羟基丁酸-羟基辛酸聚合物-胶原骨软骨支架的制备及应用

背景：关节软骨修复的关键是软骨和软骨下骨的整体修复,然而目前尚缺乏理想的一体化支架。 目的：制备聚羟基丁酸-羟基辛酸-胶原一体化支架,并分析其基本生物学特性。 方法：以聚羟基丁酸-羟基辛酸、Ⅰ型胶原为材料,通过溶剂浇铸-颗粒沥滤法制备聚羟基丁酸-羟基辛酸-胶原一体化支架,观察支架超微结构,支架孔径及孔与孔的连通情况;液体置换法测定支架孔隙率。将乳兔骨髓间充质干细胞接种于聚羟基丁酸-羟基辛酸-胶原一体化支架上,扫描电镜观察细胞在支架上的黏附状态,MTT法测定细胞在支架上的生长曲线。 结果与结论：一体化支架呈疏松多孔结构,软骨层孔径80-100 μm,骨层孔径200-220 μm,孔隙率(80.0±2.3)%。骨髓间充质干细胞在支架上黏附状态良好,增殖迅速。说明聚羟基丁酸-羟基辛酸-胶原骨软骨一体化支架具备适宜的孔隙结构和良好的生物亲和性。     

以壳聚糖-胶原共混膜为三维支架同种异体工程化软骨的构建

目的探讨以壳聚糖-胶原共混膜为三维支架材料的同种异体软骨细胞构建组织工程化软骨的能力。方法将分离、培养、扩传兔软骨细胞，接种在壳聚糖-胶原共混膜上，倒置显微镜下观察细胞在共混膜上的生长情况。体外培养7d后，将细胞-材料复合物种植在新西兰兔皮下，6周取材，对获得的同种异体工程化软骨进行组织学评价。结果兔软骨细胞接种于壳聚糖-胶原共混膜上4h后有贴壁现象出现，细胞呈梭形。培养48h后，软骨细胞分裂增殖越来越多并向周围延伸，培养第7天取材，HE染色示细胞生长良好，呈梭形。体内培养6周取材，HE染色、Masson染色为均一的成熟软骨组织，且共混膜已降解。结论以壳聚糖-胶原共混膜为支架材料同种异体软骨细胞在有免疫力的动物体内可形成工程化软骨。     

羟基丁酸-羟基辛酸聚合物/胶原软骨组织工程支架的细胞亲和性

背景：已有很多实验证明,单独高分子材料或生物性材料制备的组织工程支架无法满足组织工程研究。 目的：评价羟基丁酸-羟基辛酸聚合物/胶原组织工程支架的生物学特性及细胞亲和性。 方法：以羟基丁酸-羟基辛酸聚合物作为主体材料,按质量分数复合不同比例(2%,4%,6%,8%,10%)的胶原,采用溶剂浇铸-颗粒沥滤法制备组织工程支架。通过扫描电镜观察材料内部结构及孔径大小,液体位移法测定材料孔隙率。将羟基丁酸-羟基辛酸聚合物/胶原支架、羟基丁酸-羟基辛酸聚合物支架分别与兔软骨细胞复合培养,MTT法测定细胞的生长曲线,扫描电镜观察细胞在材料上的生长黏附情况。 结果与结论：羟基丁酸-羟基辛酸聚合物/胶原复合软骨组织工程支架孔径大小200 μm左右,孔隙率为(85±2)%,细胞亲水性随加入胶原比例的增加而升高。与羟基丁酸-羟基辛酸聚合物支架比较,不同比例的羟基丁酸-羟基辛酸聚合物/胶原支架可明显促进软骨细胞的黏附、增殖。证实羟基丁酸-羟基辛酸聚合物/胶原复合支架具备更好的细胞亲和性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料;骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性;组织工程全文链接：     

聚乳酸/壳聚糖纳米纤维/纳米羟基磷灰石支架与兔软骨细胞的相容性

背景：传统的支架材料存在疏水性强,材料表面缺乏细胞表面受体特异结合的生物活性分子,材料的酸性降解产物易引发无菌性炎性反应等不足。根据仿生原理及软骨真实结构和构成来选择和制备组织工程软骨支架能够获得理想效果。 目的：制备聚乳酸/壳聚糖纳米纤维/纳米羟基磷灰石支架,评价其与兔膝关节软骨细胞的生物相容性,探讨其应用于关节软骨组织工程的可行性。 方法：采用二次相分离技术制备聚乳酸/壳聚糖纳米纤维/纳米羟基磷灰石复合支架,将第3代新西兰兔软骨细胞接种至复合支架材料上复合培养,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。细胞-支架复合物在24孔板中培养5 d以后,将其植入裸鼠皮下8周。 结果与结论：聚乳酸/壳聚糖纳米纤维/纳米羟基磷灰石支架材料经化学合成后,具有合适的三维多孔结构,孔隙率为90%,孔径300~450 μm;植入裸鼠皮下8周后Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和甲苯胺蓝染色显示细胞-支架复合物中的软骨细胞可以像天然软骨一样分泌黏多糖和Ⅱ型胶原。提示生物材料聚乳酸/壳聚糖纳米纤维/纳米羟基磷灰石对于兔软骨细胞有良好的生物相容性,可作为生物组织工程支架。     

富血小板凝胶促软骨细胞增殖的体外实验研究

目的：利用二次离心法制备富血小板凝胶,将其与软骨细胞复合,观察软骨细胞增殖与表达,为组织工程软骨构建提供良好支架材料。方法将兔静脉血使用二次离心法制备富血小板血浆,检测其中多种生长因子浓度,并与分离培养的兔软骨细胞混合后以激活剂激活,培养并以MTT法观察软骨细胞增殖情况,使用realtime-PCR方法检测软骨细胞蛋白聚糖、Ⅱ型胶原和SOX-9基因表达,并与普通培养软骨细胞比较,明确富血小板凝胶与软骨细胞混合后软骨细胞增殖表达情况。结果富血小板凝胶萃取液中PDGF-AB、TGF-β1、IGF-1、VEGF生长因子浓度明显高于全血(P<0.05)。富血小板凝胶与软骨细胞复合培养,软骨细胞增殖速度明显高于普通培养软骨细胞(P<0.05)。培养7 d后检测软骨细胞中蛋白聚糖、Ⅱ型胶原和SOX-9基因表达明显高于普通软骨细胞(P<0.05)。结论富血小板凝胶与软骨细胞共培养,可明显促进软骨细胞增殖和表达,是优良的组织工程软骨构建方案。     

以交联透明质酸钠为支架体外构建组织工程软骨

背景：采用组织工程技术再生和重建软骨是目前修复软骨组织缺损效果最好、最有应用前景的方法。 目的：以体外培养的软骨细胞和交联透明质酸钠为支架材料,开发一套体外构建组织工程软骨的完整方案。 方法：分离新西兰兔膝关节软骨细胞,制成细胞悬液滴加于交联透明质酸钠支架上,体外复合培养21 d,提取RNA进行RT-PCR检测,制备冰冻切片进行显微观察和免疫组织化学观察。 结果与结论：软骨细胞接种于交联透明质酸钠支架材料后,可贴附于支架上生长,并且大量细胞聚集成团,在支架材料的纤维间隙中生长或呈单层细胞附着于支架材料纤维。细胞-支架复合物表达软骨组织特异性蛋白聚糖基因和Ⅱ型胶原α1基因,以及软骨组织特异性蛋白Ⅱ型胶原蛋白,可维持软骨细胞表型。表明培养的细胞-支架复合物在体外培养可形成软骨细胞外基质,有望获得组织工程软骨组织。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料;骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性;组织工程全文链接：     

生长分化因子5诱导脂肪干细胞复合Ⅰ型胶原支架成软骨细胞的分化

背景：前期实验中发现生长分化因子5可以诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化,但在复合Ⅰ型胶原支架的体外培养条件下其向软骨细胞分化的能力尚未见研究报道。 目的：探讨生长分化因子5诱导脂肪干细胞复合Ⅰ型胶原支架向软骨细胞分化的能力。 方法：从兔脂肪组织中分离培养脂肪干细胞,使用倒置相差显微镜观察细胞形态,使用免疫荧光对其表型进行鉴定。在复合Ⅰ型胶原支架条件下,加入外源性生长分化因子5对脂肪干细胞向软骨细胞进行诱导,在诱导14 d时,采用苏木精-伊红染色和扫描电镜对诱导的细胞进行形态学观察。在诱导7,14和21 d时,采用反转录PCR方法检测诱导的细胞的Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达情况。 结果与结论：原代脂肪干细胞贴壁生长,呈梭形、多角形分布,细胞表面抗原CD44、CD49d 阳性,CD106 阴性。生长分化因子5诱导的脂肪干细胞与Ⅰ型胶原支架黏附良好,增殖能力旺盛,细胞表面存在着大量的细胞外基质分泌,Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达水平明显增加。说明生长分化因子5能够成功诱导复合Ⅰ型胶原支架的脂肪干细胞成软骨细胞分化。     

组织工程骨-软骨复合支架的构建与优化

背景：制备具有细胞识别信号的细胞外基质替代材料及仿生支架是目前组织工程支架材料研究的重点和热点。 目的：制备并筛选出能够满足构建骨-软骨复合组织要求的多孔三维支架,并评价其生物学性能。 方法：制备胶原-壳聚糖、明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠、胶原-陶瓷化骨、明胶-陶瓷化骨支架材料,以新鲜关节为对照组。 结果与结论：胶原-壳聚糖支架孔径50-200 μm,孔隙率(90.5±2.1)%;明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠支架孔径100- 150 μm,孔隙率(78.0±1.1)%;胶原-陶瓷化骨支架孔径400-500 μm,孔隙率(67.5±2.1)%;明胶-陶瓷化骨支架孔径300-400 μm,孔隙率(65.9±1.2)%。明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠与明胶-陶瓷化骨支架基本符合实验要求,其结构与生物化学成分近似于自然细胞外基质,能够模拟细胞外微环境。说明明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠与明胶-陶瓷化骨支架可作为复合组织的支架。     

关节软骨的修复与修复失败

文题释义： 自体软骨细胞移植：对于3.5-10 cm2的软骨缺损或多个缺损来说,自体软骨细胞移植是一种有效的软骨修复措施,取少量患者自体软骨于体外培养软骨细胞,并增殖到一定数量后植入软骨缺损处,从而达到修复缺损的目的。 基质诱导的自体软骨细胞移植：把经培养增殖后的软骨细胞接种到Ⅰ/Ⅲ型双层胶原膜上,继续培养数日,细胞与支架结合紧密之后,使用生物蛋白胶粘贴到关节软骨缺损病灶底部。术后,软骨细胞从胶原膜上游离并穿过生物胶,迁徙到软骨缺损的基底部。胶原膜和生物胶逐步降解并被吸收。接种的软骨细胞在局部生长、繁殖,并分泌基质,形成新的软骨组织修复缺损。背景：由于关节软骨具有复杂的生物学特性和高度的耐用性,自然退变或创伤引起的缺损都可能导致其结构和功能上不可逆的损害,因此关节软骨损伤后的修复治疗是临床上急需解决的问题。 目的：报告关节软骨修复技术失败最常见的危险因素及其发生率,分析影响选择特定手术治疗方法来处理软骨修复失败最重要的因素。 方法：以“articular cartilage, repair, clinic/clinical failure, surgery”为检索词,检索 PubMed和MEDLINE数据库,时限为2007至2019年,语言限制为英文。初检得到文献约343篇,根据纳入排出标准筛选,共纳入38篇文章进行分析。 结果与结论：①微骨折术和软骨镶嵌成形术在关节软骨修复后的前期和中期显示出不可忽视的失败率,而使用自体软骨细胞移植和异体骨软骨移植修复关节软骨的效果更好。②对于软骨修复失败的治疗：在以往软骨修复失败的患者中应用异体骨软骨移植可能是一个安全的选择,但对于失败的异体骨软骨移植的修复则有更高的失败率;而既往自体软骨细胞移植或基质诱导的自体软骨细胞移植失败的患者,经进一步的自体软骨细胞移植或基质诱导的自体软骨细胞移植治疗后,其治疗效果是可以接受的。此外,有软骨下骨髓刺激病史的患者,自体软骨细胞移植的失败率更高。③软骨修复失败的处理取决于手术治疗失败的类型以及软骨缺损的面积、部位的不同,异体骨软骨移植是治疗软骨下骨髓刺激患者软骨修复失败的最可靠的方法,而自体软骨细胞移植或基质诱导的自体软骨细胞移植在既往软骨修复失败的患者中显示出可以接受的治疗效果,在处理软骨修复失败的患者时,应该特别注意软骨下骨质的情况。ORCID: 0000-0002-3907-9145(张宇) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节;骨植入物;脊柱;骨折;内固定;数字化骨科;组织工程     

兔骨髓间充质干细胞与异体脱细胞耳软骨支架的体外复合*

背景：耳软骨作为脱细胞基质可选择的支架,进行脱细胞处理可去除了软骨细胞的抗原性,从而与种子细胞具有良好的相容性。 目的：体外提取、培养兔骨髓基质干细胞,并与异体脱细胞耳软骨支架复合,观察其生物相容性。 方法：提取兔骨髓间充质干细胞行体外培养,诱导为软骨细胞,以胰蛋白酶-曲拉通联合法获得脱细胞软骨支架,将两者于体外复合,10 d后复合支架固定行组织学染色及扫描电镜观察。 结果与结论：兔骨髓间充质干细胞体外诱导14 d可形成软骨细胞,Ⅱ型胶原免疫细胞化学示胞浆呈棕黄色;兔耳软骨脱细胞基质呈乳白色,组织学染色及扫描电镜观察示经脱细胞后支架孔隙均匀,结构完整,仍保存大量酸性黏多糖及胶原成分。其孔径长度(33.70±4.33) μm,孔隙率(65.23±7.35)%。 复合支架组织学染色及扫描电镜示两者黏附良好,并伴有多量基质分泌。说明兔骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞与异体脱细胞耳软骨有良好的生物相容性。     

Potential use of chitosan as a cell scaffold material for cartilage tissue engineering

One of the most important factors in any tissue-engineering application is the cell substrate. The purpose of this study was the initial evaluation of chitosan, a derivative of the abundant, naturally occurring biopolymer chitin, as a cell scaffold for cartilage tissue engineering. Chitosan scaffolds having an interconnecting porous structure were easily fabricated by simple freezing and lyophilization of a chitosan solution. After rehydration of scaffolds, porcine chondrocytes were seeded onto scaffolds and cultured for up to 28 days in a rotating-wall bioreactor. Chitosan scaffolds supported cell attachment and maintenance of a rounded cell morphology. After 18 days, cells within the scaffolds had synthesized extracellular matrix in which proteoglycan and type II collagen were detected by toluidine blue staining and immunohistochemistry, respectively. Abundant extracellular matrix was found almost exclusively in the periphery of the scaffolds, as scaffold microstructure prevented cells from penetrating to interior regions. Nonetheless, the results suggest that chitosan scaffolds may be a useful alternative to synthetic cell scaffolds for cartilage tissue engineering.     

三维环境下软骨细胞诱导滑膜间充质干细胞向软骨样细胞的分化

BACKGROUND: The co-culture of chondrocytes and synovial mesenchymal stem cells can induce the cartilage differentiation of synovial mesenchymal stem cells in vitro, but the cell differentiation induced by co-culture in vivo is rarely reported. OBJECTIVE: To investigate the chondrogenic differentiation of synovial mesenchymal stem cells co-cultured with chondrocytes on the chitosan/type I collagen composite scaffolds after being transplanted into the subcutaneous layer of Sprague-Dawley rats. METHODS: The synovial mesenchymal stem cells and chondrocytes harvested from the synovial membrane and articular cartilage of Sprague-Dawley rats were obtained by enzyme digestion method and cultured respectively. Passage 3 synovial mesenchymal stem cells and passage 2 chondrocytes, which were divided into four groups: group A (chondrocytes alone), group B (synovial mesenchymal stem cells alone), group C (ratio of synovial mesenchymal stem cells:chondrocytes=1:2) and group D (scaffold material without cells), were cultured on chitosan/type I collagen composite scaffolds and transplanted into the subcutaneous layer of rats followed by morphological observation and immunohistochemical staining at 4 and 8 weeks.   . RESULTS AND CONCLUSION: After 4 and 8 weeks, the discoid-like scaffold was visible. The immunohistochemical staining of type II collagen and the toluidine blue staining of aggrecan were significantly positive in groups A and C. These results show that the co-culture of synovial mesenchymal stem cells and chondrocytes on the scaffold in vivo can form cartilage-like tissues.      

Feasibility of chitosan-based hyaluronic acid hybrid biomaterial for a novel scaffold in cartilage tissue engineering

In this study, we hypothesized that hyaluronic acid could provide superior biological effects on the chondrocytes in a three-dimensional culture system. To test this hypothesis, we investigated the in vitro behavior of rabbit chondrocytes on a novel chitosan-based hyaluronic acid hybrid polymer fiber. The goal of the current study was to show the superiority of this novel fiber as a scaffold biomaterial for cartilage tissue engineering. Chitosan polymer fibers (chitosan group) and chitosan-based hyaluronic acid hybrid polymer fibers (HA 0.04% and HA 0.07% groups, chitosan coated with hyaluronic acid 0.04% and 0.07%, respectively) were originally developed by the wetspinning method. Articular chondrocytes were isolated from Japanese white rabbits and cultured in the sheets consisting of each polymer fiber. The effects of each polymer fiber on cell adhesivity, proliferation, morphological changes, and synthesis of the extracellular matrix were analyzed by quantitative a cell attachment test, DNA quantification, light and scanning electron microscopy, semi-quantitative RT-PCR, and immunohistochemical analysis. Cell adhesivity, proliferation and the synthesis of aggrecan were significantly higher in the hybrid fiber (HA 0.04% and 0.07%) groups than in the chitosan group. On the cultured hybrid polymer materials, scanning electron microscopic observation showed that chondrocytes proliferated while maintaining their morphological phenotype and with a rich extracellular matrix synthesis around the cells. Immunohistochemical staining with an anti-type II collagen antibody demonstrated rich production of the type II collagen in the pericellular matrix from the chondrocytes. The chitosan-based hyaluronic acid hybrid polymer fibers show great potential as a desirable biomaterial for cartilaginous tissue scaffolds.     

旋转反应器胶原支架的制备及复合软骨细胞修复骨软骨损伤的初步研究

目的以胶原为原料开发一种小型胶原支架材料,尝试是否适合旋转反应器来复合软骨细胞,并探讨复合细胞后修复软骨损伤的效果。方法成年猪跟腱中提取胶原,制备胶原支架,进行细胞毒性检测和生物相容性分析。将其切成1 mm~3小块,置于旋转培养器中与软骨细胞共培养,倒置相差显微镜观察细胞贴附效果。建立兔关节软骨缺损模型,编号后,将14只新西兰大白兔随机分为2组:支架材料组(n=8),兔膝关节软骨缺损区植入胶原支架材料和软骨细胞;空白对照组(n=6),不进行任何植入处理。进行HE染色后观察。结果胶原支架呈瓷白色,表面空隙均匀,无细胞毒性,生物相容性良好,但在体内降解较快。在旋转反应器中,支架可以与软骨细胞良好结合。胶原支架植入动物体内12周,虽未完全修复缺损,但已有少量软骨细胞在缺损处出现,修复效果优于对照组。结论制备的胶原支架复合软骨细胞短期内有一定的修复软骨缺损的能力,长期效果欠佳,可能与胶原支架在体内过快降解有关,尚需对制备方法进行改进。     

新型壳聚糖-胶原支架与牙周膜细胞的生物相容性

背景：目前胶原作为牙周组织工程支架材料仍具有机械强度差、降解速度快等缺点,将其与壳聚糖复合可改善上述问题。 目的：评估新型壳聚糖-胶原支架材料的体外生物相容性。 方法：通过MTT法评估100%,75%,50%,25%壳聚糖-胶原支架材料浸提液对人牙周膜细胞的毒性。选择第4-6代生长状态良好的人牙周膜细胞与壳聚糖-胶原支架共培养,观察细胞在支架上的生长情况,并检测与壳聚糖-胶原支架复合培养前后人牙周膜细胞碱性磷酸酶活性的变化。 结果与结论：新型壳聚糖-胶原支架具有双层结构,一侧表面致密,一侧表面疏松多孔。MTT法检测不同浓度材料浸提液毒性评级为0或1级。扫描电子显微镜及组织学观察可见细胞在壳聚糖-胶原支架上增殖良好,且致密层可起屏障膜作用,阻挡细胞进入支架内部;复合培养24 h后,人牙周膜细胞的碱性磷酸酶活性与复合培养前无明显差异(P > 0.05),复合培养48,72 h后人牙周膜细胞的碱性磷酸酶活性高于复合培养前(P < 0.05)。以上结果提示新型壳聚糖-胶原支架具有良好的生物相容性及屏障功能,可进一步应用于牙周组织工程的研究。     

兔肋软骨脱细胞基质的制备

背景：研究表明新西兰兔软骨组织可作为组织工程支架材料,其中关节软骨及耳软骨的脱细胞基质的研究较多,但采用肋软骨作为组织工程软骨支架的研究较少。 目的：制备新西兰兔肋软骨脱细胞基质,探讨天然软骨支架作为组织工程支架的可行性。 方法：用联合去垢剂-酶法获得软骨支架,根据脱细胞过程中Triton X-100第2次处理时间0,24,48,96 h分为4组。脱细胞完毕后各组支架固定行扫描电镜采集图像观察计算支架孔隙率、孔径长度,并对支架进行苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,并将脱细胞支架植入异体新西兰兔皮下观察其相容性。 结果与结论：兔肋软骨脱细胞基质呈乳白色,大小均一,染色示支架结构完整,仍保存大量酸性黏多糖及Ⅱ型胶原成分,扫描电镜观察经一定时间的脱细胞处理后可得到结构完整,孔隙均匀的天然软骨支架,其孔隙率为(61.31±8.45) %;孔径长度为(32.80±5.15) μm,符合正态性分布,各组脱细胞支架植入异体新西兰兔皮下7 d后生物相容性良好,周围软组织无明显充血、化脓等炎症排斥反应出现。结果显示,兔肋软骨脱细胞支架具有良好的基质组成,有较完整、均匀的孔隙结构及孔径分布,可作为组织工程支架材料。     

Proliferation of chondrocytes on porous poly(DL-lactide)/chitosan scaffolds

Porous poly(DL-lactide)(PDLLA)/chitosan scaffolds with well-controlled pore structures and desirable mechanical characteristics were fabricated via a combination of solvent extraction, phase separation and freeze-drying. These scaffolds were further evaluated for the proliferation of isolated rabbit chondrocytes in vitro for various incubation periods up to 4 weeks in order to finally use them for the cartilage tissue engineering. MTT assay data revealed that the number of cells grown on PDLLA/chitosan scaffolds measurably increased with the weight ratio of the chitosan component and was significantly higher than those collected from pure PDLLA scaffolds for the entire incubation period. Scanning electron microscopy examinations, histological observations and proteoglycan measurements indicated that the resulting PDLLA/chitosan scaffolds exhibited increasing ability to promote the attachment and proliferation of chondrocytes, and also helped seeded chondrocytes spread through the scaffolds and distribute homogeneously inside compared to pure PDLLA scaffolds. Immunohistochemical staining verified that these PDLLA/chitosan scaffolds could preserve the phenotype of chondrocyte and effectively support the production of type II collagen.