全骨髓贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞体外定向成骨诱导分化及鉴定

背景：流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法对细胞活性影响较大,密度梯度离心法虽然能够获得纯度高的单核细胞,但由于多次离心可造成细胞的大量流失且对细胞活性有一定的影响使其应用值得商榷。 目的：采用全骨髓贴壁法分离兔骨髓间充质干细胞进行成骨诱导分化及鉴定。 方法：采用全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学特征。在成骨诱导剂作用下,通过碱性磷酸酶染色试剂盒行碱性磷酸酶染色,Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色,Von Kossa法及茜素红进行矿化结节染色以及电镜下检测兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后的形态结构。 结果与结论：经诱导后细胞出现与成骨细胞相似的形态学特征,碱性磷酸酶染色阳性,Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色,Von-Kossa法及茜素红矿化结节染色阳性。表明经成骨诱导剂诱导后全骨髓贴壁法体外分离纯化培养的兔骨髓间充质干细胞能向成骨细胞方向分化增殖。     

黄连素在高糖环境下促进骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景：糖尿病患者的口腔种植体骨结合率低下，失败率高，严重影响了生活质量，亟需有效手段改善糖尿病患者种植体骨结合以提高成功率。探究黄连素在高糖环境下对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及具体机制，将能为解决上述问题提供有效的理论支撑。目的：探讨天然提取物黄连素在高糖微环境下对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。方法：通过全骨髓贴壁法培养SD大鼠骨髓间充质干细胞。CCK-8法检测在高糖生理环境下添加不同浓度黄连素对骨髓间充质干细胞增殖的影响并筛选出最适黄连素浓度。通过碱性磷酸酶活性、茜素红染色以及PCR检测Runx2、Osx表达，判断黄连素在高糖环境下对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。为进一步探索作用机制，添加AMPK特异性抑制剂Dorsomorphin，使用DCFH-DA活性氧荧光探针检测活性氧水平，Western blot检测p-AMPK的表达。结果与结论：(1)10μmol/L为黄连素促进骨髓间充质干细胞增殖的最适浓度；(2)黄连素在高糖微环境下促进骨髓间充质干细胞矿化结节形成并提高碱性磷酸酶活性；(3)黄连素在高糖微环境下促进Runx2和OSx基因表达；(4)黄连素可有效抑制高糖环境下...     

高糖微环境下糖原合酶激酶3β抑制剂Tideglusib干预大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化

背景：高糖环境能够抑制骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化能力,如何提高成骨细胞在高糖状态下的生物学活性,是改善糖尿病患者种植体骨结合的关键。目的：探究非ATP竞争性的特异性糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)抑制剂Tideglusib在高糖微环境下对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。方法：采用全骨髓贴壁法培养并纯化大鼠骨髓间充质干细胞,将骨髓间充质干细胞分为4组：正常对照组(5.5 mmol/L葡萄糖),Tideglusib+正常对照组(5.5 mmol/L葡萄糖+20 nmol/L Tideglusib),高糖组(25.5 mmol/L葡萄糖),Tideglusib+高糖组(25.5 mmol/L葡萄糖+20 nmol/L Tideglusib)。(1)CCK-8法检测细胞的增殖情况;(2)成骨诱导培养4,7 d后检测碱性磷酸酶的活性;(3)成骨诱导培养21 d后采用茜素红染色检测钙化结节的形成;(4)细胞接种24 h后鬼笔环肽染色观察细胞的初期黏附形态;(5)RT-qPCR检测成骨基因Runx2、OPN的mRNA表达,Wester...     

地塞米松诱导牙周膜干细胞的定向成骨分化及凋亡

背景：牙周膜干细胞是一类起源于牙组织的成体干细胞,具有良好的成骨分化能力,有望在骨组织工程中得到应用。 目的：观察成骨诱导液对牙周膜干细胞成骨分化能力及细胞早期凋亡的影响。 方法：从原代牙周膜组织中分离得到牙周膜干细胞,以1×10⁴/cm²浓度铺板后开始诱导。利用1,10,100 nmol/L地塞米松、β-磷酸甘油钠、维生素C为成骨诱导剂,以碱性磷酸酶活性检测、茜素红矿化结节染色、荧光定量PCR等方法对细胞成骨情况进行鉴定,采用AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡情况。 结果与结论：地塞米松可有效诱导牙周膜干细胞成骨分化,可显著提高碱性磷酸酶活性,促进茜素红矿化结节形成,提高成骨相关基因骨粘连蛋白及Ⅰ型胶原表达。根据碱性磷酸酶活性和矿化结节实验结果,地塞米松的成骨诱导具有浓度梯度效应,其中100 nmol/L 地塞米松具有最佳成骨诱导能力。细胞凋亡结果提示,地塞米松诱导的成骨分化具有一定促凋亡作用,可诱导牙周膜细胞的早期凋亡。     

未羧化骨钙素对高糖条件下小鼠骨髓间充质干细胞成骨与成脂分化的调控效应

文题释义： 未羧化骨钙素：由成骨细胞分泌的一种含量丰富的非胶原蛋白,在骨矿化过程中起到重要作用。近几年研究表明未羧化骨钙素可作为激素调节糖脂代谢,对胰岛素抵抗具有缓解作用;作为糖尿病和骨骼疾病之间相互关联的一个重要因子,可显著改善2型糖尿病小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。 骨髓间充质干细胞：存在于骨髓中的一类可以自主更新且具有多向分化潜能的多能干细胞。作为脂肪细胞和成骨细胞的前体细胞,其分化方向直接影响骨髓内成分的相对含量以及骨组织的结构。糖尿病性骨质疏松患者的骨髓间充质干细胞受高糖的影响,偏向于向脂肪细胞分化,最终导致成骨细胞含量偏低,骨组织缺失。 背景：寻找高糖条件下促进骨髓间充质干细胞成骨分化而抑制其成脂分化的方法,可以为治疗骨代谢疾病如糖尿病性骨质疏松提供预防及治疗思路。 目的：探讨未羧化骨钙素对高糖条件下小鼠骨髓间充质干细胞成脂分化和成骨分化的影响,揭示未羧化骨钙素对骨髓间充质干细胞分化的作用机制。 方法：采用全骨髓细胞培养及贴壁纯化小鼠骨髓间充质干细胞,不同质量浓度(0,1,3,10,30 μg/L)未羧化骨钙素处理细胞,CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,确定最佳作用质量浓度。第3代骨髓间充质干细胞加入成脂(或成骨)分化诱导培养基并分成4组：对照组、高糖处理组、未羧化骨钙素处理组、高糖+未羧化骨钙素处理组,分别添加25.5 mmol/L外源葡萄糖,3 μg/L未羧化骨钙素进行处理。采用油红和茜素红染色检测脂滴和钙结节的形成,qRT-PCR检测成脂分化标志基因(Fabp4、PPARγ、Adipsin和FAS)和成骨分化标志基因(Runx2、Osx、ALP和COLⅠ)的相对表达水平,试剂盒检测碱性磷酸酶活性和Ⅰ型胶原蛋白水平。另外,结合MEK和AMPK的特异性抑制剂(PD98059和BML),Western blot检测P-Erk和P-AMPKα的相对表达水平。 结果与结论：①3 μg/L未羧化骨钙素可显著促进细胞增殖(P < 0.01);②未羧化骨钙素促进高糖条件下骨髓间充质干细胞产生钙结节(P < 0.01)而抑制脂滴的形成(P < 0.05),下调成脂分化标志性基因(P_Fabp4 < 0.01;P_PPARγ < 0.05;P_Adipsin < 0.01;P_FAS < 0.01)而上调成骨分化标志性基因(P_Runx2 < 0.05;P_Osx< 0.05;P_ALP < 0.01;P_COLⅠ < 0.01)的表达,增加碱性磷酸酶活性(P < 0.01)和Ⅰ型胶原蛋白水平(P < 0.05);③高糖条件下,未羧化骨钙素上调P-Erk(P < 0.01)和P-AMPKα(P < 0.01)表达水平;④结果表明,未羧化骨钙素通过Erk/AMPKα信号通路促进高糖条件下骨髓间充质干细胞的成骨分化而抑制成脂分化。 ORCID: 0000-0003-2544-5690(杨建虹) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

自噬对晚期糖基化终末产物致成纤维细胞损伤的早期保护

文题释义：细胞自噬：自噬是普遍存在于真核细胞中的一种高度保护的、维持细胞内环境自身稳定的细胞内降解机制。胞浆中的细胞器和蛋白质等首先被双层膜包裹，形成自噬体，随后自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，自噬可降解清除细胞内受损线粒体等细胞器及毒性蛋白质聚集体。细胞自噬可影响糖尿病等慢性创面成纤维细胞的活力，被认为是疾病修复的关键调节因素。晚期糖基化终末产物：是在持续高糖条件下，蛋白质、脂质甚至核酸的氨基与糖的醛基在非酶催化反应下生成的最终末产物。在糖尿病患者体内，病理性高血糖可加速糖基化反应，形成大量的晚期糖基化终末产物。局部晚期糖基化终末产物蓄积作为糖尿病代谢重构的直接产物，是皮肤组织细胞、细胞外基质和细胞因子改变的重要环境介质，使得糖尿病患者的皮肤易损伤并形成溃疡创面。背景：晚期糖基化终末产物与糖尿病创面难愈合密不可分，晚期糖基化终末产物可影响成纤维细胞增殖及迁移，但自噬在晚期糖基化终末产物致成纤维细胞损伤中的早期保护作用尚未见相关研究。 目的：研究晚期糖基化终末产物对成纤维细胞活力及自噬的影响，探讨自噬在成纤维细胞损伤中的早期保护作用。 方法：以体外传代培养的人成纤维细胞为研究对象，设立正常对照组(DMEM培养液)、晚期糖基化终末产物组(DMEM培养液+100 mg/L晚期糖基化终末产物)、晚期糖基化终末产物抑制剂N-苯乙酰噻唑组(DMEM培养   液+100 mg/L晚期糖基化终末产物+100 mg/L N-苯乙酰噻唑)、自噬抑制剂氯喹组(DMEM培养液+100 mg/L晚期糖基化终末产物+10 μmol/L氯喹)。培养48 h后，锥虫蓝染色检测各组细胞活力，Western blot法检测LC3及P62蛋白的表达，细胞免疫荧光实验检测自噬体形成，透射电镜观察自噬泡超微结构。结果与结论：①细胞死亡率：与正常对照组比较，晚期糖基化终末产物组细胞死亡率显著增加(P < 0.01)；与晚期糖基化终末产物组比较，N-苯乙酰噻唑组细胞死亡率显著降低(P < 0.05)，而氯喹组细胞死亡率显著增加(P < 0.05)；②LC3及P62蛋白的表达：与正常对照组相比，晚期糖基化终末产物组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著增加，P62表达显著降低(P < 0.01)；与晚期糖基化终末产物组相比，N-苯乙酰噻唑组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显下降，P62表达明显上升(P < 0.05)，而氯喹组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白含量变化不明显(P > 0.05)，P62表达明显上升(P < 0.05)；③自噬体形成：晚期糖基化终末产物组和氯喹组均可见细胞中LC3绿色荧光点状聚集物增加；晚期糖基化终末产物组可见数目较多的自噬小体和自噬泡结构，而氯喹组细胞中自噬体结构数量和空泡状结构少于晚期糖基化终末产物组；④结果证实，晚期糖基化终末产物可损伤成纤维细胞，降低细胞生存率，早期可激活细胞自噬；诱导的自噬对成纤维细胞损伤起到一定的保护作用。 ORCID: 0000-0003-3966-8684(韩焱福) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程     

定向诱导分化环境下骨髓间充质干细胞向成骨及成脂细胞的分化

背景：骨髓间充质干细胞属于骨髓中的非造血干细胞,能够在不同的条件下诱导分化为软骨细胞、骨细胞以及脂肪细胞等,是最有前途的组织工程种子细胞。 目的：探讨定向诱导分化环境下骨髓间充质干细胞向成骨细胞及脂肪细胞分化的关系。 方法：无菌抽取日本大耳兔骨髓,采用密度梯度离心法和细胞贴壁法分离、纯化出骨髓间充质干细胞,分别采用成脂诱导培养基和成骨诱导培养基进行诱导培养,培养后不同时间点进行苏丹Ⅳ染色、Von Kossa染色、碱性磷酸酶活性检测,比较细胞成脂和成骨率。以正常DMEM培养液培养细胞为对照组。 结果与结论：骨髓间充质干细胞经过7 d成脂诱导后细胞浆开始出现小脂滴、细胞无序,培养21 d后细胞浆内形成高折光性的脂滴。苏丹Ⅳ染色结果显示：骨髓间充质干细胞克隆中心的细胞浆内存在大量的颗粒状红色脂滴,对照组仅5%骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞。骨髓间充质干细胞经过7 d成骨诱导后细胞逐渐汇合成铺路石状,并且形成多个结节;培养14 d后能够看见褐色点状矿化结节中心;培养21 d后形成小片状矿化结节。成骨诱导实验组成骨率为40%,成脂率为20%,显著高于对照组(成骨率为5%,成脂率为5%)。结果提示在适当的环境下骨髓间充质干细胞能够一部分转化为脂肪细胞,另一部转化为骨细胞,并且二者存在一定的联系,即分化的脂肪细胞多,骨细胞则少;反之分化的脂肪细胞少,骨细胞则多。  中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

小鼠间充质干细胞三系分化中SOX9与Ⅱ型胶原mRNA的定量

背景：研究表明,软骨中的主要成分Ⅱ型胶原的基因-Col2a1在软骨细胞中的表达与SOX9 的浓度呈剂量依赖正相关关系。 目的：通过成骨、成软骨、成脂肪诱导干细胞分化,分析3种分化过程及不同时期的SOX9与Ⅱ型胶原 mRNA含量的变化,探讨SOX9在不同时空分布的表达规律及与Ⅱ型胶原的相关关系。 方法：取4周龄昆明小鼠骨髓间充质细胞,体外培养得到间充质干细胞并传达至第3代,对间充质干细胞进行流式细胞仪鉴定细胞表型,共分3组每组设3个时间段,通过成骨、成软骨、成脂肪3种诱导培养液对3组细胞进行诱导,另设不进行诱导的细胞作为对照组。分别在诱导3,7,14 d后收集提取细胞的总RNA,通过RT-PCR进行SOX9与Ⅱ型胶原的mRNA定量检测,同时对诱导后的细胞进行染色、免疫荧光染色,观察其分化状态及相关统计分析。 结果与结论：第3代骨髓间充质干细胞生长良好,流式细胞仪鉴定细胞表型证实为干细胞,对诱导后细胞进行染色、免疫荧光染色结果证实细胞分化为骨、软骨、脂肪细胞。经RT-PCR检测,在3组诱导分化细胞中SOX9 mRNA含量由高到低分别是成软骨、成骨、成脂肪,Ⅱ型胶原 mRNA含量由高到低分别是成软骨、成脂肪、成骨。在成软骨分化中SOX9在3,7 d表达不断升高,14 d呈下降趋势。Ⅱ型胶原在3,7,14 d均逐渐升高。在成骨分化中SOX9 mRNA含量随着时间推移而增加,而Ⅱ型胶原则随着时间推移而不断降低。在成脂肪分化中SOX9 mRNA表达与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05);而Ⅱ型胶原的表达没有规律可循,时间点的延伸及检测未观察到。结果提示,SOX9在软骨分化中作用优于成骨、成脂肪组,且软骨分化中SOX9与Ⅱ型胶原存在相关性,可能在软骨分化的早期Ⅱ型胶原随着SOX9的变化而变化;且软骨分化和成骨分化过程中SOX9可能起到了一个互相协调促进平衡的关键作用。     

低频脉冲电磁场在三维支架下对人脂肪源干细胞增殖和成骨分化的影响北大核心

背景:目前已有较多实验研究证实低频脉冲电磁场在二维支架下促进多种干细胞向成骨细胞分化,但鲜有研究磁场在三维支架下对干细胞的增殖及成骨分化的影响。目的:探讨在聚已内酯3D培养支架环境下,外加低频脉冲电磁场对人脂肪源干细胞增殖及成骨分化的影响。方法:将第3代人脂肪源干细胞接种于聚已内酯3D培养支架上,分2组培养,实验组给予50 Hz、1 m T的低频脉冲电磁场干预,2 h/d,连续干预14 d;对照组不给于低频脉冲电磁场干预。培养7 d后,Live/Dead染色观察细胞存活情况;培养1,3,5,7 d后,MTT法检测细胞增殖;培养7,14 d,碱性磷酸酶染色及qR T-PCR检测细胞成骨分化水平。结果与结论:(1)Live/Dead染色:人脂肪源干细胞已长入到支架材料的空隙结构内部,在材料中可保持较高的活性;(2)细胞增殖:随着培养时间的延长,两组细胞A值均逐渐升高,实验组培养1,3 d的细胞A值高于对照组(P<0.05);(3)碱性磷酸酶染色:实验组培养7,14 d的碱性磷酸酶阳性染色强于对照组;(4)qR T-PCR检测:培养7 d时,实验组碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原基因表达量高于对照组(P<0.01);培养14 d时,实验组骨桥蛋白、Runt相关转录因子2、碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原的表达量均明显高于对照组(P<0.05);(5)结果表明:在聚已内酯3D培养支架环境下,外加低频脉冲电磁场可促进人脂肪源干细胞的增殖及成骨分化。     

2型糖尿病大鼠骨折愈合障碍与体内晚期糖基化终末产物的变化

背景：近年来,晚期糖基化终末产物在骨组织领域的作用日益受到重视,而糖代谢紊乱是引起晚期糖基化终末产物增加的主要原因之一。 目的：观察2型糖尿病大鼠体内晚期糖基化终末产物表达的变化,并探讨其与糖尿病骨折愈合障碍的关系。 方法：30只SD大鼠随机均分为2组,实验组制备2型糖尿病模型,对照组正常饲养。糖尿病模型制备成功后,所有大鼠建立左胫骨骨折牵引成骨模型,胫骨延长0.3 mm/d,持续14 d。 结果与结论：牵引结束后,X射线摄片显示实验组糖尿病模型大鼠骨折断端之间牵引骨痂形成较对照组明显减少;骨痂组织学检查表现为微骨柱排列紊乱,初始基质前沿浅染。ELISA法检测实验组血清和双侧骨痂组织中晚期糖基化终末产物水平较对照组明显升高(P < 0.01),骨钙素明显降低(P < 0.01)。提示2型糖尿病大鼠骨折牵引骨痂生成障碍,而骨组织中晚期糖基化终末产物水平增高可能是导致2型糖尿病骨折愈合障碍的原因。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

降钙素基因相关肽诱导藻酸钙凝胶复合脂肪干细胞的成骨细胞分化

背景：降钙素基因相关肽已被证实具有诱导成骨细胞分化作用,但其是否可使三维培养下的脂肪干细胞向成骨细胞分化构建组织工程骨的相关报道少见。 目的：探讨外源性降钙素基因相关肽诱导兔脂肪干细胞复合藻酸钙凝胶三维培养成骨分化的可行性。 方法：取新西兰兔双侧腹股沟区皮下脂肪垫,Ⅰ型胶原酶消化离心贴壁法分离培养脂肪干细胞,取第3代与海藻酸钠混合制备凝胶,于24孔板分组培养：对照组加入含10^-2 mol/L β-甘油磷酸钠、10^-7 mol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸、体积分数10%胎牛血清的DMEM/F-12骨诱导培养基,实验组在此基础上再加入1.5 µg/L降钙素基因相关肽进行诱导培养。于诱导不同时间点MTT法检测细胞增殖,RT-PCR法检测诱导细胞Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA的表达,并检测碱性磷酸酶及钙离子浓度。 结果与结论：兔脂肪干细胞的增殖曲线呈“S”型,实验组诱导1,3,5,7,14,21 d的A值高于对照组(P < 0.05);诱导2周后两组细胞碱性磷酸酶、茜素红染色均阳性,但实验组钙结节较对照组明显增多。实验组诱导7,14 d的Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA表达均强于对照组。实验组诱导1,2,3,4周的碱性磷酸酶活性及钙离子浓度均高于对照组(P< 0.05)。结果表明降钙素基因相关肽能诱导复合藻酸钙凝胶的脂肪干细胞向成骨细胞分化。     

冻存骨髓基质细胞复合材料体内成骨基质的合成能力

背景:课题组以往研究显示：体外培养条件下,冻存骨髓基质细胞复苏后仍保持较高的细胞存活率、细胞增殖及成骨分化能力。上述结果仍然需要进一步在体内环境下证实。 目的：观察经超低温冻存后的骨髓基质细胞和支架材料胶原膜BME-10X复合体植入裸鼠体内后Ⅰ型胶原的合成情况。 方法：体外分离培养Beagle犬骨髓基质细胞,冻存12个月后复苏,体外构建骨髓基质细胞和胶原膜材料复合体。分别经矿化诱导培养液、基础培养液培养5 d后,植入裸鼠体内,于术后第4周取出标本,进行大体观察、组织病理学和免疫组化分析,并应用图像分析系统对各组标本中的Ⅰ型胶原进行定量分析。以矿化诱导培养液培养的单纯胶原膜材料为对照组。 结果与结论：对照组在植入胶原膜后,胶原膜边界清晰,膜边缘及内部基本没有细胞生长,Ⅰ型胶原分布很少;在未诱导矿化组,术后第4周可见,胶原膜内有细胞长入,并有细小的条索状新生胶原形成,Ⅰ型胶原分布明显增多;在诱导矿化组,植入后也可见支架材料的分解降解和更多的细胞生长,大量新生的胶原形成类骨质样组织,与前两组对比,Ⅰ型胶原分布增多有显著性意义。结果表明冻存骨髓基质细胞复苏后进行体外培养扩增与诱导分化,并在体内环境下复合胶原支架材料,仍然具有较强成骨能力。     

重组pcDNA3.1-hBMP-2转染兔脂肪干细胞体外诱导的成骨分化

背景：骨形态发生蛋白2具有很强的诱导干细胞成骨活性。 目的：构建人骨形态发生蛋白2基因真核表达载体,探讨其转染脂肪干细胞后的成骨效果。 方法：通过噬菌斑原位杂交筛选人混合细胞cDNA文库获得人骨形态发生蛋白2基因,与真核表达载体pcDNA3.1-连接,构建重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2。利用脂质体Lipofectamine™ 2000分别介导人骨形态发生蛋白2 基因、EGFP基因转染第4代脂肪干细胞,并经G418进行筛选。 结果与结论：酶切鉴定及DNA测序结果证实重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2构建成功。经计算脂质体介导的脂肪干细胞瞬时转染率为(18.0±0.42)%,并经过G418筛选后获得了稳定转染的细胞。细胞生长曲线表明转染后对脂肪干细胞生长、增殖无明显影响。ELISA检测发现人骨形态发生蛋白2组的人骨形态发生蛋白2因子表达量均高于EGFP组及未转染组,且能够稳定表达。经人骨形态发生蛋白2基因转染的脂肪干细胞的Ⅰ型胶原含量、碱性磷酸酶活性以及钙结节数目均比EGFP组及未转染组有明显升高。     

脂肪源性干细胞成骨分化过程中成骨相关miRNA的表达模式

背景：miRNA在细胞分化等众多生理病理过程中起重要调控作用,可调节脂肪来源干细胞成骨分化。 目的：筛选成骨分化相关miRNA,分析miRNA在脂肪来源干细胞成骨分化过程中的表达模式。 方法：从皮下脂肪组织中分离、培养人脂肪来源干细胞。应用基因芯片技术筛选脂肪来源干细胞成骨诱导前后表达差异显著的miRNA,采用RT-PCR技术检测所筛选的miRNA在成骨诱导第7,14,21天上调/下调的相对表达强度,以ELISA试剂盒检测相应时间点成骨相关蛋白的表达情况。 结果与结论：①倒置显微镜下观察,传3代后可获得均一性较高的脂肪来源干细胞,一定诱导条件下具有成骨、成脂、成软骨分化能力。②基因芯片技术筛选出成骨分化前后表达差异变化明显的9个miRNA,其中5个上调,4个下调。③成骨诱导第7天,miR-106a表达上调1.58倍(P < 0.05)。第14天时,9个miRNA均表达上调。第21天时,5个miRNA表达上调,4个表达下调。④成骨相关蛋白骨钙素、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原及骨唾液酸蛋白的质量浓度在诱导成骨分化第7天即明显升高,第14天达到峰值,第21天略有下降。     

Advanced glycation endproducts regulate smooth muscle cells calcification in cultured HSMCs

Objective: To investigate the mechanism of Advanced glycation end products (AGEs) promoting the calcification of smooth muscle cells. Methods: The successfully cultured smooth muscle cells were divided into three groups: normal culture group (group A), calcified culture group (group B), calcification + AGEs group (group C); the concentration of intracellular calcium ion was detected in each group; the promotion of AGEs on the calcification of HSMCs was confirmed by VON KOSSA staining; and the expressions of β-catenin, RAGE, β-catenin, OPG and E-cadherin protein were detected by immunofluorescence and western blot. Results: The morphology of the cells in each group showed that the amount of calcified plaques in calcification + AGES group were significantly higher than the calcification group. VON KOSSA staining showed that with increasing concentrations of AGE-BSA, the amount of its calcification gradually increased. Calcium concentration in Calcification + 20 mg/L AGEs group was significantly higher, followed by 40 mg/L AGEs group. The expression of β-catenin increased with the increasing concentrations of AGEs. Conclusion: AGEs can promote the calcification of human femoral artery smooth muscle cells, with a concentration gradient effect. With increasing concentrations of AGEs, the expression of RAGE increased, indicating that AGEs-induced HSMCs proliferation was correlated with RAGE expression.     

维甲酸诱导小型猪牙周膜干细胞的体外成骨

背景：近期研究发现维甲酸对胚胎干细胞及多种成体干细胞具有成骨方向诱导的作用。 目的：观察维甲酸对小型猪牙周膜干细胞体外成骨作用的影响。 方法：采用组织块法获得小型猪牙周膜细胞,有限稀释法纯化小型猪牙周膜干细胞,免疫荧光法检测STRO-1、免疫细胞化学法检测波形蛋白、角蛋白鉴定小型猪牙周膜干细胞。CCK8法测定小型猪牙周膜干细胞增殖曲线,检测小型猪PDLSC克隆形成率。使用维甲酸对第3代小型猪牙周膜干细胞进行成骨诱导,茜素红染色检测矿化结节,免疫细胞化学方法检测成骨相关基因骨桥蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达。 结果与结论：有限稀释法分离纯化小型猪牙周膜干细胞STRO-1,波形蛋白阳性表达,角蛋白阴性表达,克隆形成率为2.8%,维甲酸诱导14 d后,碱性磷酸酶染色阳性,诱导21 d后茜素红染色阳性,免疫细胞化学法检测骨桥蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原阳性表达,Ⅲ型胶原阴性表达。结果表明小型猪牙周膜干细胞能够被维甲酸诱导向成骨样细胞分化。     

Comparative study of osteogenic differentiation potential of mesenchymal stem cells derived from bone marrow and adipose tissue of osteoporotic female rats

Osteoporosis causes reduction of osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow and adipose tissue. This study was designed to compare the osteogenic potential of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) and adipose-derived stem cells (ADSCs) of ovariectomized (OVX) rats. MSC were harvested from bone marrow and inguinal fat pads of six OVX rats. The limitations of this report are that cells from different animals were pooled for the purpose of the experiments that were carried out in this study. At 7, 14 and 21?d of osteogenic differentiation, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) conversion, alkaline phosphatase activity and gene expression for collagen I, osteocalcin, bone sialoprotein, osteopontin and bone morphogenetic protein-2 bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) were analyzed. At 21?d, percentage of cells per field and percentage of mineralized nodule were analyzed. The data were subjected to analysis of variance, and the means were compared by Student–Newman–Keuls test. The cells, regardless of group, showed phenotypic characteristics consistent with stem cells. MTT conversion, alkaline phosphatase activity, percentage of mineralized nodule and expression of collagen I, osteocalcin and BMP-2 of ADSCs from OVX rats were higher when compared to BMMSCs from OVX rats in at least one of the evaluated periods (p?p?相似文献   

骨形态发生蛋白2复合脂肪源性干细胞修复兔缺血性股骨头坏死

背景：骨形态发生蛋白2和脂肪源性干细胞都有很强的成骨能力,对于缺血性股骨头坏死的修复有重要意义。 目的：观察骨形态发生蛋白2体内复合脂肪源性干细胞成骨治疗兔股骨头缺血坏死的疗效。 方法：48只新西兰大白兔采用液氮冷冻法造模,随机分为对照组,髓芯减压组,脂肪源性干细胞组,骨形态发生蛋白2复合脂肪源性干细胞组。 结果与结论：脂肪源性干细胞组与骨形态发生蛋白2复合脂肪源性干细胞组兔股骨头坏死区域的组织修复旺盛,新生骨小梁较多且逐步强化,X射线未见明显的囊性变和股骨头塌陷发生。在8周时骨形态发生蛋白2复合脂肪源性干细胞组骨小梁及骨髓组织生长较单纯脂肪源性干细胞组更旺盛。表明骨形态发生蛋白2因子复合脂肪源性干细胞植入股骨头坏死模型后成骨较多,修复坏死区域功能较强。     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中Hedgehog信号分子的表达

背景：Hedgehog信号通路是一个在胚胎阶段调控多种组织器官发育的重要信号通路,在成骨发育方面具有重要的作用。但Hedgehog信号分子在大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为成骨细胞过程中的作用尚未清楚。 目的：体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨分化,检测Hedgehog信号分子在成骨诱导分化过程中的变化。 方法：从大鼠骨髓中分离得到骨髓间充质干细胞,进行地塞米松成骨诱导,通过免疫组化方法鉴定成骨的情况,Western Blot方法检测 Hedgehog信号分子SHH和IHH在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的表达。 结果与结论：成功分离得到骨髓间充质干细胞,地塞米松诱导培养7,14,21 d 后,Ⅰ型胶原的表达量逐渐增加;在诱导成骨分化过程中,SHH蛋白表达升高,诱导组的表达明显高于未诱导组的表达(P < 0.05),而IHH蛋白的表达降低,诱导组的表达明显低于未诱导组的表达(P < 0.05)。结果提示,Hedgehog信号分子参与地塞米松诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的过程,且SHH和IHH在间充质干细胞诱导成骨过程中的作用有差异。