大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为肝细胞样细胞

背景：目前体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的研究主要集中在不同诱导因子的诱导作用,而微环境的诱导作用研究较少。 目的：观察肝细胞生长因子、胎肝细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的影响。 方法：采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞,反复贴壁法纯化扩增骨髓间充质干细胞;采用Ⅰ型胶原酶消化法分离孕3周大鼠胚胎肝脏细胞,差速贴壁法纯化肝脏细胞;阴性对照组骨髓间充质干细胞只加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基。诱导组在阴性对照组基础上加入一定浓度肝细胞生长因子或者与胎肝细胞共培养进行诱导分化。 结果与结论：诱导组白蛋白、甲胎蛋白水平均高于非诱导组(P < 0.01),诱导组糖原染色阳性,免疫细胞化学染色CK-18阳性,而非诱导组糖原染色、CK-18均阴性。结果显示肝细胞生长因子和胎肝细胞均可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞。     

肝细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞表达甲胎蛋白和白蛋白

背景:对于诱导骨髓间充质干细胞成肝细胞样细胞的研究,在大鼠及小鼠及人类中已有相关报道。甲胎蛋白和白蛋白均为肝细胞系较为特异的标志。目的:进一步验证肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用。方法:采用密度梯度离心和贴壁培养法相结合分离培养人骨髓间充质干细胞,以含20μg/L肝细胞生长因子和10μg/L碱性成纤维细胞生长因子的低糖DMEM培养基诱导培养,对照组取同代细胞,常规培养液培养。诱导培养7,14,21和28d采用免疫组织化学方法检测甲胎蛋白和白蛋白的表达及RT-PCR技术检测白蛋白mRNA表达。结果与结论:诱导组骨髓间充质干细胞呈类上皮样细胞。诱导组在培养7d时,甲胎蛋白表达阳性率为81.5%,随着培养时间延长,甲胎蛋白阳性表达率逐渐减弱,而白蛋白阳性表达率及白蛋白mRNA表达逐渐增强,至培养28d,白蛋白阳性表达率达91.2%,对照组细胞均无白蛋白、白蛋白mRNA及甲胎蛋白表达。结果证实,肝细胞生长因子可诱导骨髓间充质干细胞表达甲胎蛋白和白蛋白。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化:肝细胞生长因子和表皮细胞生长因子的作用

背景:研究证实人骨髓间充质干细胞能够诱导分化为肝样细胞,但其具体生物学特性及分化机制尚不清楚,且诱导分化培养体系尚不成熟。目的:探讨肝细胞生长因子和表皮细胞生长因子体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的可行性。方法:取食管癌手术患者肋骨,采用密度梯度离心联合贴壁筛选法获取人骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面分子的表达。取第3代人骨髓间充质干细胞,分为4组,肝细胞生长因子组加入20μg/L肝细胞生长因子,表皮细胞生长因子组加入20μg/L表皮细胞生长因子,联合组同时加入上述两种生长因子,空白对照组不加任何生长因子。倒置显微镜下观察细胞形态的变化,诱导7,14dRT-PCR检测甲胎蛋白与白蛋白mRNA的表达。结果与结论:人骨髓间质干细胞不表达造血细胞标志CD34,CD45,强表达β1-整合素CD29和基质受体CD44。肝细胞生长因子组、表皮细胞生长因子组、联合组诱导后,细胞形态由长梭形变为类圆形或多角形,诱导第7,14天甲胎蛋白、白蛋白mRNA均呈阳性表达;空白对照组未见多角形细胞,甲胎蛋白、白蛋白mRNA均呈阴性表达。证明肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子以及二者联合均具有诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的能力,至于二者联合是否能增强其分化能力尚待进一步免疫细胞化学染色定量分析予以验证。     

虫草多糖体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为类肝细胞样细胞

背景：如何促进骨髓间充质干细胞向肝细胞完全意义上的转化,以便更有效改善病变肝组织的结构和功能将成为未来相关研究的重中之重。 目的：探讨虫草多糖在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为类肝细胞样细胞的可行性。 方法：采用贴壁法培养Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,实验分3组对骨髓间充质干细胞进行诱导分化,虫草组培养液中加虫草多糖进行诱导,终末质量浓度为0.15 g/L;阳性对照组培养液中加肝细胞生长因子和表皮生长因子联合诱导,质量浓度分别为20 μg/L和10 μg/L;空白对照组仅用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液。 结果与结论：分离纯化的骨髓间充质干细胞经流式细胞仪检测显示CD34阴性表达,CD44阳性表达。诱导分化7 d时虫草组及阳性对照组细胞出现甲胎蛋白表达,14 d时表达增强,28 d时表达减弱,阳性对照组甲胎蛋白阳性率高于虫草组;诱导分化7 d时阳性对照组细胞角蛋白18出现表达,14 d时表达增强,虫草组则在14 d时出现表达,而后持续。诱导分化7 d时虫草组及阳性对照组白蛋白表达阴性,14 d时出现阳性。诱导分化14 d时虫草组及阳性对照组细胞糖原染色阳性,28 d时表达减弱。空白对照组结果皆为阴性。结果可见虫草多糖可以在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为类肝细胞样细胞。     

骨髓间充质干细胞向肝样细胞的诱导及分化

背景：研究表明,在体外提供肝细胞及成纤维细胞生长因子等多种因子可诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化,但对其诱导的最佳环境还处于摸索阶段。 目的：观察体外应用肝细胞生长因子和成纤维生长因子4等多种因子联合诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化能力。 方法：采用全骨髓贴壁培养法分离、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,培养第3代时用肝细胞生长因子、成纤维生长因子4、胰岛素铁硒传递蛋白及地塞米松等联合诱导其向肝样细胞的分化。于诱导7,14,21 d后观察细胞形态变化,RT-PCR检测细胞白蛋白、甲胎蛋白、细胞角蛋白的mRNA表达;于诱导14,21 d行PAS糖原染色检测,并采用免疫细胞荧光法检测细胞白蛋白表达。 结果与结论：随着诱导时间的延长,骨髓间充质干细胞表现为肝细胞样,并呈集落生长,肝细胞特异性标志物逐渐出现和成熟。细胞诱导至7 d出现甲胎蛋白mRNA表达,14 d表达增高,21 d时表达下降;14 d时细胞角蛋白18、白蛋白 mRNA和糖原出现表达,并随时间延长表达逐渐增加。细胞诱导14 d时,胞浆白蛋白出现表达,至21 d时表达增强。证实骨髓间充质干细胞在肝细胞生长因子、成纤维生长因子4等多种因子诱导作用下,具有强大的向肝细胞分化能力。     

兔骨髓间充质干细胞体外向肝样细胞的诱导分化

背景：研究表明,应用四氯化碳建造的重型肝衰竭小鼠模型中移植骨髓间充质干细胞后能够明显改善肝功能,促进肝再生。 目的：观察骨髓间充质干细胞移植后动物模型肝功能及肝硬化程度等指标的变化情况。 方法：采用密度梯度离心法和贴壁培养法获取兔骨髓间充质干细胞。取传代培养至3代的兔骨髓间充质干细胞,添加肝细胞生长因子和表皮生长因子,诱导21 d后进行BrdU标记。建立肝硬化兔模型,实验组兔将收集的BrdU标记过的肝样细胞悬液注入门静脉,对照组注入相同体积生理盐水。细胞移植后21 d麻醉下处死试验兔,观察肝硬化兔肝脏内分布及肝功能与对照组变化情况。 结果与结论：兔骨髓间充质干细胞在体外经肝细胞生长因子、表皮生长因子的诱导条件下,于21 d发现细胞呈类圆形,细胞染色显示,甲胎蛋白、血清白蛋白和糖原表达均呈阳性表达。肝样细胞经门静脉移植后,实验组兔肝生化指标与对照组相比较显著改善(P < 0.05)。BrdU免疫组织化学染色显示：在汇管区和肝索肝窦内均可见BrdU阳性细胞分布。说明兔骨髓间充质干细胞能够向肝样细胞分化,经门静脉移植诱导后的肝样细胞可以改善肝硬化兔的肝功能,促进兔肝细胞再生。     

转化生长因子β1对骨髓干细胞分化类髓核细胞的影响

背景：转化生长因子β1是骨髓间充质干细胞分化为类髓核细胞的首选生长因子,适当浓度能诱导骨髓间充质干细胞的增殖和分化。 目的：观察不同质量浓度转化生长因子β1对大鼠骨髓间充质干细胞体外向类髓核细胞分化的影响,优化骨髓间充质干细胞体外培养条件。 方法：取成年大鼠股骨骨髓,体外培养、纯化。取第3代成年大鼠骨髓间充质干细胞,实验组用加入不同质量浓度转化生长因子β1(0,1,10,20 μg/L)的HG-DMEM无血清培养液诱导3,7,14,21 d;对照组普通状态下用含体积分数为10%胎牛血清的HG-DMEM培养液自然分化。 结果与结论：10 μg/L转化生长因子β1诱导液诱导的骨髓间充质干细胞蛋白聚糖与Ⅱ型胶原蛋白水平明显高于其他实验组和对照组(P < 0.01)。各实验组14 d时蛋白聚糖的表达均较3,7,21 d时高(P < 0.01)。对照组各时间点蛋白聚糖Aggrecan及Ⅱ型胶原表达均呈阴性。提示10 μg/L的转化生长因子β1能提高大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化类髓核的数量,从而使骨髓间充质干细胞发挥更高的治疗效率。     

FLK-1+胎肝细胞移植治疗急性肝损伤

背景：作者先期研究表明,在鼠胚第17-19天胎肝存在一类FLK-1⁺细胞,表达胚胎干细胞的特征性标志,并具有多向分化功能。目的：验证胎肝FLK-1⁺细胞治疗小鼠急性肝损伤的修复作用。方法：免疫磁珠提取及流式细胞仪检测胎肝FLK-1⁺细胞;RT-PCR检测FLK-1⁺细胞Oct-3/4、Rex-1基因;肝细胞生长因子和表皮生长因子诱导FLK-1⁺细胞向肝细胞分化。腹腔注射四氯化碳建立小鼠急性肝损伤模型并随机分为2组：对照组模型小鼠仅输入生理盐水,实验组模型小鼠尾静脉输注诱导分化FLK-1⁺细胞(1×10⁶细胞),16 h后两组取血测定肝功能,观察64 h小鼠死亡率。结果与结论：胎鼠肝脏FLK-1⁺细胞高表达Oct-3/4、Rex-1,白蛋白表达的FLK-1⁺细胞阳性率为0.6%。经肝细胞生长因子诱导3 d后FLK-1不表达,Oct-3/4和Rex-1表达显著下降或消失。经肝细胞生长因子和表皮生长因子诱导后96.38%的FLK-1⁺细胞表达白蛋白。诱导3d的FLK-1⁺细胞移植后16 h小鼠血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶显著低于对照组(P < 0.05),血清白蛋白显著高于对照组(P < 0.05);两组血清总胆红素和纤维蛋白原差异无显著性意义(P > 0.05);移植组64 h死亡率为61.5%与对照组(80%)差异无显著性意义(P > 0.05)。说明胎鼠肝脏肝细胞生长因子和表皮生长因子诱导3 d的FLK-1⁺细胞移植可较好地改善急性肝损伤的肝细胞功能。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植;肝移植;移植;心脏移植;组织移植;皮肤移植;皮瓣移植;血管移植;器官移植;组织工程全文链接：     

肿瘤坏死因子α刺激骨髓间充质干细胞表达及分泌肝细胞生长因子

背景：有研究表明,肿瘤坏死因子α可以刺激骨髓间充质干细胞发挥免疫抑制功能,并促进骨髓间充质干细胞表达肝细胞生长因子。 目的：观察肿瘤坏死因子α刺激大鼠骨髓间充质干细胞是否可以促进肝细胞生长因子的表达及分泌。 方法：全骨髓贴壁法分离、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞,传代至第三四代使用。以100 µg/L肿瘤坏死因子α预刺激骨髓间充质干细胞 5 h后弃去培养基,换上新鲜培养基作为实验组,以正常培养的骨髓间充质干细胞为空白组。采用倒置相差显微镜观察细胞形态;流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面标记物CD29、CD34、CD44、CD45的表达;RT-PCR 、Western blot检测细胞肝细胞生长因子mRNA及蛋白表达;ELISA测定细胞上清液中肝细胞生长因子水平。 结果与结论：获得的骨髓间充质干细胞形态均一,呈典型的旋涡样生长。骨髓间充质干细胞表达CD29⁺99.45%,CD34^-97.91%、CD44⁺99.52%、CD45^-98.42%;骨髓间充质干细胞中肝细胞生长因子 mRNA及蛋白与上清液中肝细胞生长因子表达量呈时间依赖性增加,实验组肝细胞生长因子 mRNA及蛋白与上清液中肝细胞生长因子的表达量明显高于空白组(P < 0.01)。说明肿瘤坏死因子α刺激骨髓间充质干细胞可以有效促进肝细胞生长因子的表达及分泌。     

红景天苷与淤胆血清诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化

背景：大量实验证实骨髓间充质干细胞在诱导因子及特定微环境下可诱导分化为肝细胞,并已广泛用于终末肝病的临床替代治疗,而其最佳诱导条件目前尚不清楚。 目的：初步探讨中草药红景天苷联合淤胆大鼠血清体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的可行性和有效性。　 方法：采用全骨髓贴壁培养法从大鼠骨髓中获取骨髓间充质干细胞,流式法检测干细胞表型;胆总管结扎切断法制备大鼠淤胆血清。取第3代骨髓间充质干细胞分3组体外诱导培养：空白对照组,基础培养基+5%淤胆血清;红景天苷组：基础培养基+5%淤胆血清+30 µmol/L红景天苷;阳性对照组：基础培养基+5%淤胆血清+20 µg/L肝细胞生长因子;观察各组诱导培养过程中细胞形态变化,RT-PCR法、Western-Blot法检测各诱导组肝细胞特异性蛋白表达水平。 结果与结论：骨髓间充质干细胞高表达CD90、CD105,不表达CD45、CD14、CD34、CD79a;空白对照组、红景天苷组、阳性对照组细胞在诱导培养中均出现多角及双核细胞;空白对照组、红景天苷组、阳性对照组在诱导培养7 d开始出现甲胎蛋白、白蛋白的mRNA及蛋白表达;在同一时间点空白对照组表达率最低(P < 0.05),红景天苷组、阳性对照组间比较,差异无显著性意义(P > 0.05)。与传统淤胆血清体外诱导相比,红景天苷联合淤胆血清能更有效诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

胎肝滤液诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化

目的 探讨胚胎肝组织滤液定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为肝细胞的诱导条件,为肝组织工程提供新的种子细胞来源。 方法 在体外培养体系中加入胎肝滤液,模拟体内肝脏微环境,诱导BMSCs向肝细胞定向分化,以免疫细胞化学检测肝细胞标志物;PAS检测糖原表达;靛青绿染色检测转化细胞的分化程度;测定细胞培养上清液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)的含量以检测其功能状态。 结果 BMSCs经胎肝滤液诱导14d时细胞呈现多角形、卵圆形或圆形细胞的特征性改变;甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)免疫反应、PAS反应和吲哚靛青绿(ICG)摄入实验及上清液中ALT、AST、ALP等酶均在诱导的第7天开始出现,AFP和ALB免疫反应在21d时达高峰;PAS反应和ICG摄入实验随着时间的延长而增强;上清液中的各个酶在14d达高峰,之后呈下降趋势。 结论 胎肝滤液可诱导BMSCs形成具有肝细胞形态和功能特点的细胞。     

尿酸抑制人骨髓间充质干细胞的成脂分化

背景：研究表明一些药物可影响骨髓间充质干细胞的成骨、成脂诱导分化。 目的：观察尿酸对人骨髓间充质干细胞成脂分化的影响。 方法：全骨髓培养法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,在成脂诱导条件下,分别加入0(对照组),0.1,0.2,0.4,0.8 mmol/L浓度尿酸,诱导14,21 d时行油红O染色,倒置显微镜下计数成脂细胞数量。 结果与结论：成脂诱导14 d后,含不同浓度尿酸的诱导组成脂细胞数量较对照组明显减少(P < 0.05),且随着尿酸浓度的增加,抑制成脂细胞生成的效果更为明显(P < 0.05);成脂诱导21 d后,尿酸对骨髓间充质干细胞成脂诱导分化的抑制作用较诱导14 d时更加明显(P < 0.05),同样随着尿酸浓度的增加,抑制作用更加明显(P < 0.05)。说明在体外尿酸能够抑制人骨髓间充质干细胞的成脂分化,并且存在一定的浓度依赖性和时间依赖性。     

骨髓间充质干细胞移植大鼠脑缺血区微血管密度和肝细胞生长因子的表达

背景：应用骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血可促进损伤神经功能的恢复,目前其作用机制尚未明确。 目的：分析骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血保护作用的机制。 方法：采用线栓法复制大鼠大脑中动脉栓塞模型,随机分为假手术组、大脑中动脉栓塞组、溶剂对照组和骨髓间充质干细胞组。骨髓间充质干细胞组于脑梗死1 d后经侧脑室注射入骨髓间充质干细胞,溶剂对照组则注射同等剂量的PBS。 结果与结论：大鼠脑缺血后缺血区皮质可见大量的微血管生成,2周达高峰。骨髓间充质干细胞组缺血区微血管密度显著高于大脑中动脉栓塞组和溶剂对照组(P < 0.01)。治疗后4,7,14 d骨髓间充质干细胞组脑组织中肝细胞生长因子的表达水平显著高于大脑中动脉栓塞组和溶剂对照组(P < 0.01)。提示骨髓间充质干细胞移植可促进大鼠缺血区微血管生成,改善缺血区血运,从而改善脑缺血大鼠的神经功能。     

不同浓度淫羊藿含药血清干预骨髓基质干细胞的成脂分化

背景：如何抑制骨髓基质干细胞成脂分化,促进其成骨分化将是防治骨质疏松的新途径之一。 目的：观察不同浓度淫羊藿含药血清对骨质疏松大鼠骨髓基质干细胞成脂分化的干预作用。 方法：全骨髓培养法培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,12只SPF级SD雌性大鼠按体表面积的方法给予淫羊藿水提液,药物以蒸馏水定容至所需浓度,相当于临床剂量的20倍、10倍、5倍灌胃,连续灌胃7 d后眼眶取血,观察各组干预后7 d成脂分化情况。 结果与结论：中药低、中剂量含药血清组的成脂率低于空白组 (P < 0.01、0.05),说明中药淫羊藿含药血清发挥了抑制骨质疏松骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化的作用。中药各剂量组的组间比较差异无显著性意义(P  > 0.05),但3组成脂率数值方面以中剂量组最佳。     

人骨髓间充质干细胞体外扩增并诱导为肝细胞的试验研究

目的寻找人骨髓间充质干细胞（hBMSC）扩增并向肝细胞方向诱导分化的培养体系,并验证该体系的诱导效率。方法健康成人志愿者骨髓,经密度梯度离心分离人骨髓单个核细胞（hBMMNC）,采用含表皮生长因子（EGF）和血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）的培养液进行扩增培养至1010数量级后,以含肝细胞生长因子（HGF）、碱性成纤维样细胞生长因子4（FGF-4）、制瘤素（OSM）质量浓度各20ng/mL的培养液进行诱导培养,以RT-PCR、酶联免疫吸附分析（ELISA）、流式细胞分析、生物化学检测等方法检测其白蛋白、CK18、甲胎蛋白、尿素等的合成能力及氨代谢能力。结果培养液扩增hBMSC至1010数量级平均需（22.1±2.2）d,扩增后细胞表型特征仍符合hBMSC特征。扩增后的细胞经上述诱导体系诱导后,6d出现甲胎蛋白的合成,9～12d出现白蛋白的合成,18d达到高峰;对氨的代谢和尿素的合成功能在9～12d出现并持续存在。结论以含EGF和PDGF-BB的培养液扩增hBMSC快速,并能很好地保持干细胞的表型特征和诱导潜能。以含HGF、FGF-4、OSM质量浓度各20ng/mL的诱导培养体系,能成功地诱导经扩增后的hBMSC向肝细胞方向转化。     

反复快速皮肤扩张可促进皮瓣表皮生长因子及增殖细胞核抗原的表达

背景：针对目前临床常用的常规扩张法与快速扩张法的不足,提出了反复快速皮肤扩张法。 目的：观察反复快速皮肤扩张对皮瓣表皮生长因子、增殖细胞核抗原表达的影响。 方法：雄性新西兰大白兔随机分为3组：反复快速扩张组、快速扩张组、常规扩张组。 结果与结论：扩张维持第2,3周,反复快速扩张组皮瓣表皮生长因子表达显著高于快速扩张组、常规扩张组 (P < 0.05)。除扩张维持第3周外,其余各时间段,反复快速扩张组成纤维细胞增殖细胞核抗原染色阳性率均显著高于其他两组 (P < 0.05)。扩张维持第4周,反复快速扩张组表皮细胞增殖细胞核抗原染色阳性率显著高于其他组(P < 0.05)。提示反复快速皮肤扩张可能通过促进组织细胞合成与分泌皮瓣表皮生长因子,促进了扩张皮肤中成纤维细胞及表皮细胞的增殖。     

尾静脉注射骨髓基质细胞和腹腔注射粒细胞集落刺激因子治疗大鼠脑梗死

背景：骨髓间充质干细胞具有成神经分化特性,有很多试验也证实粒细胞集落刺激因子可以用于改善脑梗死后的神经功能。 目的：比较静脉移植骨髓间充质干细胞和腹腔注射粒细胞集落刺激因子动员干细胞来治疗大脑中动脉闭塞模型大鼠疗效。 方法：实验以改良的Zea-longa线栓法阻断大脑中动脉建立SD大鼠脑梗死模型,造模24 h后分别通过尾静脉注射骨髓间充质干细胞或腹腔注射粒细胞集落刺激因子。 结果与结论：两种治疗方法均可改善脑梗死模型大鼠的运动和认知功能,且粒细胞集落刺激因子对脑梗死模型大鼠的运动和认知功能的改善比尾静脉注射骨髓间充质干细胞明显,移植后第7,14天,粒细胞集落刺激因子组梗死面积小于骨髓间充质干细胞组(P < 0.05),粒细胞集落刺激因子组BrdU阳性细胞数多于骨髓间充质干细胞组(P < 0.05)。提示粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞治疗脑梗死的疗效可能优于骨髓间充质干细胞静脉注射的移植方法。