到类似肌小节的结构,Cx43集中分布于细胞相邻的界面;③对照组中的部分MSCs可少量表达Cx43及titin.结论源于心肌细胞的各种因素可促使MSCs心肌样分化,分化的程度取决于作用信号的性质.