人端粒酶反转录酶936-1132氨基真核表达载体的构建及在293T细胞中表达

摘要 背景：人端粒酶反转录酶是端粒酶的重要组成之一,可使端粒酶表现活性从而拮抗端粒缩短或细胞衰老。 目的：构建人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基真核表达载体,并在人胚肾细胞293T表达,为其在细胞内定位研究奠定基础。 方法：以人端粒酶反转录酶cDNA为模板,PCR扩增出带有酶切位点其 C端 936-1132氨基序列片段,并与真核表达载体pcDNA3.1-HisA连接,构建出重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132,将重组质粒转染入人胚肾细胞293T中,使蛋白表达,并对蛋白进行免疫印迹鉴定。 结果与结论：经双酶切和基因测序等方法证实,人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132构建成功,经免疫印迹鉴定可检出融合蛋白。 关键词：人端粒酶反转录酶C端;重组质粒;人胚肾细胞293T;蛋白表达;免疫印迹 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.11.018     

人细胞间黏附分子-1的真核细胞表达与鉴定

目的 构建人细胞间黏附分子-1(ICAM-1)真核表达载体PcDNA3.1(-)-ICAM-1,并在真核细胞COS-7中表达.方法 设计特异性引物,用PCR方法扩增ICAM-1全编码区基因片段,将其连接人真核表达载体pcDNA3.1(-),并通过酶切进行鉴定.用脂质体转染法将真核表达载体pcDNA3.1(-)-ICAM-1转染COS-7细胞,通过免疫荧光和Western印迹分析人ICAM-1蛋白在COS-7细胞中的表达情况.结果 PCR扩增得到人ICAM-1的cDNA片段大小为1800 bp,重组质粒经酶切鉴定和DNA序列分析确定得到真核表达载体peDNA3.1(-)-ICAM-1.荧光显微镜下可见转染重组质粒的COS-7细胞膜上存在荧光分布,而转染空质粒的细胞未见荧光分布.Western印迹检测发现转染重组质粒的细胞存在外源性的人ICAM-1表达,而转染空质粒的则未见ICAM-1表达.结论 成功构建了人ICAM-1真核表达载体,ICAM-1高效表达在转染的真核细胞COS-7表面,为进一步建立稳定表达ICAM-1的COS-7细胞株以及研究ICAM-1及其受体的生物学功能提供了条件.     

鼠β-防御素2(mBD2)真核表达质粒的构建及稳定表达株的鉴定

目的：对小鼠β防御素-2（mBD2）基因进行克隆,构建其真核表达载体,筛选出稳定表达细胞株,并研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤机制。方法：通过向BALB/c小鼠腹腔注射内毒素（LPS）,建立小鼠急性时相反应,取其肺组织提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增小鼠mBD2基因,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后插入相同酶切的pcDNA3.1（＋）真核表达载体,对其进行酶切和测序鉴定。将构建好的真核表达质粒pcDNA3.1（＋）/mBD2转染SiHa细胞,采用G418进行稳定表达株的筛选,用免疫荧光染色和RT-PCR鉴定细胞内mBD2蛋白表达情况。结果：提取小鼠肺组织总RNA,采用RT-PCR方法扩增了250bp左右的产物,通过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,构建了真核表达质粒pcDNA3.1（＋）/mBD2。SiHa被该质粒转染后,在100mg/LG418浓度下筛选20d,得到了稳定表达mBD2的细胞株,用免疫荧光染色显示mBD2蛋白在胞质中有大量表达,RT-PCR反应扩增到了mBD2的mRNA。结论：成功地构建了pcDNA3.1（＋）/mBD2真核表达质粒,mBD2蛋白在SiHa细胞中能稳定表达,这些结果为进一步深入研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤的作用奠定了基础。     

人类基因XAPC7真核表达载体的构建及其在SMMC-7721细胞中的表达

目的:构建pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达载体并检测其在人肝癌细胞系SMMC-7721中的表达.方法:采用PCR法从pET28b/XAPC7重组质粒中克隆得到XAPC7 cDNA全长序列,将之与pMD18-T载体连接、测序后将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中.构建好的pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达质粒经酶切鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞系SMMC-7721,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再应用半定量RT-PCR技术检测转染前后该细胞株XAPC7基因的mRNA表达水平.结果:pcDNA3.1(-)/XAPC7经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因XAPC7的序列完全正确,真核表达载体构建成功;经RT-PCR检测,重组质粒转染株的XAPC7基因mRNA表达水平高于对照组,证实XAPC7基因已经稳定转染到SMMC-7721细胞中并得到表达.结论:成功地建立了人基因XAPC7的稳定转染细胞株,为进一步研究XAPC7的功能奠定了实验基础.     

人细胞间黏附分子-1表达载体的构建及在真核细胞的表达

目的：构建人细胞间黏附分子-1真核表达载体pcDNA3.1（-）-ICAM-1，在真核细胞中表达人细胞间黏附分子-1。方法：设计特异性引物，利用PCR技术扩增出ICAM-1全编码区基因片段，插入到真核表达载体pcDNA3.1（-）中，重组质粒pCDA3.1（-）-ICAM-1用脂质体转染法转染哺乳动物细胞，以间接免疫荧光(IFA)和Western blot分析蛋白质的的表达。结果：PCR扩增得到人成熟ICAM-1的cDNA片段大小为1800bp, 重组子经酶切鉴定和DNA序列分析得到真核表达载体pCDA3.1（-）-ICAM-1。结论：成功构建了人ICAM-1真核表达载体，ICAM-1高效表达在转染的哺乳动物COS-7细胞表面，为进一步建立稳定表达ICAM-1的COS-7细胞株以及研究ICAM-1及其受体的生物学功能提供了条件。     

结核杆菌热休克蛋白-65重组质粒的构建及其在真核细胞中的初步表达

目的构建结核杆菌热休克蛋白-65(HSP65)真核表达质粒,并探讨其在人肺癌细胞系A549中的表达. 方法用PCR的方法从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出HSP65基因,并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建成重组质粒pcDNA3.1-HSP65;然后用电穿孔的方法将质粒pcDNA3.1-HSP65转染到A549 细胞,经G418筛选后获得抗性细胞克隆;用RT-PCR的方法检抗性细胞中HSP65 mRNA的表达 . 结果经酶切鉴定和DNA序列测定证实重组质粒pcDNA3.1-HSP65构建正确;RT-PCR检测结果发现,重组质粒pcDNA3.1-HSP65转染的A549细胞总RNA中结核杆菌HSP65 mRNA为阳性. 结论真核表达质粒pcDNA3.1-HSP65构建成功 , 并可在真核细胞A549细胞中稳定表达.     

人PSCA基因真核载体的构建与表达

目的 克隆人PSCA(prosaae stem cell antigen)分子的cDNA,构建PSCA基因的真核表达载体,并在体外进行表达和鉴定.方法 从PSCA阳性细胞系LNCaP中提取总RNA,逆转录为cDNA.根据编码人PSCA的基因序列设计引物,以cDNA为模板,采用PCR技术扩增PSCA基因,将该基因插入到pcDNA3.1(+)真核载体,构建pcDNA3.1(+)-PSCA表达质粒.经限制性酶切鉴定和DNA序列测定结果证实后,将重组质粒pcDNA3.1(+)-PSCA转染Hela细胞,检测其体外瞬时表达.结果 测序证实得到人PSCA基因序列,序列分析显示没有发生无义突变.RT-PCR和免疫细胞化学分析结果分别表明转染细胞有目的 基因和分子的表达.结论成功克隆人PSCA基因,并在真核细胞中获得表达,为进一步构建基于PSCA的肿瘤疫苗奠定了基础.     

人RASSF1A基因的真核表达载体的构建及其表达

目的 通过构建人RASSF1A基因的真核表达载体,为研究其在肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞、细胞增殖抑制等方面奠定基础.方法 采用RT-PCR从人外周血的单个核细胞RNA中扩增出人RASSF1A基因的全长cDNA,利用DNA重组技术将其插入到真核表达栽体pcDNA3.1(+)中获得重组质粒.利用脂质体将重组质粒转染入人鼻咽癌细胞株CNE-2中,采用RT-PCR.westem-blot检测RASSF1A的瞬时表达.结果 酶切图谱分析及基因测序证明人RASSF1A基因已被完整、正确地插入到pcDNA3.1(+)质粒载体中,RT-PCR及Western-blot结果显示转染细胞的RASSF1A表达水平上调.结论 成功构建了RASSF1A基因的真核表达栽体pcDNA3.1(+)/RASSF1A.     

pcDNA3.1/hIL-18真核表达载体的构建及表达

目的 :构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并在哺乳动物细胞COS 7和Rlc310中进行瞬时和稳定性表达。方法 :从含hIL 18基因的中介载体 pGEM TEasy( pGEM T/hIL 18)中 ,以限制性内切酶酶切方法获得目的片段 ,克隆入真核表达质粒 pcDNA3.1( )中。以脂质体法转染COS 7和Rlc310细胞 ,用RT PCR检测IL 18mRNA的水平 ,免疫组化染色法检测蛋白表达。结果 :构建了hIL 18基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并可在哺乳动物细胞中瞬时、稳定表达 ,获得了可稳定表达hIL 18基因的Rlc310细胞株。结论 :pcDNA3.1/IL 18的构建及表达 ,为IL 18抗肿瘤作用的研究奠定了基础     

结核杆菌热休克蛋白—65重组质粒的构建及其在真核细胞中的初步表达

目的：构建结核杆菌热休克蛋白－65（HSP65）真核表达质粒,并探讨其在人肺癌细胞系A549中的表达,方法：用PCR的方法从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出HSP65基因,并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1( ）,构建成重组质粒pcDNA3.1-HSP65;然后用电穿孔的方法将质粒pcDNA3.1－65转染到A549细胞,经G418筛选后获得抗性细胞克隆;用RT－PCR的方法检抗性细胞中HSP65mRNA的表达,结果：经酶切鉴定和DNA序列测定证实重组质粒pcDNA3.1－HSP65构建正确;RT－PCR检测结果发现,重组质粒pcDNA3.1－HSP65转染的A549细胞总RNA中结核杆菌HSP65mRNA为阳性,结论：真核表达质粒pcDNA3.1－HSP65构建成功,并可在真核细胞A549细胞中稳定表达。     

Tau蛋白过度表达促进细胞重新进入细胞周期

目的 探讨tau蛋白过度表达对细胞重新进入细胞周期的影响.方法 采用免疫印迹和免疫荧光细胞化学的方法,分别检测稳定转染质粒peDNA3.1-tau和空载体pcDNA3.1的HEK293细胞(HEK293/tau和HEK293/vec)中tau的表达,用细胞周期抑制剂Aphidicolin处理细胞抑制细胞周期,在Aphi...     

人睾丸精子结合蛋白-His6融合蛋白在真核细胞中的表达及亲和纯化

目的:构建含有人睾丸精子结合蛋白基因(testisspermbindingprotein,tsbp)的真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp,并进行表达和纯化。方法:以克隆有tsbp全长cDNA序列的原核表达载体pGEX5X1/tsbp为模板,用PCR扩增tsbp,并通过DNA重组构建真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体稳定转染HEK293细胞后,应用RTPCR、Westernblot和细胞免疫荧光技术检测His6tsbp融合蛋白的表达。选择高表达量的细胞克隆,扩增并用Ni2 NTA金属亲和层析柱(IMAC)从细胞裂解液中纯化融合蛋白His6tsbp,纯化产物的纯度用SDSPAGE和Westernblot进行鉴定。结果:成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体转染HEK293细胞后,用RTPCR检测到tsbpmRNA的表达。细胞免疫荧光染色呈阳性反应,Westernblot检测到培养细胞中有融合蛋白His6tsbp的表达。经Ni2 NTA金属亲和层析柱分离纯化,得到纯化的重组蛋白His6tsbp。结论:构建了pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp真核表达载体,并在HEK293细胞中表达和亲和层析纯化,为下一步的研究奠定了基础。     

小鼠FasL基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建含有小鼠Fas Ligand(FasL)基因的重组真核表达载体,并检测FasL蛋白在其稳定转染的HEK293细胞中的表达情况,为构建表达小鼠Fas L的树突状细胞(DC)模型,深入研究DC联合T细胞防治移植物抗宿主病(GVHD)的新方法奠定基础。方法从小鼠脾脏中提取RNA并逆转录为cDNA,以该cDNA为模板扩增FasL基因,插入pcDNA3.1(+)载体中构建pcDNA3.1(+)-FasL重组质粒,利用脂质体将其转染HEK293细胞,用G418筛选稳定表达细胞系,Western blot确定重组蛋白的表达。结果通过酶切及测序证实FasL序列正确插入表达载体pcDNA3.1(+),Western blot检测证实转染重组质粒的细胞能正确表达FasL蛋白,G418筛选后能够得到稳定表达FasL的抗性细胞株即FasL-HEK293。结论重组质粒pcDNA3.1(+)-FasL和稳定表达FasL的HEK 293细胞成功构建,为后续FasL-DC细胞的研究打下了坚实基础。     

pNTAP-PRAK真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的: 构建pNTAP-PRAK真核表达质粒,并建立其稳定表达的HEK293细胞系。方法: 将人的PRAK亚克隆至串联亲和纯化(tandem affinity purification, TAP)载体pNTAP质粒上,构建成重组质粒pNTAP-PRAK,转化该重组质粒至感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用PolyFect脂质体介导将其转染至HEK293细胞中,再通过G418筛选建立稳定表达TAP tag-PRAK融合蛋白的HEK293细胞系;利用Western blotting和细胞免疫荧光标记法检测融合蛋白TAP tag-PRAK的表达及细胞内定位情况。结果: 重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在HEK293细胞中稳定表达,表达产物TAP tag-PRAK主要分布在核内。结论: 成功构建pNTAP-PRAK真核表达载体并建立了其稳定表达的HEK293细胞系,TAP标签未对PRAK定位产生明显影响。     

Trim6真核表达载体的构建及表达

目的:构建人Trim6的真核表达载体pcDNA3.1(+ )-Trim6,并观察其在HEK293T细胞中的表达.方法:提取HeLa细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增出Trim6编码区全长基因片段,克隆到pcDNA3.1(+),通过酶切、菌落PCR及测序进行鉴定.将该载体转染HEK293T细胞,用蛋白印迹检测Trim6蛋白的表达.结果:通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建人Trim6表达载体,该载体可以在HEK293T细胞细胞系中表达Trim6.结论:构建Trim6真核表达载体pcDNA3.1(+)-Trim6,为研究Trim6在固有免疫应答中的作用奠定了基础.     

大鼠GLUT1真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的：构建大鼠葡萄糖转运体1（GLUT1）的真核表达载体。 方法： 以RT-PCR方法从大鼠脑组织中获取GLUT1全长cDNA片段，将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+)中，构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Glut1，随后用lipofectamineTM 2000介导转染HEK293细胞，以RT-PCR法检测重组质粒在mRNA水平的表达，以免疫组化的方法检测重组质粒在蛋白水平的表达。 结果： 以构建的重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Glut1转染293细胞后，在基因及蛋白表达水平均检测到了葡萄糖转运体1的表达。 结论： 成功构建了携带大鼠葡萄糖转运体1的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Glut1，且证实其可在293细胞中成功表达目的基因，为进一步研究外源性GLUT1表达对缺血缺氧脑细胞的保护作用奠定了基础。     

重组人睾丸精子结合蛋白对蛋白激酶A活性的影响

为探讨人睾丸精子结合蛋白(TSBP)在精子获能及顶体反应中可能发挥的作用,检测了TSBP重组蛋白在体外转染细胞系中对蛋白激酶A活性的影响。构建真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)B/tsbp,稳定转染HEK293细胞后,蛋白免疫印迹检测到培养细胞中融合蛋白的表达。选择表达量高的细胞克隆,扩增并用金属亲和层析柱(IMAC)从细胞裂解液中纯化融合蛋白His6-TSBP。用放射自显影法检测HEK293细胞中蛋白激酶A(PKA)活性,发现重组质粒转染组PKA活性高于对照组,确定了TSBP对PKA活性的促进作用。     

杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达

目的：构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白（alllastin）编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3．1-amastin，并研究其在NIH3T3细胞中的表达。方法：提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增。将扩增的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒pcDNA3．1（＋）中，构建真核表达重组质粒pcDNA3．1-amastin。以pcDNA3．1-amastin转染NIH3T3细胞，采用免疫荧光染色法和RT-PCR分别鉴定pcDNA3．1-amastin的瞬时表达和稳定表达。结果：在细胞膜和细胞内均观察到较强的绿色荧光，表明pcDNA3．1-amastin成功地转入NIH3T3细胞，并在细胞膜和细胞内获得短暂表达。稳定转染的NIH3T3细胞的总RNA经反转录后，用PCR扩增出无鞭毛体蛋白基因，表明获得了稳定表达。结论：成功地构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的真核表达重组质粒，并且该基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达。     

密码子优化HPV16衣壳基因真核共表达载体的构建及细胞转染

目的:构建密码子优化的HPV16衣壳基因真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2.方法:用PCR技术从988载体中获得L1-IRES-L2片段,将该片段克隆到pCR -XL-TOPO 载体,然后定向亚克隆到pcDNA3.1( )真核表达载体中,从而构建真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2;通过水动力转染技术(hydrodynamics-based transfection)和脂质体细胞转染法(liposome-mediated transfection of cells),检测衣壳基因的体内、外转录情况;重组质粒转染后293T细胞后观察其形态变化,用Western blot方法检测293T细胞中L1衣壳蛋白的表达.结果:酶切和测序结果表明真核共表达载体pcD-NA3.1-L1-IRES-L2构建正确.重组质粒中的L1和L2基因在小鼠肝脏、293T细胞中均发生转录.重组质粒转染293T细胞后出现CPE(cytopathic effect)现象,表明衣壳基因在细胞中已表达.Western blot方法检测发现L1蛋白在293T细胞中表达.结论:成功地构建了pcDNA3.1-L1-IRES-L2共表达真核载体,为进一步研究HPV16感染机制奠定基础.     

人PSCA真核表达质粒的构建及稳定转染B16细胞系的建立

目的:构建真核表达质粒pcDNA3.1-PSCA,通过稳定转染建立高效表达人前列腺干细胞抗原(PSCA)的小鼠黑色素瘤B16细胞系。方法:利用PCR扩增出人PSCA全长基因的cDNA编码区序列,使用基因重组技术将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,得到重组表达质粒pcDNA3.1-PSCA。双酶切及测序鉴定后,利用脂质体法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,G418加压筛选后得到阳性克隆。通过流式细胞术、免疫荧光及Western blot检测PSCA在细胞系中的表达情况。结果:经测序及双酶切鉴定,pcDNA3.1-PSCA重组质粒构建正确;稳定转染人PSCA的B16细胞系表达率接近100%。结论:建立的稳定转染人PSCA的B16细胞系能够高效表达PSCA基因,为抗前列腺癌疫苗的功能研究奠定了基础。