人RUVBL2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建带有绿色荧光蛋白的RUVBL2真核表达载体pEGFP-N1-RUVBL2,并鉴定其在HeLa细胞中的表达。方法:以pGADT7-RUVBL2质粒为模板,PCR扩增RUVBL2基因,首先克隆至T载体中,进一步亚克隆至p-EGFP-N1,并对重组表达载体进行酶切及测序鉴定。采用脂质体转染法将重组质粒瞬时转染HeLa细胞系,应用荧光显微镜观察绿色荧光融合蛋白的表达,并用Western blot法检测RUVBL2-GFP融合蛋白的表达。结果:经限制性酶切鉴定及测序分析证实pEGFP-N1-RUVBL2载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的HeLa细胞中有绿色荧光蛋白的表达,Western blot法证实转染细胞中能表达RUVBL2-GFP融合蛋白。结论:pEGFP-N1-RU-VBL2表达载体构建成功,并在HeLa细胞内成功表达。     

大鼠CD36基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建大鼠CD36真核表达载体,并在293T细胞中表达.方法:应用RT-PCR技术,从大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞提取的总RNA中,获得CD36基因编码序列片段,克隆至真核表达载体pEGFP-N1中,对重组质粒进行酶切和测序鉴定后,以脂质体介导法转染至293T细胞,通过荧光显微镜和Western blot检测其在293T细胞中的表达.结果:酶切和测序证明重组真核表达载体pEGFP-N1-CD36构建成功,荧光显微镜及Western blot确认目的基因序列在293T细胞中过表达.结论:成功构建大鼠CD36基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-CD36,并在293T细胞中过表达.     

小鼠子宫珠蛋白结合蛋白真核表达载体构建及其在COS-1细胞的表达

目的:构建小鼠子宫珠蛋白结合蛋白(mouse uteroglobin binding protein,mUGBP)真核表达载体,观察其在COS-1细胞中的表达和定位.方法:用RT-PCR方法扩增mUGBP的cDNA序列,将其插入pEGFP-N1载体的多克隆位点构建pEGFP-UGBP重组质粒.采用脂质体转染法将重组质粒转染到无内源性mUGBP表达的非洲绿猴肾成纤维细胞株COS-1中,观察其在细胞内的表达,并用Western免疫印迹方法进行验证.结果:pEGFP-UGBP重组质粒经酶切鉴定以及测序证实,插入的目的基因序列完全正确.激光共聚焦显微镜观察发现,转染了pEGFP-UGBP重组质粒的细胞株可见绿色萤光蛋白的表达;Western免疫印迹检测发现细胞膜组分中可检获上述转染了重组质粒的细胞所表达的融合蛋白.结论:成功构建了pEGFP-UGBP重组质粒并进行了真核表达.     

小鼠pEGFP-Hoxa11真核表达载体的构建及表达

目的 构建和鉴定Hoxa11和EGFP双基因共表达真核载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因Hoxa11克隆至含有报告基因EGFP的pEGFP-N1真核表达载体中,构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11经PCR,双酶切及基因测序鉴定;转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察重组质粒的表达,提取细胞蛋白Western...     

口蹄疫病毒VP1基因真核表达载体的构建及其在树突状细胞的表达

目的:构建口蹄疫病毒VP1基因的真核表达载体, 转染并筛选稳定表达VP1的树突状细胞(dendritic cell, DC).方法:将pMD-18-VP1克隆于pcDNA3.1(+)中, 构建重组质粒, 酶切鉴定, DNA测序证实序列正确后, 利用脂质体将重组质粒转染DC, 经含G418培养基筛选获得抗G418细胞克隆, 用Western blot鉴定FMDV VP1基因在DC中的表达.结果:构建的pcDNA3.1-VP1真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及序列分析证实了其序列的正确性, SDS-PAGE和Western blot结果显示G418筛选获得DC稳定表达VP1.结论:成功地构建了重组质粒pcDNA3.1- VP1真核表达载体, 并在DC中得到稳定表达.     

重组人平足蛋白基因在中国仓鼠卵巢细胞的稳定表达

目的构建平足蛋白(PDPN)真核表达质粒PDPN-pEGFP-N1,建立稳定高表达重组人PDPN的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株并对其进行生物学活性研究。方法通过反转录PCR和DNA重组技术从HEK293细胞中克隆PDPN cDNA,插入带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的真核表达载体pEGFP-N1中。通过PCR、酶切及测序等方法鉴定重组载体;进而将该重组载体转染至CHO细胞中,通过荧光显微镜检测EGFP的表达,Western blot法检测PDPN在CHO细胞中的表达,流式细胞术分选高表达PDPN的CHO细胞,运用血小板聚集实验检测分选后细胞株的生物学活性。结果 DNA测序和酶切鉴定证明PDPN基因正确克隆至pEGFP-N1载体中,重组载体稳定转染CHO细胞后,在荧光显微镜下观察到绿色荧光,流式细胞术分选后的细胞高表达PDPN;Western blot结果显示转染后CHO细胞膜表面表达PDPN蛋白;过表达PDPN的CHO细胞可以诱导人血小板聚集。结论成功构建了稳定高表达PDPN蛋白的CHO细胞株,该细胞株可表达PDPN,并诱导血小板聚集。     

人Gax基因真核表达载体的构建及在血管平滑肌细胞中的表达

目的:构建人Gax基因真核表达载体,并观察在兔血管平滑肌细胞中的表达。方法:通过PCR从pCMV-SPORT6-Gax质粒中扩增出人Gax cDNA片段,经双酶切后装入到有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,经限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定后通过梭华-Sofast转染试剂介导重组质粒转染至兔血管平滑肌细胞中进行表达,通过荧光显微镜观察转染细胞的绿色荧光蛋白表达和RT-PCR扩增转染细胞的cDNA来鉴定Gax在兔血管平滑肌细胞中的表达。结果:琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物人Gax基因片段约915bp,与预期分子量相符;酶切分析和测序鉴定证明人Gax真核表达载体pEGFP-N1-Gax连接正确;荧光显微镜观察到重组质粒转染细胞中有绿色荧光蛋白表达,及RT-PCR证明转染细胞有人GaxmRNA表达。结论:成功构建人Gax基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-Gax,并证实在兔血管平滑肌细胞中表达,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。     

人Gal-9基因的克隆及在CHO细胞中的表达

目的:构建β-半乳糖苷结合凝集素-9(Gal-9)的真核表达载体,在CHO细胞中表达,并检测其表达。方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆Gal-9基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pGal-9瞬时转染CHO细胞,通过Western blot和RT-PCR方法检测Gal-9的表达,MTT法检测Gal-9对同种异体淋巴细胞增殖的影响。结果:DNA测序和酶切鉴定证明Gal-9基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点;以重组质粒pGal-9瞬时转染CHO细胞,通过Western blot和RT-PCR方法,在分子和蛋白水平证实Gal-9的表达,MTT法检测显示,Gal-9明显抑制同种异体淋巴细胞增殖反应,平均抑制率达85.43%。结论:成功构建pGal-9的真核表达载体,证实其在CHO细胞中可以成功表达,并抑制同种异体淋巴细胞增殖反应。     

多发性骨髓瘤负性相关基因DAZAP2的真核表达及定位

目的 构建无精症相关蛋白2(DAZAP2)真核表达重组载体, 对基因进行细胞定位. 方法提取1例正常人骨髓单个核细胞总RNA, 以逆转录产物作为模板,PCR扩增DAZAP2的开放阅读框(ORF).采用定向克隆法与真核表达载体pEGFP-N1连接,转染大肠杆菌DH5α,经双酶切及测序证实.脂质体法转染COS7细胞后,运用Western 印迹及免疫定位技术检测表达产物.结果 测序证实真核表达重组质粒的阅读框没有发生改变,转染重组质粒的细胞表达融合蛋白DAZAP2-EGFP,主要在COS7细胞质中表达.结论 成功获得了DAZAP2真核表达重组质粒并有效地表达重组融合蛋白,DAZAP2主要定位在细胞质中的泡状分泌结构上.     

多发性骨髓瘤负性相关基因DAZAP2的真核表达及定位

目的 构建无精症相关蛋白2（DAZAP2）真核表达重组载体, 对基因进行细胞定位. 方法提取1例正常人骨髓单个核细胞总RNA, 以逆转录产物作为模板,PCR扩增DAZAP2的开放阅读框（ORF）.采用定向克隆法与真核表达载体pEGFP-N1连接,转染大肠杆菌DH5α,经双酶切及测序证实.脂质体法转染COS7细胞后,运用Western 印迹及免疫定位技术检测表达产物.结果 测序证实真核表达重组质粒的阅读框没有发生改变,转染重组质粒的细胞表达融合蛋白DAZAP2-EGFP,主要在COS7细胞质中表达.结论 成功获得了DAZAP2真核表达重组质粒并有效地表达重组融合蛋白,DAZAP2主要定位在细胞质中的泡状分泌结构上.     

人TRAF3IP3基因的克隆及真核表达

目的 构建人肿瘤坏死因子受体相关因子3相互作用蛋白3(TRAF3IP3)基因真核表达载体,并进行表达检测及鉴定.方法 RT-PCR扩增获得TRAF3IP3开放读码框区基因,双酶切连入真核表达载体pIRES2-EGFP,双酶切和测序鉴定阳性克隆;重组质粒磷酸钙法转染HEK293细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,实时定量PCR和Western blot法鉴定TRAF3IP3基因的表达情况.结果 经限制性内切酶酶切鉴定和测序证实,成功构建了TRAF3IP3真核表达质粒,荧光显微镜观察可见转染了重组质粒的HEK293细胞有绿色荧光蛋白的表达,实时定量PCR和Western blot结果证实TRAF3IP3蛋白高水平表达.结论 成功构建了pIRES-EGFP-TRAF3IP3真核表达质粒,为TRAF3IP3基因功能的研究奠定了基础.     

禽流感病毒(H5N1)血凝素蛋白真核表达载体的构建与表达

目的:构建禽流感病毒(H5N1)血凝素蛋白HA真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞)。方法:从江苏H5N1流感病毒毒株(A/Jiangsu/07-4(H5N1))提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增HA全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-HA质粒,双酶切pMD18-T-HA与PXJ40-MYC后,构建真核表达载体PXJ40-MYC-HA,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过West-ern blot鉴定HA蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实HA基因的真核表达载体构建成功。Western blot法可见HA基因编码蛋白的成功表达。结论:成功构建了H5N1血凝素真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达HA蛋白的细胞模型和HA蛋白功能研究奠定了基础。     

人CD226分子胞膜外区D1和D2真核表达载体的构建、表达和鉴定

目的 构建含有人CD226分子胞膜外区结构域1(D1)和结构域2(D2)的真核表达载体,表达并纯化重组蛋白.方法用特异性引物分别扩增CD226 D1和D2的基因,定向插入真核表达载体pSecTag2B-Fc,进行酶切和DNA测序鉴定,重组质粒瞬时转染293T细胞,收集上清,纯化蛋白及SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.结果利用PCR方法克隆出CD226胞膜外区D1和D2的基因,并正确插入pSecTag2B-Fc载体中,真核表达载体瞬时转染293T细胞,Western blot结果证实转染293T细胞的培养上清液中含有hCD226D1-Fc和hCD226D2-Fc融合蛋白,培养上清经亲和层析柱纯化,可获得较高纯度的重组蛋白.结论 成功的构建了分泌型融合蛋白hCD226D1-Fc和hCD226D2-Fc真核表达载体,获得纯度较高的融合蛋白,为进一步探讨其配受体的相互作用机制奠定了基础.     

脂肪分化相关蛋白对软脂酸诱导的H9c2心肌细胞凋亡的影响

目的:构建编码脂肪分化相关蛋白(ADRP)基因全长序列的真核表达载体,探讨ADRP过表达对软脂酸诱导的H9 c2心肌细胞凋亡有何影响。方法:(1)采用PCR的方法,以成年SD大鼠心肌cDNA为模板扩增编码ADRP全长的DNA序列,重组入pEGFP-C1质粒表达载体中,酶切、测序鉴定后转化大肠埃希菌DH5α,挑取阳性克隆,扩增后提取质粒,进行酶切和测序鉴定;(2)采用脂质体转染法将鉴定后的重组质粒转染H9 c2心肌细胞株,经G418筛选获得抗性细胞克隆后扩大培养;荧光显微镜观察细胞内绿色荧光蛋白报告基因表达情况;RT-qPCR和Western blot检测转染细胞与正常细胞ADRP mRNA和蛋白表达水平;(3)采用流式细胞术检测不同浓度软脂酸对上述细胞细胞凋亡率的影响。结果:(1)酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入表达质粒pEGFP-C1;(2)荧光显微镜观察细胞内有绿色荧光蛋白表达且传20代以上无消失;RT-qPCR和Western blot证明重组质粒转染H9 c2细胞ADRP mRNA和蛋白表达水平明显高于空质粒转染组和正常对照组(P<0.01);(3)经不同软脂酸刺激后,重组质粒转染H9 ...     

RACK1过表达和低表达HUVEC细胞系的建立和鉴定

目的建立有活性的蛋白激酶C受体1(RACK1)过表达和低表达人脐静脉内皮细胞系(HUVEC),为进一步从分子水平研究RACK1在心律失常中的作用机制提供有效手段。方法扩增RACK1基因的全长c DNA序列,并插入p IRES2-EGFP获得过表达载体p IRES2-EGFP-RACK1;同时,设计合成3对短发夹结构的互补DNA序列和一对阴性对照序列,亚克隆至p Genesil-1得到相应的干扰载体;脂质体转染法将重组体及相应的空质粒分别转染至HUVEC细胞,经G418筛选抗性细胞克隆,qRT-PCR及Western blot鉴定RACK1 mRNA和蛋白的表达。结果RACK1真核表达载体和RNA干扰载体构建成功。重组体经脂质体法转染HUVEC 48 h后,经G418筛选3周得到细胞抗性克隆,qRT-PCR及Western blot结果证实了过表达载体和干扰载体能有效的增强和沉默HUVEC细胞中RACK1的表达。结论成功建立了RACK1过表达和低表达HUVEC细胞系。     

真核表达载体pEGFP-claudin-1的构建及其在293T细胞中的表达

目的:构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,并在293T细胞中进行表达.方法:用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增claudin-1开放读码框(ORF)基因,将其插入到pEGFP-C3载体的Xho Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点,构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,酶切鉴定并测序.通过脂质体法转染293T细胞,进行荧光检测和Western blot分析.结果:构建了含有claudin-1 ORF的真核表达质粒pEGFP-claudin-1,转染293T细胞后,经荧光可见细胞膜有EGFP-claudin-1 融合蛋白的表达,Western blot检测发现有相对分子质量(Mr)49 000的蛋白条带.结论:成功地构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,并在293T细胞中表达,为研究claudin-1的功能奠定了基础.     

SOD1真核表达载体的构建及表达

目的:构建人铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)基因真核表达载体,并在HeLa细胞中进行表达。方法:应用RT-PCR从人外周血中扩增SOD1基因开放阅读框(ORF),采用TA克隆技术,将目的片段插入到pUCm-T载体中进行鉴定,重组的质粒命名为pUCm-T-SOD1。随后,将SOD1进一步克隆到真核表达载体pTracer-CMV/Bsd中。用脂质体将经过测序、验证的重组pTracer-CMV/Bsd-SOD1质粒转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,转染HeLa细胞,经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选4周,用RT-PCR、Western blot检测SOD1的表达。结果:成功构建了pTracer-CMV/Bsd-SOD1真核表达质粒,转染HeLa细胞,发现转染成功的细胞均发绿色荧光;RT-PCR及Western blot检测结果表明,所转染的SOD1在HeLa细胞中成功表达。结论:成功构建了能够同时表达绿色荧光蛋白和SOD1的真核表达质粒pTracer-CMV/Bsd-SOD1,为进一步研究SOD1在基因治疗中的作用奠定了基础。     

真核表达载体pEGFP-GPC3的构建及表达

目的:构建磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)真核表达载体pEGFP-GPC3,并在小鼠树突状细胞(DC)表达.方法:将质粒pCMV-SPORT6-GPC3和载体pEGFP-N1分别进行双酶切获得目的基因GPC3片段和空载体,回收纯化后用T4连接酶将两者连接并转化E.coli DH5α菌株,用EcoR I、BamH I双酶切鉴定后通过脂质体法转染到DC中,然后进行荧光检测和Western blot分析.结果:构建的真核表达载体pEGFP-GPC3,转染DC后,荧光显微镜下可见转染的DC中有EGFP-GPC3融合蛋白的表达,Western blot分析发现有相对分子质量(M,)大小约为67 000的蛋白条带.结论:成功地构建了真核表达载体pEGFP-GPC3并在转染DC后能在其中表达,为进一步研究GPC3基因的功能提供实验基础.     

胰岛-脑1基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建并鉴定表达胰岛-脑1(Islet-Brain 1,IB1)基因的真核细胞表达质粒.方法 从人胰岛细胞瘤提取总RNA,根据IB1 cDNA文库的序列利用RT-PCR扩增IB1基因.将此基因插人带有绿荧光的真核表达载体pEGFP-N1的EcoR1/KpnI酶切位点区域,携带IB1基因的真核表达质粒转染到胰岛细胞系(RINm5F),最后通过G418筛选获得稳定的携带IB1基因的胰岛细胞系.利用倒置相差荧光显微镜、流式细胞仪、Western blot鉴定的质粒及转染的细胞系.结果 RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析为840 bp的分子(IB1 AA1-280),测序分析证明与Genbank IB1 cDNA具有相同的序列.用EcoR I和Kpn I消化可见两条条带,Western blot分析证明IB1基因在RINm5F细胞表达.结论 成功构建了pEGFP-N1-IB1真核表达载体,转染到胰岛细胞系并稳定表达.     

早期B细胞因子3对HepG2细胞周期的影响

目的:克隆人早期B细胞因子3 (EBF3)基因,构建真核表达载体pEGFP/EBF3,研究人EBF3对肝癌细胞株HepG2细胞周期的影响.方法:提取人胎盘组织总RNA,采用RT-PCR技术克隆人EBF3基因,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1,重组质粒双酶切鉴定,并进行序列测定.将重组质粒转染HepG2细胞,Western blot确证EBF3-EGFP融合蛋白的表达及亚细胞定位,流式细胞术分析转染细胞周期.结果:成功获得全长人EBF3基因,经双酶切和序列测定鉴定,真核表达质粒pEGFP/EBF3构建正确,将pEGFP /EBF3导入HepG2细胞24小时后,在倒置荧光显微镜下可观察到EBF3-EGFP融合蛋白主要表达于核内.Western blot证实转染pEGFP/EBF3后24小时和48小时细胞质和细胞核中均检出相对分子质量(Mr)为87 000的EBF3-EGFP融合蛋白.转染pEGFP/EBF3后48小时和72小时,S期细胞比例均明显高于pEGFP-N1转染细胞组,表明EBF3基因的导入可诱导细胞从G1期向G2期发展,从而促进细胞增殖.结论:成功构建了真核表达质粒pEGFP/EBF3,pEGFP /EBF3转染组S期细胞比例高于pEGFP-N1转染组,提示EBF3对人肝癌细胞株HepG2细胞有促进增殖作用.