稳斑汤含药血清对巨噬细胞泡沫化自噬相关蛋白LC3B和Beclin 1表达的影响

目的探讨稳斑汤防治动脉粥样硬化的可能作用机制。方法 20只SD大鼠随机分为空白组及稳斑汤低、中、高浓度组各5只。稳斑汤低、中、高浓度组分别给予稳斑汤4.275、8.55、17.1 g/(kg·d)灌胃,空白组给予4 ml蒸馏水灌胃,每天1次,连续灌胃7天。灌胃第8天腹主动脉取血,离心后分离血清。体外培养小鼠巨噬细胞,分为空白对照组、模型组、雷帕霉素组及稳斑汤低、中、高浓度组,每组6孔。除空白对照组外其余各组均进行巨噬细胞泡沫化。空白对照组及模型组予10%大鼠空白血清培养;雷帕霉素组用雷帕霉素10μl/孔(终浓度10 nmol/L)培养;稳斑汤低、中、高浓度组分别用10%稳斑汤低、中、高浓度含药血清200μl/孔培养。48h后收集细胞,在透射电镜下观察各组细胞自噬体的变化,Western Blot法检测各组细胞LC3B和Beclin 1蛋白表达水平。结果透射电镜下观察到,空白对照组无明显自噬体出现,模型组可见少量自噬体出现;与模型组比较,稳斑汤各浓度组与雷帕霉素组的自噬体数量均明显增加,雷帕霉素组数量更多。与空白对照组比较,其余各组LC3B和Beclin 1蛋白表达水平均升高(P<0.05);与模型组比较,稳斑汤各浓度组及雷帕霉素组LC3B和Beclin 1蛋白表达水平均升高(P<0.05);与雷帕霉素组比较,稳斑汤高浓度组LC3B和Beclin 1蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论稳斑汤含药血清能够上调巨噬细胞泡沫化自噬相关蛋白LC3B和Beclin 1表达,促进泡沫化的巨噬细胞的自噬,从而抑制巨噬细胞泡沫化的进展,这可能是稳斑汤防治动脉粥样硬化的分子机制之一。     

黄芪甲苷介导Akt/mTOR/HIF-1α通路调控氧糖剥夺PC12细胞自噬的机制研究

探讨黄芪甲苷(astragalosideⅣ,AS-Ⅳ)对氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation, OGD)诱导的PC12细胞自噬损伤的保护作用及可能机制。体外建立OGD PC12细胞自噬损伤模型,PC12细胞分为正常组,OGD组,AS-Ⅳ低、中、高剂量组,阳性药右美托咪定(DEX)组。MTT法检测PC12细胞存活率,透射电子显微镜观察自噬小体及自噬溶酶体,MDC荧光染色法观测自噬小体的荧光强度,Western blot检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、HIF-1α自噬相关蛋白表达情况。与正常组比较,OGD组细胞存活率显著降低(P<0.01),自噬小体显著增多(P<0.01),MDC荧光强度显著增强(P<0.01),Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、HIF-1α显著上调(P<0.05或P<0.01),p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR显著下调(P<0.05或P<0.01)。与OGD组比较,AS-Ⅳ低、中剂量组及DEX组细胞存活率显著提高(P<0.01...     

健脾益肾化痰方通过VEGF/PI3K/AKT/FOXO1诱导肺鳞癌SK-MES-1细胞自噬的实验研究北大核心CSCD

目的:观察健脾益肾化痰方含药血清对肺鳞癌SK-MES-1细胞增殖、凋亡、自噬及SK-MES-1细胞内Beclin1、LC3、VEGFR、PI3K、AKT、FOXO1相关蛋白的影响,探讨健脾益肾化痰方通过上述蛋白诱导肺鳞癌细胞SK-MES-1自噬的可能作用机制。方法:将40只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、32.2 g/kg健脾益肾化痰方组,各组分别灌胃生理盐水或药物,连续7 d后收集血清;采用CCK-8法测定人肺鳞癌细胞株的存活率;用流式细胞仪检测细胞凋亡;激光共聚焦显微镜观察GFP-LC3脂质体转染干预肺鳞癌细胞后自噬发生情况;Western Blot法检测对人肺鳞癌细胞株SK-MES-1细胞Beclin1蛋白和LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ、VEGFR、PI3K、AKT、FOXO1相关蛋白表达的影响。结果:32.2 g/kg健脾益肾化痰方含药血清各浓度组均能够有效抑制肺鳞癌SK-MES-1细胞增殖,其抑制率与药物浓度呈正相关;与正常对照组相比,32.2 g/kg健脾益肾化痰方16%含药血清组使SK-MES-1细胞凋亡率明显增高(P<0.05);8%、16%含药血清组自噬小体显著增多(P<0.05);16%含药血清组SK-MES-1细胞内自噬相关蛋白Beclin1、LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ表达显著上调(P<0.01);FOXO1蛋白表达显著上调,VEGFR、PI3K、AKT蛋白表达显著下调(P<0.01)。结论:健脾益肾化痰方含药血清能够诱导肺鳞癌SK-MES-1细胞发生自噬,其作用机制可能是通过调节VEGF/PI3K/AKT/FOXO1信号通路,上调SK-MES-1细胞内Beclin1、LC3蛋白表达,促进LC3B-Ⅰ转化为LC3B-Ⅱ有关。     

薯蓣皂苷元对人骨肉瘤细胞自噬的影响

目的 探讨薯蓣皂苷元对人骨肉瘤细胞自噬的影响。方法 MTT法检测薯蓣皂苷元对人骨肉瘤MG63和U2OS细胞增殖的影响,透射电镜技术观察细胞超微结构,免疫荧光法观察细胞自噬蛋白Beclin1表达,Western blot法检测细胞自噬分子标记物LC3、Beclin1和PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达。薯蓣皂苷元联合PI3K通路抑制剂LY294002处理MG63和U2OS细胞,RT-qPCR法检测细胞Beclin1 mRNA表达;联合自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA)处理MG63和U2OS细胞,MTT法检测细胞增殖抑制率,Western blot法检测细胞cleaved-caspase3蛋白表达,RT-qPCR法检测细胞caspase3 mRNA表达。结果 薯蓣皂苷元能抑制骨肉瘤MG63和U2OS细胞增殖,促使自噬体生成,增加LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达(P<0.05,P<0.01),降低LC3 I蛋白表达(P<0.01),可抑制PI3K/Akt/mTOR通路蛋白磷酸化水平(P<0.05,P<0.01);联合自噬抑制剂干预后...     

丹参酮ⅡA对人冠状动脉内皮细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的?观察丹参酮ⅡA（STS）对缺氧/复氧（H/R）所致人冠状动脉内皮细胞（HCAEC）损伤的保护作用，并探讨其作用机制。方法?将HCAEC分为对照、H/R、STS组。对照组正常培养，H/R、STS组接受H/R干预，STS组采用100μg/mL的STS处理。采用 Hoechst 33258染色测定细胞的凋亡情况，免疫荧光法检测自噬相关蛋白LC3的表达，Western Blot检测内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、Beclin1蛋白、LC3蛋白、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路相关蛋白GSK-3β、p-GSK-3β、mTOR、p-mTOR的表达。CCK8法测定50、100μg/mL STS对3-甲基腺嘌呤（3-MA）干预H/R组后细胞活性的影响。结果?与对照组比较，H/R组 HCAEC细胞凋亡率、LC3、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ及p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达升高（P<0.05，P<0.01），eNOS及p-mTOR/mTOR表达降低（P<0.01）；与H/R组比较，STS组LC3、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、eNOS及p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达增加（P<0.05，P<0.01），HCAEC细胞凋亡率及p-mTOR/mTOR表达降低（P<0.05，P<0.01）。50、100μg/mL STS均可使3-MA干预后的H/R组HCAEC存活率升高（P<0.05）。结论? STS可能通过调节GSK-3β/mTOR信号通路，抑制内皮细胞凋亡，从而减缓H/R损伤过程中内皮细胞损伤。     

RSV诱导树突细胞自噬对哮喘小鼠气道反应性的影响及五虎汤的干预作用

目的:探讨呼吸道合胞病毒诱导的树突细胞自噬对哮喘小鼠气道反应性的影响及五虎汤的干预作用。方法:160只SPF级雌性BALB/c小鼠,用呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)复合鸡卵蛋白(Ovalbumin,OVA)雾化吸入激发哮喘,造模成功后随机分为正常对照组、模型对照组、地塞米松1.8 mg/kg组、雷帕霉素1 mg/kg组及五虎汤6.4 g/kg、3.2 g/kg、1.6 g/kg组,并予以相应药物干预两周。使用动物呼吸机检测小鼠气道反应性值;HE染色法观察小鼠肺组织病理学改变;Masson和PAS染色法观察气道胶原沉积和粘液储备情况;Western Blot法测定α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ型(microtubule-asso ciated protein 1 light chain 3Ⅱ,LC3Ⅱ),程序性死亡受体-1(programmed cell death-1,Beclin-1)、自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3 I型(microtubule-asso ciated protein 1 light chain 3 I,LC3-I)蛋白水平;透射电镜检查肺组织自噬小体。结果:与正常对照组比较,模型对照组气道反应性显著增高(P0.01),支气管管腔狭窄,血管及支气管周围大量炎性细胞浸润,气道黏液储备指数和气道胶原沉积指数明显增高(P0.01),小鼠肺组织中α-SMA、TGF-β、LC3-Ⅱ/LC3-I、Beclin-1蛋白相对表达均显著升高(P0.01),DC自噬小体数量增加(P0.05);与模型对照组比较,五虎汤6.4 g/kg、3.2 g/kg、1.6 g/kg组及雷帕霉素1 mg/kg组小鼠气道反应性明显下降(P0.01),气道胶原沉积情况显著下降(P0.01),肺组织中α-SMA和TGF-β蛋白表达均显著下调(P0.01),五虎汤6.4 g/kg、3.2 g/kg剂量组及雷帕霉素1 mg/kg组肺组织树突细胞中自噬小体数量明显增多(P0.01),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表达显著增高(P0.01)。结论:RSV感染可以应激性引起肺组织树突细胞自噬水平的上调,而树突细胞自噬水平的上调有利于促进机体的抗病毒反应,降低哮喘小鼠气道反应性;五虎汤对此的改善作用可能与其上调哮喘小鼠肺组织中树突细胞自噬水平有关。     

大黄素抑制HBSS诱导的肾小管上皮细胞自噬的分子机制

目的:探讨大黄素(emodin)对饥饿诱导的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)自噬的调节作用及其可能机制。方法:首先,用Western blot检测大黄素对Hank's平衡盐溶液(Hank's balanced salt solution,HBSS)饥饿诱导的细胞自噬标志性蛋白——哺乳动物同族物微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)Ⅰ/Ⅱ表达水平的影响;其次,用红色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3(redfluorescent protein-microtubule associated protein light chain3,RFP-LC3)质粒瞬时转染NRK-52E细胞,以HBSS(1 mL)联合巴弗洛霉素A1(10 nmol·L^-1)处理,予大黄素(10 μmol·L^-1)干预后,荧光显微镜下观察RFP-LC3荧光颗粒的变化;然后,以哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制剂雷帕霉素(100 nmol·L^-1)干预,观察阻断mTOR信号通路对大黄素抑制细胞自噬作用的影响;最后,通过诱导内源性mTOR抑制蛋白DEPTOR(DEP domain-containing mTOR-interacting protein)过表达,进一步评估mTOR信号通路对大黄素抑制细胞自噬的影响。结果:HBSS饥饿可诱导NRK-52E细胞LC3Ⅱ蛋白高表达,大黄素干预后可逆转HBSS诱导的LC3Ⅱ蛋白表达增加;HBSS联合巴弗洛霉素A1处理后可引起RFP-LC3荧光颗粒数目增多,大黄素干预后可抑制其数目的增加;雷帕霉素与大黄素、HBSS联合干预后,雷帕霉素可以恢复HBSS诱导的NRK-52E细胞LC3Ⅱ蛋白表达水平;而过表达内源性mTOR抑制蛋白DEPTOR同样可以阻断大黄素对LC3Ⅱ蛋白表达的抑制作用。结论:大黄素可以抑制HBSS诱导的肾小管上皮细胞LC3Ⅱ蛋白表达和自噬活化,其阻断自噬的作用可能是通过mTOR信号通路介导的。     

电针、艾灸预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌自噬相关蛋白LC 3、Beclin 1表达的影响

目的:观察针灸预处理对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠心肌自噬相关蛋白LC 3、Beclin 1表达的影响,探讨针灸预处理在MIRI过程中对自噬调控的作用机制。方法:SD大鼠随机分为假手术组、模型组、缺血预适应(IP)组、电针组和艾灸组,每组8只。冠状动脉结扎法建立大鼠MIRI模型。电针组及艾灸组造模前分别电针或艾灸"内关"穴,每次20min,每日1次,连续7d。HE染色法及透射电镜检测左心室心肌病理形态学的变化,TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况及凋亡指数,Western blot法检测LC 3、Beclin 1蛋白在心肌细胞中的表达。结果:模型组心肌损伤较严重,心肌细胞排列紊乱、边界模糊,炎性细胞浸润,部分横纹坏死、溶解,线粒体结构紊乱、模糊,空泡化严重,并出现大量双层膜结构的自噬小体;IP组、电针组及艾灸组心肌损伤较模型组轻微,肌纤维大多正常,肌丝间局灶性水肿,线粒体丰富伴空泡增多,偶见自噬体。与假手术组比较,模型组凋亡指数、LC 3Ⅱ及Beclin 1蛋白表达水平、LC 3Ⅱ/LC 3Ⅰ均明显升高(P0.01),LC 3Ⅰ蛋白表达显著下降(P0.01);与模型组比较,IP组、电针组及艾灸组凋亡指数、LC 3Ⅱ及Beclin 1蛋白表达水平、LC 3Ⅱ/LC 3Ⅰ均明显降低(P0.01),LC 3Ⅰ蛋白表达明显升高(P0.05,P0.01);电针组凋亡指数、LC 3Ⅱ及Beclin 1蛋白表达水平、LC 3Ⅱ/LC 3Ⅰ明显低于IP组及艾灸组(P0.05),而LC 3Ⅰ蛋白表达水平则显著高于IP组及艾灸组(P0.01)。结论:IP、电针或艾灸"内关"穴预处理对MIRI大鼠均具有保护作用,可对MIRI大鼠心肌的自噬产生调节作用,尤以电针最佳,而这种适度调节MIRI过程中的自噬水平可能与下调LC 3Ⅱ、Beclin 1蛋白的表达有关。     

基于Akt/mTOR信号通路探讨洋地黄毒苷调控甲状腺滤泡上皮细胞自噬与凋亡的机制

目的 探究洋地黄毒苷对脂多糖刺激下的人甲状腺滤泡上皮细胞系Nthy-roi3-1凋亡与自噬的影响及其作用机制。方法 (1)将Nthy-roi3-1细胞分为对照组、脂多糖组、脂多糖+洋地黄毒苷低剂量组、脂多糖+洋地黄毒苷中剂量组及脂多糖+洋地黄毒苷高剂量组,各组进行对应处理后,CCK-8法检测各组细胞活力,免疫荧光染色观察各组细胞自噬标志物微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达情况,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot法检测各组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Bcl-2同源结构域蛋白抗体(Beclin 1)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p70S6K蛋白表达情况。(2)将Nthy-roi3-1细胞分为对照组、脂多糖组、脂多糖+洋地黄毒苷组、脂多糖+洋地黄毒苷+自噬抑制剂组,各组进行对应处理后,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot法检测各组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR及p70S6K蛋白表达情况。结果 (1...     

温阳化饮、益气活血法对慢性心力衰竭大鼠自噬-凋亡机制的影响

目的:探讨温阳化饮、益气活血法组方强心胶囊对大鼠心肌细胞自噬相关蛋白表达的影响及其与凋亡之间的关系。方法:90只SD大鼠随机均分为假手术组、模型组、西药组、强心胶囊高、中、低剂量组,各组大鼠成模后给予相应剂量药物灌胃给药,每日1次,连续28 d。超声心动图评价大鼠心脏功能。Western blotting法检测心肌组织自噬相关蛋白5(Atg5)、Bcl-2、Beclin 1、LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ及TUNEL法检测大鼠心肌细胞凋亡。结果:与假手术组比较,模型组大鼠左心室收缩末期与舒张末期直径明显增大,左心室射血分数与缩短分数降低,心肌组织中Bcl-2、Beclin 1与Atg5蛋白表达降低,LC3BⅡ/Ⅰ比值降低,细胞凋亡数量增加(P0.05或P0.01)。与模型组比较,各药物干预组大鼠心脏收缩功能均表现为明显改善,心肌组织中Bcl-2、Beclin 1与Atg5蛋白表达增加,LC3B I/LC3B II转换增加,细胞凋亡数量减少(P0.05或P0.01)。与西药组比较,强心胶囊高剂量组心肌组织中Bcl-2、Beclin 1及Atg5蛋白表达增加,LC3B I/LC3B II转换增加,细胞凋亡数量减少更为明显(P0.05或P0.01)。结论:强心胶囊通过上调慢性心力衰竭大鼠心肌细胞自噬,抑制细胞凋亡,发挥改善心脏功能的作用。     

芪玉三龙汤调节mTOR/Beclin1/LC3信号轴相关分子的表达诱导肺癌A549细胞自噬

目的 从细胞水平探讨芪玉三龙汤干预肺癌A549细胞对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/自噬关键分子酵母Atg6同系物（Beclin1）/微管相关蛋白1轻链3（LC3）信号轴关键分子表达的影响。方法 选择肺癌人A549细胞作为研究对象,采用细胞增殖检测试剂盒（CCK-8）法检测芪玉三龙汤含药血清对A549细胞活性的影响;原位末端标记法（TUNEL）,透射电镜（TEM）及实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）,蛋白免疫印迹法（WB）分别检测芪玉三龙汤对A549细胞凋亡、自噬体形成及自噬标记分子表达的影响。结果 芪玉三龙汤血清能以浓度依赖性的方式抑制细胞活性;与空白血清组比较,芪玉三龙汤血清组A549细胞的凋亡数量显著增多（P<0.01）,自噬体形成增加;与空白血清组比较,芪玉三龙汤血清组A549细胞的mTOR mRNA和蛋白表达显著降低（P<0.01）,Beclin1,自噬相关基因5（Atg5）,自噬相关基因13（Atg13） mRNA和蛋白表达水平均显著升高（P<0.01）。结论 芪玉三龙汤能够诱导肺癌A549细胞发生自噬,其具体作用机制可能与其下调mTOR的表达,上调Beclin1,Atg5,Atg13,LC3的表达,促进LC3Ⅰ转化为LC3Ⅱ有关。     

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路的三七总皂苷调控自噬抗H9c2细胞缺氧/复氧损伤机制研究

目的探讨三七总皂苷(PNS)能否通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控自噬从而减轻H9c2细胞缺氧/复氧损伤机制。方法将H9c2细胞分为正常组、缺氧/复氧(A/R)组、A/R+PNS组、A/R+PNS+雷帕霉素(Rapa)组、A/R+Rapa组、A/R+羟氯喹(HCQ)组、A/R+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组。通过缺氧6 h、复氧2 h建立H9c2细胞A/R模型。CCK-8法检测细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒检测细胞损伤,Western blot检测自噬相关蛋白Atg5、p62、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白PI3K、Akt、m TOR的表达,荧光法观察细胞自噬流。结果与正常组比较,A/R组H9c2细胞存活率明显下降,细胞损伤率明显升高(P0.05),自噬相关蛋白Atg5、Beclin-1表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显升高(P0.05),自噬体和自噬溶酶体数量显著增加,自噬流显著增强(P0.05);与A/R组比较,用PNS预处理后,H9c2细胞存活率明显上升,细胞损伤率明显降低(P0.05),自噬相关蛋白Atg5、Beclin-1表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显降低(P0.05),p62蛋白表达明显升高,与自噬抑制剂HCQ、3-MA作用相似,荧光结果显示,PNS对自噬流有明显抑制作用(P0.05);PNS预处理后p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达明显升高(P0.05)。结论 PNS能有效减轻H9c2细胞A/R损伤,其机制与激活PI3K/Akt/mTOR信号通路从而抑制自噬流相关。     

宣肺平喘胶囊基于p38磷酸化途径对COPD自噬影响研究

目的 探讨宣肺平喘胶囊是否通过抑制p38磷酸化而影响香烟烟雾提取物诱导的支气管上皮细胞自噬。方法 将支气管上皮细胞分为空白组、香烟烟雾提取物组、宣肺平喘低剂量组、宣肺平喘中剂量组、宣肺平喘高剂量组。以香烟烟雾提取物诱导支气管上皮细胞建立慢性阻塞性肺疾病(COPD)细胞模型,空白组以空白血清培养,宣肺平喘各组加入宣肺平喘含药血清培养。CCK-8法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫荧光显微镜观察自噬情况,Western blot法检测细胞中p38、p-p38、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白表达情况,RT-PCR法检测细胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1 mRNA表达情况。结果 与空白组比较,香烟烟雾提取物组细胞活力均显著降低(P<0.05),细胞凋亡率、自噬水平和p-p38、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白表达量及LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1 mRNA表达量均显著增高(P均<0.05);与香烟烟雾提取物组比较,宣肺平喘各组细胞活力均显著增加(P均<0.05),细胞凋亡率、自噬水平和p-p38、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ...     

黄连温胆汤对胰岛素抵抗大鼠肝脏脂质蓄积的影响

目的观察黄连温胆汤对胰岛素抵抗(IR)大鼠肝脏脂质蓄积的影响,从自噬角度探讨其作用机制。方法50只雄性SD大鼠随机分为空白组10只和造模组40只,造模组采用高脂高糖饮食诱导IR大鼠模型,将成模大鼠随机分为模型组、黄连温胆汤组和二甲双胍组,分别予蒸馏水、黄连温胆汤药液和二甲双胍溶液灌胃,连续8周。透射电镜观察大鼠肝组织自噬小体形成情况;油红O染色观察肝脏脂质蓄积;ELISA检测大鼠空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS),计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);GPO-PAP法检测大鼠肝组织三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)含量;Western blot检测肝组织LC3、p62、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和p-mTOR蛋白表达;RT-PCR检测肝组织mTOR mRNA表达。结果与空白组比较,模型组大鼠肝组织红色脂滴明显增多,并有少量自噬小体形成,FPG、FINS和HOMA-IR明显升高(P<0.01),肝组织TC、TG含量明显增加(P<0.05,P<0.01),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高,p62蛋白表达降低,p-mTOR/mTOR比值降低(P<0.01);与模型组比较,黄连温胆汤组和二甲双胍组大鼠肝组织红色脂滴数量减少,未见明显自噬小体,FPG、FINS和HOMA-IR明显降低(P<0.05,P<0.01),肝组织TC、TG含量减少(P<0.05,P<0.01),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低,p62蛋白表达升高,p-mTOR/mTOR比值升高(P<0.05,P<0.01)。各组大鼠肝组织mTOR mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论黄连温胆汤可改善IR大鼠肝脏脂质蓄积,其机制与上调大鼠肝组织p-mTOR蛋白表达,抑制肝脏自噬有关。     

姜黄素联合雷帕霉素诱导去势难治性前列腺癌Pten-CaP8细胞自噬及凋亡研究

目的探讨姜黄素联合雷帕霉素对去势难治性前列腺癌(CRPC)Pten-CaP8细胞增殖、自噬及凋亡的影响。方法将不同浓度的姜黄素单独或与雷帕霉素共同处理Pten-CaP8细胞24 h后,MTT法检测细胞增殖,光镜下观察细胞形态,Westernblotting法检测相关蛋白表达。结果姜黄素联合雷帕霉素可显著抑制Pten-CaP8细胞增殖(P<0.05),上调LC3-II/LC3-I表达,诱导PARP裂解,还可下调p-AKT(S473)、p-S6(S240/244)、AR(N-20)和Cyclin D1蛋白表达水平,使Pten-CaP8细胞形态变短且胞浆内出现空泡改变。结论姜黄素联合雷帕霉素可共同诱导Pten-CaP8细胞自噬及凋亡且效果显著,两者协同抗癌机制与其拮抗PI3K/Akt/mTOR信号通路相关。     

抑制AMPK观察清燥救肺汤对肺癌细胞自噬启动相关蛋白表达的影响

目的 观察应用腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）抑制剂（compound C）后，清燥救肺汤对肺癌细胞自噬启动相关蛋白AMPK，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），UNC-51样激酶1（ULK1）表达的影响。方法 雄性C57BL/6J小鼠随机分为模型组，环磷酰胺（CTX）组（50 mg·kg^-1），清燥救肺汤组（11 g·kg^-1），AMPK抑制剂组（10 mg·kg^-1），清燥救肺汤加AMPK抑制剂组（清燥加抑制剂组）（11 g·kg^-1+10 mg·kg^-1）。小鼠右腋皮下注射Lewis肺癌细胞构建肺癌荷瘤模型。造模24 h后，CTX组腹腔注射给药，隔日1次，共7次，AMPK抑制剂组与清燥加抑制剂组腹腔注射compound C，每日1次，共14 d。清燥救肺汤组和清燥加抑制剂组，造模前后14 d均以中药设定剂量灌胃给药。实验结束后处死各组小鼠并取荷瘤组织，统计各组瘤质量；透射电镜（TEM）观察各组肺癌组织自噬溶酶体的生成情况；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测AMPK，磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK），mTOR，磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR），ULK1，磷酸化UNC-51样激酶1（p-ULK1），微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）和p62蛋白的表达；苏木素-伊红（HE）染色观察各组肺癌组织病理学变化。结果 与模型组比较，清燥救肺汤组瘤质量降低（P<0.01），电镜下发现自噬溶酶体生成，p-AMPK，p-ULK1，LC3B，LC3B-Ⅱ蛋白表达和p-AMPK/AMPK，p-ULK1/ULK1，LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ均升高（P<0.05，P<0.01），p-mTOR，p62蛋白表达和p-mTOR/mTOR均降低（P<0.05）。与清燥救肺汤组比较，清燥加抑制剂组电镜下未见自噬溶酶体生成，p-AMPK，p-ULK1，LC3B，LC3B-Ⅱ蛋白表达和p-AMPK/AMPK，p-ULK1/ULK1，LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ均明显降低（P<0.05，P<0.01），p62蛋白表达升高（P<0.05）。HE染色结果显示，各给药组肺癌组织与模型组比较，病理有明显改善。结论 清燥救肺汤能促进自噬发生标志蛋白LC3B-Ⅱ升高及p62蛋白表达降低从而诱导自噬发生，其自噬启动机制可能不是调控AMPK/mTOR/ULK1通路介导，而是通过AMPK/ULK1通路实现的。     

半枝莲总黄酮通过PI3K/AKT/mTOR通路诱导肿瘤细胞自噬的体内实验研究

该研究拟从体内角度研究半枝莲总黄酮(TF-SB)的抗肿瘤作用,并探讨TF-SB对肿瘤细胞自噬的影响及其对PI3K/AKT/mTOR通路的调控作用,为TF-SB的抗肿瘤作用提供实验依据。实验以黑色素瘤荷瘤小鼠模型为研究对象,分为空白对照组、雷帕霉素组(Rap,1.5 mg·kg~(-1))、TF-SB高、中、低剂量组(200,100,50 mg·kg~(-1)),每天给药1次,连续用药11 d,通过测量肿瘤的体积及抑瘤率,来观察TF-SB对黑色素瘤生长的抑制效果;通过TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况,来进一步验证TF-SB的抗肿瘤活性;通过Western blot法检测LC3-Ⅰ,LC3-Ⅱ的蛋白表达,计算LC3-Ⅱ对LC3-Ⅰ的相对表达量,探讨TF-SB对肿瘤细胞自噬的诱导作用;通过检测PI3K/AKT/mTOR通路标志蛋白的磷酸化水平,研究TF-SB诱导细胞自噬的分子机制。结果表明,TF-SB可有效抑制荷瘤小鼠体内黑色素瘤的生长,减小肿瘤体积、提高抑瘤率,并且可以显著增加肿瘤细胞凋亡指数,增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ,抑制p-PI3K,p-AKT及p-mTOR的蛋白表达水平,与对照组比较有显著性差异(P0.05,P0.01或P0.001)。由此可见,半枝莲总黄酮具有抑制体内黑色素瘤生长的作用,其机制可能与通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路,诱导肿瘤细胞自噬及凋亡有关。     

参苓白术散抗炎症性肠病作用与调节肠上皮细胞自噬的关系探讨

目的:探讨参苓白术散通过调节肠上皮细胞自噬对5%葡聚糖硫酸钠(DSS)所致小鼠炎症性肠病(IBD)的改善作用。方法:84只BALB/c小鼠随机分为7组,每组12只。除正常组之外,5%DSS自由饮用7 d诱导急性炎症性肠病,治疗组分别给予参苓白术散高、中、低剂量(12,6,3 g·kg~(-1)·d~(-1)),美沙拉嗪(2 g·kg~(-1)·d~(-1)),自噬诱导剂雷帕霉素(4 mg·kg~(-1)·d~(-1))灌胃。苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠结肠组织的病理形态学变化;透射电镜检测肠上皮细胞自噬体形成情况;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ,磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K),哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR),泛素结合蛋白~(-1)(p62),Beclin1磷酸化,ULK1,4EBP蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组小鼠结肠黏膜上皮细胞广泛缺失,腺体大多数不完整,呈结肠炎改变,LC3-Ⅱ含量明显降低(P 0. 05),自噬不明显,而自噬水平增加,结肠组织中自噬通路蛋白PI3K,mTOR,p-p62磷酸化程度及ULK1蛋白表达明显升高(P 0. 05),Beclin1磷酸化程度及4EBP蛋白表达明显降低(P 0. 05);与模型组比较,参苓白术散中、高剂量组,美沙拉嗪组及雷帕霉素组结肠组织明显改善,LC3-Ⅱ含量均明显升高(P 0. 05),参苓白术散高、中、低剂量组,美沙拉嗪组及其对应的抑制剂组可明显抑制PI3K,mTOR,p-p62磷酸化,降低ULK1蛋白表达,促进Beclin1磷酸化及升高4EBP蛋白表达(P 0. 05)。结论:参苓白术散抗DSS诱导的IBD的作用与调节肠上皮细胞自噬通路蛋白PI3K,mTOR,p62的磷酸化有关。     

葛根素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡与自噬及其分子机制研究

[目的] 探索葛根素（Puerarin）诱导人肝癌HepG2细胞凋亡与自噬及其可能的分子机制。[方法] 以二甲基亚砜（DMSO，空白组）、葛根素（50、100、200 μg/mL）、顺铂20 μg/mL分别干预对数生长期人肝癌HepG2细胞。48 h后，CCK-8法检测细胞增殖抑制率，Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡水平，吖啶橙染色法观察细胞自噬状况，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、激活型半胱氨酸蛋白酶（Cleaved Caspase-3）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、酵母ATG6同源物（Beclin1）、微管相关蛋白1轻链3（LC3）蛋白表达。[结果] 与空白组比较，葛根素100、200 μg/mL组和顺铂20 μg/mL组HepG2细胞增殖抑制率和凋亡率显著升高（P<0.01），自噬溶酶体数量明显增多（P<0.01），p-Akt、p-mTOR、bcl-2表达明显下调而Cleaved Caspase-3、Bax、Beclin1、LC3-I、LC3-Ⅱ表达明显上调（P<0.05或P<0.01），Akt磷酸化（p-Akt/Akt比值）降低且Bax/bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高（P<0.01）。与顺铂20 μg/mL组比较，葛根素200 μg/mL组细胞增殖抑制率和凋亡率显著升高（P<0.05或P<0.01），自噬溶酶体数量明显增多（P<0.05），p-Akt、p-mTOR表达下调而Cleaved Caspase-3、Bax、Beclin1、LC3-Ⅱ明显上调（P<0.05或P<0.01），Akt磷酸化降低且Bax/Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-I比值升高（P<0.01）。[结论] 葛根素具有诱导人肝癌HepG2细胞凋亡与自噬的作用，该作用具有一定的剂量依赖性；抑制Akt/mTOR/Beclin1通路进而诱导促凋亡、促自噬相关蛋白表达和活化可能是其重要的分子机制。     

基于Akt/mTOR通路研究地榆皂苷II诱导肝癌细胞凋亡和自噬作用机制

目的 探讨地榆皂苷II抑制肝癌细胞增殖、诱导肝癌细胞凋亡和自噬的作用机制。方法 采用不同浓度（0、10、20、40 μmol/L）地榆皂苷II处理人肝癌HepG2细胞和小鼠肝癌Hepa1-6细胞,通过CCK-8和EdU实验观察地榆皂苷II对HepG2和Hepa1-6细胞增殖的影响;运用流式细胞术检测地榆皂苷II对细胞凋亡的影响;通过Western blotting检测地榆皂苷II对细胞凋亡和自噬相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cysteine-aspartic acid protease-3,Caspase-3）、Caspase-8、Caspase-9、B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein,Bax）、cleaved Caspase-3、微管相关蛋白1A/1B-轻链3-II（microtubule-associated protein light chain3-II,LC3II）、微管相关蛋白1A/1B-轻链3-Ⅰ（microtubule-associated protein light chain3-Ⅰ,LC3Ⅰ）、自噬相关蛋白p62、Beclin1及蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）通路关键蛋白表达的影响。结果 地榆皂苷II显著抑制HepG2和Hepa1-6细胞活力,且呈现一定的剂量相关性;流式细胞检测发现地榆皂苷II给药后细胞凋亡率显著增加（P＜0.01、0.001）;Western blotting结果显示,与对照组比较,地榆皂苷II给药后Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2表达显著降低（P＜0.05、0.01、0.001）,cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达显著升高（P＜0.05、0.01）,LC3Ⅱ/LC3I值显著升高（P＜0.05、0.01、0.001）,Beclin1蛋白表达量显著升高（P＜0.05、0.01）,p62蛋白表达量显著下降（P＜0.05、0.01）,p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR值显著降低（P＜0.05、0.01、0.001）。结论 地榆皂苷II通过Akt/mTOR通路诱导HepG2和Hepa1-6细胞自噬和凋亡实现对肝癌细胞增殖的抑制,为抗肝细胞癌新药发现提供药理学证据。