胰岛素样生长因子1对人脂肪来源的间充质干细胞向软骨细胞定向诱导分化的作用

背景:近年研究者发现胰岛素样生长因子1还可以诱导骨髓来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化,但目前尚未见胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化及在此过程中与转化生长因子β1相瓦作用的报道.目的:观察胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞定向分化的可能性及在诱导分化中和转化生长因子β1的相互作用.方法:获取脂肪来源间充质干细胞,以2×10~5 cells/cm~2的密度接种于培养瓶,使用含胰岛素样生长因子1或(和)转化生长因子β1的无胰岛素软骨诱导剂诱导脂肪来源间充质干细胞.2周后获取细胞,制备细胞爬片,进行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察细胞内高硫酸化的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原着色情况.RT-PCR检测Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan及Sox9mRNA的表达.结果与结论:加入诱导剂后,甲苯胺蓝染色显示3个诱导组细胞呈多角形,胞浆及胞膜呈蓝色异染.Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示3个诱导组细胞胞浆及胞膜呈棕黄色着色.RT-PCR检测显示胰岛索样生长因子+转化生长因子组Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan、Sox9 mRNA的表达均显著强于胰岛素样生长因子组和转化生长因子组,胰岛素样生长因子组和转化生长因子组显著强于对照组,而胰岛素样生长因子组与转化生长因子组差异无显著性意义.提示胰岛素样生长因子1可以单独诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化,表达软骨细胞特异性细胞表型,胰岛素样生长因子1与转化生长因子β1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化有协同作用.     

特定培养基条件下大鼠脂肪间充质干细胞体外定向软骨细胞的分化

目的:体外诱导大鼠脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化,并对分化细胞进行相应鉴定,观察脂肪间充质干细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性。方法:实验于2005-05/2006-05在湘雅医院中心实验室完成。①取大鼠腹股沟脂肪,消化分离脂肪间充质干细胞进行原代培养。②流式细胞仪检测第3代脂肪间充质干细胞表面CD29,CD34,CD44表达。③传3代细胞进行微团培养1d,换用含体积分数为0.01的新生牛血清、10μg/L的转化生长因子β1、6.25mg/L的胰岛素、6.25mg/L的转铁蛋白、1×10-7mol/L的地塞米松、50mg/L的维生素C的高糖DMEM诱导液,为特定培养条件。④在诱导后4,7,14d应用阿尔新兰染色、蕃红O/固绿染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学评价软骨形成情况。⑤反转录-聚合酶链反应在诱导后0和14d检测脂肪间充质干细胞前Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖mRNA的表达。结果:①脂肪间充质干细胞的形态特征:原代脂肪间充质干细胞呈短梭形、梭形及多角形,3代后呈均一长梭形。②脂肪间充质干细胞的表面标志鉴定:脂肪间充质干细胞表达CD29,CD44,基本不表达CD34。③脂肪间充质干细胞诱导后的形态特征:脂肪间充质干细胞经诱导后,由长梭形转变为三角形、多角形或短梭形,逐渐聚集成结节。④脂肪间充质干细胞诱导后的细胞化学染色结果:诱导后脂肪间充质干细胞胞外基质阿尔新兰染色、蕃红O/固绿染色、和Ⅱ型胶原免疫细胞化学着色阳性。⑤反转录-聚合酶链反应检测结果:反转录-聚合酶链反应检测未诱导脂肪间充质干细胞不表达前Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖mRNA基因,而诱导后的脂肪间充质干细胞表达前Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖mRNA基因。结论:脂肪间充质干细胞在由转化生长因子1、胰岛素、转铁蛋白等组成的特定培养基条件诱导下可以定向软骨细胞分化。     

转化生长因子β2诱导鼠脂肪间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景:转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞成骨和成软骨的促分化作用已被广泛证实.目的:假设转化生长因子β2可在体外诱导鼠脂肪间充质干细胞向成软骨细胞分化,实验拟验证其可行性.设计、时间及地点:体外细胞学实验,于2007-03/11在北京大学第三医院中心实验室完成.材料:清洁级3周龄雄性Lewis大鼠24只,用于分离培养脂肪间允质干细胞.方法:取第2代脂肪间充质于细胞,通过10μg/L外源性转化生长因子β2以离心管内微团培养、单层培养两种方式向软骨细胞进行诱导分化,培养3周.对照组单纯加入基础培养液.主要观察指标:两种湾导方式下细胞(团)形态结构的变化、Ⅱ型胶原免疫组织化学检测结果、软骨细胞特异性基因Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA的表达.结果:微团培养诱导的脂肪间充质干细胞组织块经苏木精.伊红染色显示在组织内部形成类似软骨陷窝样结构,阿尔新蓝染色呈强阳性,Ⅱ型胶原免疫组化结果显示有棕褐色强阳性颗粒,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原和Aggrecan mRNA的表达.单层培养诱导的脂肪间充质干细胞无细胞外软骨基质分泌,未发现Ⅱ型胶原蛋白和Aggrecan mRNA的表达.结论:在离心管内微团培养方式下,转化生长因子β2可以启动或促进脂肪间充质干细胞的软骨分化,且分泌软骨细胞特异性基质.简单的单层培养方式诱导失败.     

外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的影响

背景:透明质酸是关节腔滑液最主要的成分,对细胞的形态发生起着非常重要的作用,但其用于软骨缺损修复时对骨髓间充质干细胞的影响如何呢?目的:通过分析外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞体外增殖及定向分化为软骨细胞的影响,探讨关节腔内环境对骨髓间充质干细胞的作用。方法:全骨髓法+贴壁培养法分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代细胞用于实验,实验组细胞加入透明质酸诱导液,以转化生长因子β3诱导组作为阳性对照,阴性对照组加入常规培养液。分别于诱导后第7,14,21d行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达。结果与结论:经透明质酸诱导后,细胞增殖速度减慢,由长梭形变为多角形、椭圆形,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性和Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,但表达均比阳性对照组弱。结果提示,外源性透明质酸具有诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的能力,但比转化生长因子β3的诱导能力弱,关节腔内环境对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化有正性促进作用,支持透明质酸作为软骨组织工程基质使用。     

外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的影响

背景：透明质酸是关节腔滑液最主要的成分,对细胞的形态发生起着非常重要的作用,但其用于软骨缺损修复时对骨髓间充质干细胞的影响如何呢？目的：通过分析外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞体外增殖及定向分化为软骨细胞的影响,探讨关节腔内环境对骨髓间充质干细胞的作用。方法：全骨髓法＋贴壁培养法分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代细胞用于实验,实验组细胞加入透明质酸诱导液,以转化生长因子β3诱导组作为阳性对照,阴性对照组加入常规培养液。分别于诱导后第7,14,21d行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达。结果与结论：经透明质酸诱导后,细胞增殖速度减慢,由长梭形变为多角形、椭圆形,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性和Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,但表达均比阳性对照组弱。结果提示,外源性透明质酸具有诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的能力,但比转化生长因子β3的诱导能力弱,关节腔内环境对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化有正性促进作用,支持透明质酸作为软骨组织工程基质使用。     

共培养诱导人脐血间充质干细胞向软骨细胞分化

背景：研究发现共培养可诱导人源干细胞向特定细胞分化,但如何控制两种细胞间比例以最大效率获得目的细胞是研究中的难题。目的：观察人脐血问充质干细胞与兔软骨细胞按不同比例共培养后向软骨细胞分化的情况。方法：复苏人脐血间充质干细胞并进行传代,将经流式细胞仪鉴定的人脐血间充质干细胞与体外分离的兔软骨细胞按照2：1或3：1的比例共培养,并用100pg／L的胰岛素样生长因子1进行诱导。在共培养14d,提取细胞RNA和蛋白质,实时定量PCR检测聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA的表达,Westernblot检测聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白的表达。结果与结论：人脐血间充质干细胞与兔软骨细胞共培养14d,共培养的细胞聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA及蛋白的表达高于单纯胰岛素样生长因子1诱导的细胞。在人脐血间充质干细胞与软骨细胞比例相同时,加入胰岛素样生长因子1可提高细胞聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA及蛋白的表达。同时人脐血间充质干细胞与兔软骨细胞按3：1共培养更能促进细胞Ⅱ型胶原mRNA和蛋白及聚集蛋白多糖蛋白的表达;而按2：1共培养时,细胞聚集蛋白多糖mRNA表达更多。可见人脐血问充质干细胞与兔软骨细胞共培养后可诱导人脐血间充质干细胞向软骨细胞分化,且按3：1的比例共培养可获得更多的软骨细胞。     

人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的诱导条件

目的:分析人骨髓间充质干细胞分离、纯化、体外扩增及其向软骨细胞分化的条件,为人骨髓间充质干细胞用于修复损伤的软骨组织提供依据。方法:实验于2005-03/2006-04在南昌大学医学院生化与分子生物学教研室完成。实验材料:无菌条件下采集无血液系统疾病和家族遗传史的28～65岁成人骨髓8份,进行骨髓间充质干细胞分离与培养,骨髓采集经患者及医院同意,并签署知情同意书。实验方法:取第3代对数生长期骨髓间充质干细胞,实验组使用特定的、内含2mg/L胰岛素、3mg/L转铁蛋白、1mmol/L丙酮酸、100nmol/L地塞米松和10μg/L转化生长因子β1的低糖DMEM培养基诱导人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,对照组细胞以低糖DMEM基础培养液培养。倒置显微镜下观察细胞形态,诱导7,14d采用半定量RT-PCR方法检测细胞软骨特异性Ⅱ型胶原表达,蕃红花O-亮绿染色分析蛋白多糖粘多糖含量,观察细胞分化情况。结果:①光镜观察成人骨髓间充质干细胞的形态变化:培养7d细胞集落明显,集落中央为数个至数十个圆形细胞,周围变形细胞围绕中央细胞呈放射状生长。培养14d细胞呈平行状或旋涡状排布,细胞排列紧密。②骨髓间充质干细胞向软骨细胞的诱导分化:实验组细胞生长较对照组慢,培养7d后细胞大多呈椭圆形或三角形,部分细胞伸出似触角突起,培养14d细胞变形较明显,排列较为紧密,细胞突起多见,突起间相连,呈较明显软骨细胞形态特征。③骨髓间充质干细胞的番红花-O染色:实验组骨髓间充质干细胞蕃红花O-亮绿呈深染色,对照组人骨髓间充质干细胞呈阴性染色。④RT-PCR检测软骨特异性的Ⅱ型胶原COL2A1 mRNA表达:实验组诱导培养7,14d人骨髓间充质干细胞有Ⅱ型胶原COL2A1 mRNA表达,400～500bp条带间可见明显的荧光条带,诱导培养14d时表达更明显。对照组未见Ⅱ型胶原COL2A1 mRNA表达。结论:采用直接贴壁培养法成功分离和培养出人骨髓间充质干细胞,并将人骨髓间充质干细胞诱导分化成软骨细胞,该软骨细胞具有软骨细胞的形态、生化特征。     

体外诱导的人脂肪间充质干细胞源性软骨细胞体内成骨活性

目的:目前对间充质干细胞向软骨细胞诱导分化主要包括体内诱导和体外诱导两种方式,前者依靠体内微环境,随机性大且难以进行监控和调整.本实验探讨体外诱导人脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化,以及诱导后细胞在裸鼠体内的成软骨能力.方法:实验于2006-08/2007-05在中南大学湘雅医院中心实验室完成.①对象与材料:皮下脂肪组织来源于股骨颈骨折手术患者6例,年龄25～64岁,对实验及治疗均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.清洁级裸鼠5只,体内成软骨实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.离心管容量20 mL,由GeneRay公司生产.②实验方法:将皮下脂肪组织剪碎,I型胶原酶消化法分离培养脂肪间充质干细胞,待细胞铺满瓶底80%时胰酶消化传代.传至第6代时收集 5×106个细胞,用含1%新生牛血清、高糖DMEM、10 μg/L转化生长因子β1、37.5 mg/L维生素C、6.25 mg/L胰岛素、6.25 mg/L转铁蛋白、10-7 mol/L地塞米松的软骨细胞诱导剂重悬于无支架离心管内.③实验评估:诱导过程中观察细胞聚集状态.诱导2周后采用苏木精-伊红染色、RT-PCR、Western blot对细胞形态及功能变化进行检测.将诱导后细胞与纤维蛋白原凝胶混合,植入裸鼠皮下,3周后切取植入组织块,苏木精-伊红染色及II型胶原免疫组化染色观察体内成软骨情况.结果:①诱导后细胞聚集状态:诱导2 d后脂肪间充质干细胞自行聚集为一条状细胞团,1周后细胞团聚集呈球状.②苏木精-伊红染色结果:未见有软骨陷窝形成.③RT-PCR检测结果:细胞团内Ⅱ型胶原蛋白和Sox9 mRNA均呈阳性表达.④Western blot检测结果:细胞团内有较强的Ⅱ型胶原蛋白和Aggrecan表达.⑤体内成软骨情况:植入裸鼠皮下的组织块内有大量软骨陷窝及II型胶原蛋白形成.结论:①在无支架离心管内,脂肪间充质干细胞经软骨诱导剂作用后具有典型的软骨细胞表型,但未形成成熟软骨组织所具备的软骨陷窝.②诱导后细胞与凝胶复合种植于裸鼠体内,可形成具有典型软骨特征的组织.     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景:骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能.目的:体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件.方法:取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3 代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1 的软骨分化诱导剂,2 周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达.结果与结论:可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖.经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性.10 μg/L 的转化生长因子β1 诱导成软骨分化能力最强.     

脂肪基质干细胞小肠黏膜下层双面复合的体外成软骨诱导

背景：使用体外构建的组织工程软骨治疗软骨损伤是目前的研究热点,材料与支架材料的选择仍有较多问题尚待解决。目的：观察脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物在体外经成软骨诱导培养基诱导分化的效果。方法：将第3代脂肪基质干细胞接种于复水后的小肠黏膜下层双面,加入成软骨诱导培养基,于体外诱导培养7d和14d后,使用实时荧光定量RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA,免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原蛋白,甲苯胺蓝染色观察细胞外基质,扫描电镜观察体外成软骨诱导14d后细胞在支架材料上的生长状况。结果与结论：Ⅱ型胶原mRNA实时荧光定量RT-PCR检测提示,体外成软骨诱导后7,14d的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物Ⅱ型胶原mRNA的标化值与未诱导的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物差异有显著性意义（P〈0.05）,诱导14d与诱导7d相比,差异亦有显著性意义（P〈0.05）。脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物成软骨诱导后14d,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阳性,甲苯胺蓝染色可见基质异染,未诱导的复合物Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阴性。扫描电镜检测显示诱导14d时,细胞长满支架材料的双面。提示脂肪基质干细胞复合至小肠黏膜下层后,在体外经成软骨诱导培养基成软骨诱导后,能够向成软骨细胞分化。