自制多脏器保存液对大鼠睾丸一氧化氮合酶的影响

背景：在睾丸移植过程中,低温保存和缺血可导致睾丸产生氧自由基而损伤睾丸组织。 目的：观察自制多脏器保存液对低温保存大鼠睾丸一氧化氮合酶的影响。 方法：采用自制多脏器保存液和UW液低温保存大鼠睾丸,分别于保存24,48,72 h时切取睾丸,测定睾丸组织内的总抗氧化能力和一氧化氮合酶活性。 结果与结论：自制多器官保存液低温保存各时点大鼠睾丸一氧化氮合酶活性和总抗氧化能力与UW液组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)。表明自制多脏器保存液能明显减轻低温保存大鼠睾丸氧自由基损伤,其作用与经典的美国威斯康星大学UW保存液基本相当。     

海藻糖对低温保存胸骨中bcl-2和bax基因表达的影响

背景:研究已经证实海藻糖对低温保存中的胸骨具有保护作用,但作用途径尚不清楚。 目的：观察海藻糖对低温保存胸骨bcl-2和bax基因表达的影响。 方法：新鲜配置4组保存液：低钾右旋糖酐组、低钾右旋糖酐+二甲基亚砜组、低钾右旋糖酐＋海藻糖组、低钾右旋糖酐＋二甲基亚砜组＋海藻糖组。切取SD大鼠胸骨后立即分别放入含上述4 种溶液的冻存管中低温保存。抽取新鲜大鼠胸骨组织和低温保存120 d的4组标本,采用RT-PCR方法检测不同保存液保存的胸骨及新鲜胸骨bcl-2和bax基因mRNA表达量。 结果与结论：低钾右旋糖酐+海藻糖组bcl-2表达量高于低钾右旋糖酐组、低钾右旋糖酐+二甲基亚砜组(P < 0.01),但bax表达量低于低钾右旋糖酐组、低钾右旋糖酐+二甲基亚砜组(P < 0.01);低钾右旋糖酐+二甲基亚砜组+海藻糖组bcl-2表达量最高,bax表达量最低,基本接近新鲜骨组织(P > 0.05)。结果提示海藻糖可能通过增强bcl-2基因、抑制bax基因的表达保护低温保存中的胸骨细胞活性,其与二甲基亚砜合用保护作用更好。     

C3A细胞与L-02永生化肝细胞低温保存条件下的生物学特性比较

背景：获得大量功能良好的肝细胞是生物人工肝的核心。探索出一种可靠的肝细胞低温保存方法进而构建一个肝细胞库是目前生物人工肝研究的热点。 目的：比较用UW液在4 ℃条件下保存已经进入Ⅲ期临床试验的C3A细胞与国内构建的永生化肝细胞株L-02细胞的生物学特性。 方法：贴壁培养C3A与L-02细胞,胰酶消化,制备成细胞悬液,UW液保存。4 ℃低温保存0,24,48及72 h后,采用流式细胞术分别测定细胞存活率与凋亡率,测定谷草转氨酶与乳酸脱氢酶释放、尿素合成功能及白蛋白分泌功能。 结果与结论：随低温保存时间延长,C3A与L-02细胞存活率呈下降的趋势,但C3A细胞的存活率明显高于L-02细胞(P < 0.01);细胞凋亡率呈上升趋势,但48 h后C3A细胞同L-02细胞无差异(P  > 0.05)。谷草转氨酶及乳酸脱氢酶释放呈现上升的趋势,但C3A细胞明显低于L-02细胞(P  < 0.01)。白蛋白分泌功能呈下降的趋势,但C3A细胞明显优于L-02细胞(P  < 0.01)。尿素合成功能呈下降的趋势,但是L-02细胞明显优于C3A细胞(P  < 0.01)。结果提示,UW液4 ℃保存C3A细胞与L-02细胞时间不易超过48 h。以C3A细胞为材料的人工肝可能更适用于肝功能衰竭合并低白蛋白血症,以L-02细胞为材料的人工肝更适用于肝功能衰竭合并肝性脑病。     

丹参对大鼠移植肝血红素氧合酶1表达的影响

背景：器官移植前使用丹参预处理能够保护组织缺血-再灌注损伤,改善移植器官存活率。 目的：观察含丹参的冷灌注液对同种异体大鼠移植肝脏中血红素氧合酶1表达的影响,以及对供体肝脏缺血-再灌注损伤的保护作用。 方法：将SD雄性大鼠随机分成UW液组(术中使用UW液灌注保存)、丹参+UW液组(术中使用丹参+UW液灌注保存)、ZnPP预处理组(移植前24 h腹腔内注射ZnPP,术中使用丹参+UW液灌注保存),建立稳定的大鼠同种异体肝移植模型。同时取10只正常大鼠作为正常对照。 结果与结论：丹参+UW液组和UW液组血清总胆红素、谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平明显低于ZnPP预处理组(P < 0.01)。血红素氧合酶1mRNA及其蛋白在丹参+UW液组中较UW组表达更明显,在ZnPP预处理组中表达明显受到抑制(P< 0.05)。丹参+UW液组肝脏Suzuki标准评分明显低于ZnPP预处理组及UW液组(P < 0.05)。表明丹参能上调同种异体的大鼠移植肝脏中血红素氧合酶1 mRNA及其蛋白的表达,减轻供肝缺血-再灌注损伤,保护移植大鼠肝脏。     

自制KYL器官保存液对恒河猴肝脏的保存作用

背景：目前肝脏移植是治疗终末期肝病的最佳方法,UW液是公认的肝脏保存液,但是其价格昂贵,并且细胞外液高K+状态,与人的生理不符,常会导致患者瞬时高钾血症,引起心跳停止,因此研发新的器官保存液已经刻不容缓。 目的：观察自制KYL液对恒河猴肝脏缺血再灌注后的保存效果。 方法：实验选受体猴和供体猴各8只,每组分别包括KYL液组和UW液组各4例供体肝脏灌注并冷保存4 h,行同种异体原位肝移植。分别于移植后30 min、6 h,记录胆汁分泌量,采血检测谷草转氨酶、谷丙转氨酶、一氧化氮、内皮素1、肿瘤坏死因子α浓度,切取肝组织行光学显微镜检测。 结果与结论：两组移植后均有胆汁分泌,随时间延长胆汁分泌量增加(P < 0.05)。移植后30 min、6 h,KYL液组血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶浓度均低于UW液组(P < 0.05),两组血清一氧化氮、内皮素1、肿瘤坏死因子α浓度差异无显著性意义(P > 0.05)。光学显微镜下肝组织形态学观察显示,UW液组较KYL液组肝细胞水肿明显。结果证实,KYL液在预防缺血再灌注损伤效果与UW液总体相当,部分效果略优于UW液。   中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程      

自制移植肝低温保存液对氧自由基的影响

背景：在肝脏移植过程中,低温保存和缺血可导致肝脏产生氧自由基而损伤肝组织。 目的：研究自制器官保存液对低温保存大鼠肝脏氧自由基的影响,并与器官保存液的“金标准”UW液进行对比。 方法：16只9周龄SD大鼠随机分为实验组和对照组,每组8只。建立SD大鼠肝脏灌注模型,分别用自制器官保存液组和UW液组灌洗肝脏,取出肝脏置于4 ℃保存液中,于保存24,48,72 h后分别检测肝脏超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、总抗氧化能力和活性丙二醛水平。 结果与结论：自制器官保存液对大鼠肝脏低温保存各时点超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、总抗氧化能力活性及丙二醛含量与UW液组比较差异均无显著性意义(P > 0.05),表明自制器官保存液能够减轻缺血再灌注后氧自由基对大鼠肝脏的损伤。自制器官保存液对低温保存大鼠肝脏在减轻氧自由基损伤方面有较好的效果,与UW液相当。     

不同冷冻保护剂对低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响

背景：非程序降温-80 ℃低温冰箱保存方便快捷,程序降温-196 ℃液氮保存可靠长久,将两者合二为一简化流程已成功用于临床。 目的：观察不同冷冻保护剂对-80 ℃低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响。 方法：分设10%二甲亚砜组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉组、5%二甲亚砜联合0.25 mol/L海藻糖组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉及0.25 mol/L海藻糖组。采用  -80 ℃低温冰箱转液氮阶梯降温法对单采外周造血干细胞进行冷冻保存,通过透射电镜观察细胞超微结构变化,流式细胞仪观察Annexin-V、PI、Caspase-3水平。 结果与结论：4组冷冻保存细胞的存活率、凋亡率和死亡率差异均无显著性意义(P > 0.05)。透射电镜下各组细胞超微结构变化差异不明显。单个核细胞群落冷冻保存后存活率在90%以上,含成熟细胞较多的CD45⁺细胞群落凋亡发生率可达50%左右。造血干祖细胞群落中,早期细胞较晚期细胞更能耐受冷冻损伤。提示在基础冷冻保护剂二甲亚砜的基础上,加入羟乙基淀粉和海藻糖并未显示出对冷冻保存效果的增强作用。     

海藻糖保护同种带瓣大动脉的最适浓度

背景：目前液氮低温保护组织和器官技术已经非常成熟,但其保护剂一直以来争论不一。 目的：观察不同冷冻保护剂对液氮深低温冻存同种带瓣大动脉组织细胞凋亡和代谢的影响,寻求最佳的冷冻保护剂及冷冻保护剂的最适浓度。 方法：取新西兰大白兔带瓣主动脉、肺动脉标本,将其在液氮中冻存12,15,18个月,冻存液分别使用0.1 mol/L二甲基亚砜,0.1 mol/L海藻糖,0.1 mol/L海藻糖+0.1 mol/L二甲基亚砜,0.2 mol/L海藻糖+0.1 mol/L二甲基亚砜,0.3 mol/L海藻      糖+0.1 mol/L二甲基亚砜。标本复温后,免疫组织化学方法检测标本的细胞凋亡情况,葡萄糖消耗量测定法检测组织细胞的代谢水平。 结果与结论：免疫组织化学和葡萄糖消耗量测定结果均显示经0.1 mol/L海藻糖+0.1 mol/L二甲基亚砜,0.2 mol/L海藻糖+  0.1 mol/L二甲基亚砜冻存液处理的标本冻存效果最好,其次是经0.3 mol/L海藻糖+0.1 mol/L二甲基亚砜处理和经0.1 mol/L海藻糖单独处理的标本,单独使用0.1 mol/L二甲基亚砜处理的标本冻存效果最差。说明海藻糖对液氮深低温保存同种带瓣大动脉活性有很好的保护作用,单独使用海藻糖优于单独使用二甲基亚砜,联合应用海藻糖和二甲基亚砜效果更好,且联合应用的海藻糖最佳浓度范围是0.10~0.20 mol/L。     

肝细胞低温保存的实验研究

在传统的冻存剂配方的基础上,通过降低DMSO的浓度并且添加不同浓度的葡萄糖、蔗糖或海藻糖,探索一种改善人肝细胞冻存效果的新冻存保护剂配方.在传统的冻存保护剂配方中,将DMSO的浓度降低至2% v/v或5%v/v,加人葡萄糖、蔗糖或海藻糖;两周后将肝细胞快速复温,进行存活率、24 h贴壁率和形态学的检测,并与10%DMSO对照,其中5%DMSO+0.3 mol/mL海藻糖组效果最好,复温后肝细胞的存活率、24 h贴壁率均优于其它冻存液组.结果表明,葡萄糖、蔗糖、海藻糖均对人肝的低温保存有一定的保护作用,5% DMSO+0.3 mol/mL海藻糖组是其中最好的浓度配方;海藻糖与DMSO联合使用降低了冻存保护剂DMSO的浓度,表明两者有协同作用.     

肝细胞生长因子对过氧化氢诱导肝细胞凋亡的影响

背景：肝细胞生长因子对多种细胞具有保护作用。 目的：观察肝细胞生长因子对过氧化氢诱导肝细胞凋亡的保护作用及其机制。 方法：采用人LO2肝细胞系,随机分成3组：正常对照组为正常培养的LO2细胞;模型组加入100 mmol/L过氧化氢作用LO2细胞4 h;肝细胞生长因子组加入50 mg/L 肝细胞生长因子预处理LO2细胞24 h,再加入100 mmol/L过氧化氢继续培养4 h后处理细胞。 结果与结论：体外培养的LO2细胞经100 mmol/L过氧化氢作用4 h后,LO2细胞可出现明显的凋亡现象,表现为细胞存活率降低(P < 0.01),Caspase-3蛋白表达增加(P < 0.01),Bcl-2蛋白表达降低(P < 0.01)。给予质量浓度50 mg/L 肝细胞生长因子预处理24 h后再加入100 mmol/L过氧化氢继续培养4 h,LO2细胞的凋亡被显著抑制(P < 0.01),说明肝细胞生长因子可通过增加LO2细胞Bcl-2的表达来抑制过氧化氢诱导的LO2细胞凋亡。     

左卡尼汀强化St.Thomas No.2液对低温离体心脏的保存效果

背景：在心脏瓣膜置换中应用添加左卡尼汀的心脏停搏液可明显减轻心肌线粒体的脂质过氧化反应,保护心肌细胞。 目的：观察加入左卡尼汀的St.Thomas No.2液对大鼠离体心脏低温保存的效果。 方法：利用Langendorff 灌注装置建立SD大鼠离体心脏灌注和工作模型,随机分成4组,其中2组采用 St.Thomas No.2 液作为心脏停搏液与保存液分别保存心脏4 h、6 h,另2组采用添加左卡尼汀的St.Thomas No.2液作为心脏停搏液与保存液分别保存心脏4 h、6 h。 结果与结论：与St.Thomas No.2 液保存4 h组比较,添加左卡尼汀的St.Thomas No.2液保存 4 h组心脏心率、冠状动脉流量、左心室收缩峰压和左心室内最大上升速率及心肌含水量、ATP含量差别无显著性意义(P > 0.05),但心肌酶漏出量明显减少(P < 0.05);添加左卡尼汀的St.Thomas No.2液保存 6 h组上述指标检测结果均优于St.Thomas No.2保存6 h组 (P < 0.05)。提示左卡尼汀强化的St.Thomas No.2液可显著提高大鼠离体心脏的低温保存效果。     

不同保存液对离体大鼠心脏保存效果的研究

目的:研究在冷缺血期3种液体对鼠心脏保存的效果。方法:将24只大鼠随机分为3组,每组8只。3组离体鼠心脏分别用Histidine-tryptophan-ketoglurate(HTK)液,UniversityofWisconsin(UW)液及St.ThomasⅡ(ST)液灌注停跳,并4℃冷冻保存6h。利用离体鼠心非循环式Langendorff灌流功能测定模型,测定左心室舒张期末压(LVEDP)、左心室发展压(LVDP)、左心室压力变化率(dp/dt_max,dp/dtmin)、冠脉流出量(CF),留取冠脉流出液检测心肌酶漏出量,并检测心肌线粒体三磷酸腺苷(ATP),取心肌标本测干湿比。结果:HTK组保存的心肌左心室功能恢复明显优于UW组(P＜0.05),UW组明显优于ST组(P＜0.05),LVEDP恢复HTK组和ST组无显著差异(P＞0.05),但均较UW组恢复好(P＜0.05)。保存后心肌ATP测定值HTK组高于UW组(P＜0.05),UW组高于ST组(P＜0.05)。3组心肌标本测干湿比结果无显著差异(P＞0.05)。结论:HTK液保存心肌效果最好,含有高钾的保存液对冠脉有损害。     

Annexin V assay-proven anti-apoptotic effect of ascorbic acid 2-glucoside after cold ischemia/reperfusion injury in rat liver transplantation

Controversy exists over whether the predominant cell death of hepatocytes is due to apoptosis or necrosis after ischemia/reperfusion injury. In this study we investigated the predominant cell death of hepatocytes after cold ischemia/reperfusion injury using the Annexin V-based assay, and evaluated the anti-apoptotic effect of ascorbic acid 2-glucoside (AA-2G) added to the University of Wisconsin solution (UW solution) in rat liver transplantation. The retrieved liver was preserved in 4 UW solution for 24 h, and then transplanted orthotopically to the syngeneic Wistar recipient. The animals were divided into 2 groups, a control group (n=10), in which liver grafts were preserved in UW solution (4), and an AA-2G group (n=10), in which liver grafts were preserved in UW solution (4) with AA-2G (100 ug/ml). The serum AST level 4 h after reperfusion in the control group was significantly suppressed in the AA-2G group, and the bile production of the liver graft in the AA-2G group was well recovered. The mean survival time in the AA-2G group was significantly improved compared with that in the control group. Annexin-V and Propidium iodide staining 4 h after reperfusion showed a significantly higher percentage of viable hepatocytes in the AA-2G group compared with the control group (93.4 +/- 2.0 vs. 80.3 +- 2.1%, P<0.05). In the control group, the main cell death of hepatocytes was apoptosis (early apoptosis: 10.0 +- 4.7%, late apoptosis: 6.4 +/- 1.7%). The addition of AA-2G to the UW solution significantly inhibited both early and late apoptotic cell death 4 h after reperfusion (early apoptosis: 0.98 +/- 0.88%, late apoptosis: 2.2 +/- 1.1%). The expression of caspase 9 in the immunostaining of the liver graft was suppressed in the AA-2G group compared with in the control group. Our study using the Annexin V-based assay provided evidence that the predominant cell death of hepatocytes was apoptosis after 24 h cold ischemia/reperfusion injury in rat liver transplantation. The addition of AA-2G to the UW solution attenuated 24 h cold ischemia/reperfusion injury by inhibiting the apoptosis of hepatocytes.     

Cell preservation in reparative and regenerative medicine: evolution of individualized solution composition

The expanding complexity of biologics banked for therapeutic applications necessitates the development of improved preservation technologies for support of the emerging fields of reparative and regenerative medicine. Currently, a number of media or "solutions" are utilized for the preservation of biologics. Given the diversity of cell systems utilized in the regenerative medicine arena, we hypothesized that the development of unique (individualized) preservation solutions designed to meet the distinct molecular biological requirements of individual systems would provide for enhanced and extended preservation. To evaluate this hypothesis, coronary artery smooth muscle cells (CASMCs), coronary artery endothelial cells (CAECs), hepatic cells (C3A), and skeletal muscle cells (SKMCs) were hypothermically preserved for 2 to 7 days at 4 degrees C in either cell culture medium, University of Wisconsin Solution (UW or ViaSpan), or HypoThermosol (HTS) variants. Cells were then assayed for viability, using the alamarBlue assay as well as calcein-AM, subsequent to their return to normothermic (37 degrees C) temperatures for up to 5 days. CASMC viability was best maintained when preserved in HTS plus Trolox/EDTA, CAEC viability was highest when preserved in HTS plus Trolox, SKMCs stored in HTS plus Trolox/RGD demonstrated enhanced viability, and C3A cells were best preserved in HTS plus FK041. The data suggest that solution compositions that address the differences in cell death mechanisms limiting preservation efficacy can result in targeted improvement matched to specific cell types. These observations support the custom solution hypothesis of cell and tissue preservation.     

Pregnancy in transplanted mouse uterus after long-term cold ischaemic preservation

BACKGROUND: The aim of this study was to evaluate the viability of the transplanted murine uterus after cold ischaemic preservation. METHODS: Uteri of mice (6-8 weeks old) were isolated and kept at 4 degrees C in vitro for 24 or 48 h in 0.154 mol/l NaCl or University of Wisconsin (UW) solution. Viability was evaluated by assessment of morphology and contractility in vitro. Furthermore, uteri were transplanted by vascular anastomoses to syngeneic recipients after 24 or 48 h cold ischaemic preservation in UW solution and morphology, blood flow and capacity to implant transferred blastocysts were assessed 2 weeks later. RESULTS: Uteri that had been preserved for 24 h exhibited normal morphology but after 48 h preservation minimal degenerative changes were seen. Spontaneous contractions occurred in uteri after 24 h as well as 48 h cold ischaemic preservation and prostaglandin F(2alpha)-stimulated responses were preserved. Blood flow and morphology were normal 2 weeks after transplantation in uteri preserved for 24 h, while grafts preserved for 48 h had a decreased blood flow and morphology showed total necrosis of the transplants. Transplanted uteri that had been preserved for 24 h developed pregnancies (in five out of six animals) after embryo transfer, with offspring showing normal weight and growth trajectory. CONCLUSIONS: This study shows for the first time that the mouse uterus tolerates cold ischaemic preservation and that pregnancies can be carried in transplanted uteri that have been preserved for 24 h.