基因工程促进脂肪干细胞成骨分化的研究进展

<正>大节段骨缺损是骨科、整形外科的常见疾病,严重影响患者的外形和功能。目前临床上常用自体骨移植修复,但这种方法存在着供区骨组织有限、易坏死等缺点。在过去的几十年中,骨组织再生、干细胞移植等方法为修复大量骨组织缺失提供了新的策略。脂肪干细胞(ASCs)是来自脂肪的多能干细胞,可以通过处理诱导分化为成骨细胞,实现骨再生,具有巨大的临床应用潜力。多年来,随着基因工程技术的不断发展,出现了许多对ASCs进行基因修饰以促进其成骨的方法,     

脂肪来源干细胞向成骨分化及褪黑素干预细胞生物学活性的变化

背景：研究表明褪黑素能促进脂肪来源干细胞向神经元转化,但对脂肪来源干细胞成骨分化后细胞的作用报道较少。 目的：观察脂肪来源干细胞向成骨分化及褪黑素对成骨分化后细胞生物学活性的影响。 方法：①取昆明种小鼠附睾处脂肪利用Ⅰ型胶原酶消化法和差速贴壁法获取、纯化脂肪来源干细胞,应用CD44免疫组化染色对细胞进行鉴定。②取第2代脂肪来源干细胞,加入成骨诱导培养基培养,行碱性磷酸酶染色和von Kossa法检测细胞分化情况。③取成骨诱导后的细胞,加入不同浓度的褪黑素,利用MTT法检测24,48 h时细胞增殖情况。④取成骨诱导后的细胞,加入最佳浓度的褪黑素,分别检测加入药物3,6 d时的碱性磷酸酶活性。 结果与结论：①接种48 h后大多数细胞贴壁,接种后4 d细胞呈现多种细胞形态,并形成大小不一的细胞集落,传代后的细胞形态趋于稳定,均称长梭型,培养细胞CD44呈阳性表达,阳性颗粒位于胞膜,呈棕黄色。②成骨诱导后的细胞应用von Kossa法染色呈阳性,黑色沉积物在细胞外的基质中呈网格状分布;碱性磷酸酶染色呈阳性,细胞内可见棕黑色颗粒。③在24 h和48 h时间点,1,10,100 μmol/L组的吸光度值明显大于空白组(P < 0.05),选择这3个浓度作为最佳的褪黑素浓度。④各组成骨诱导后细胞内碱性磷酸酶活性随时间延长明显增加,差异有显著性意义(P < 0.05)。褪黑素组(1,10,100 μmol/L)在3 d时的碱性磷酸酶活性与空白组相比无明显差异(P > 0.05),在6 d时较空白组明显增加(P < 0.05)。提示褪黑素可以增强脂肪来源干细胞成骨分化后细胞增殖,并提高细胞内碱性磷酸酶活性。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

脂肪干细胞成骨分化的研究进展

创伤或肿瘤导致的骨缺损是骨科、整形修复科、口腔颌面外科等科室的常见疾病,现有的治疗手段均有一定局限性。脂肪干细胞(ASC)是来自脂肪组织的多能干细胞,基于ASC的干细胞疗法和骨组织工程,为骨缺损的修复和再生提供了新的思路。ASC成骨分化是多种基因、蛋白和信号通路相互作用的复杂过程,其中Runx2和Osterix、Wnt、骨形成蛋白、Notch、成纤维细胞生长因子、环磷腺苷/蛋白激酶A、Hedgehog、丝裂原活化蛋白激酶等均扮演了重要角色。体外化学诱导ASC的成骨分化已经非常成熟,利用细胞共培养和各种支架也可诱导ASC的成骨分化。验证ASC分化成骨的方法包括茜素红染色和相关基因与蛋白的检测。影响ASC成骨分化的因素包括供体种属、年龄、脂肪获取部位等供体因素,培养液糖浓度、ASC的代数、冻存等实验因素,血管内皮细胞生长因子、生长分化因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子β、尼尔样1型分子、LIM矿化蛋白1、低氧诱导因子1、肿瘤坏死因子α、干扰素γ、IL-6等生长因子,糖皮质激素、雌激素、胰岛素、褪黑素、瘦素等激素,一氧化氮、组蛋白H1、白藜芦醇、曲古抑菌素A、小檗碱、硼替佐米、阿司匹林、辛伐他汀等化学因子及药物,电磁场和超声波等物理因素,拉伸力和剪切力等生物力学因素,钙、锌、锂、锶、硒等金属或非金属离子,微小RNA以及富血小板血清和富血小板纤维蛋白、降钙素基因相关肽、中药和咖啡因等其他因素。本文总结了ASC成骨分化的过程,分析了相关基因和信号通路,回顾了诱导和验证方法,讨论了主要影响因素及其机制,并展望了未来研究方向。     

维甲酸对成纤维细胞及脂肪源干细胞成骨诱导的影响

目的　探究维甲酸（RA）对乳鼠真皮成纤维细胞（DFB）及脂肪源干细胞（ADSCs）成骨诱导分化的影响。 方法　分别离体培养5~7 d龄乳鼠DFB及ADSCs。对DFB进行波形蛋白的免疫荧光鉴定,对ADSCs进行成骨、成脂肪诱导并做表面标记物鉴定。用RA及传统成骨诱导液分别对两类细胞进行成骨诱导2周,茜素红染色检测细胞内钙结节的形成,酶标仪检测细胞诱导后ALP 的OD值。 结果　两类细胞在常规成骨诱导及RA诱导成骨后,均有钙结节形成。传统成骨诱导与RA成骨诱导组与各自对照组相比,ALP活性均升高。在DFB组中,RA诱导的ALP活性比传统成骨诱导高,而在ADSCs组中,结果相反。 结论　RA可以促进DFB及ADSCs的成骨分化,并且因细胞种类不同而显著效果不同。     

miR-302对脂肪间充质干细胞向成脂和成骨分化的调控

背景：间充质干细胞具有自我更新能力,在一定条件下能够分化为一定谱系的细胞,但很多机制至今未明。 目的：探究miR-302b对脂肪间充质干细胞向成脂和成骨分化的调控作用。 方法：miR-302模拟物转染作用于脂肪间充质干细胞进行成骨成脂诱导,对照组转染miR-302阴性对照模拟物miR-NC。采用碱性磷酸酶染色及活性分析、茜素红染色、油红O染色和萃取实验观察miR-302上调对脂肪间充质干细胞成骨和成脂分化的影响,以及Western blot检测miR-302上调后成骨分化转录因子Runx2和成骨早期标志物碱性磷酸酶在脂肪间充质干细胞中的表达。 结果与结论：①碱性磷酸酶沉淀物在miR-302过表达细胞中产生的量均明显少于对照组,进一步发现miR-302过表达实验组碱性磷酸酶活性明显低于对照组(P < 0.05)。②miR-302过表达明显抑制了矿物质沉积钙结节的形成,miR-302上调实验组橘红色的钙结节明显少于对照组。③miR-302过表达实验组油红O染色阳性的细胞数明显高于对照组,进一步表明实验组细胞萃取得到的油红O吸光度值明显上升(P < 0.05)。④成骨诱导第6天时成骨分化转录因子Runx2和成骨早期标志物碱性磷酸酶在miR-302过表达的细胞中都有不同程度的下降。⑤以上结果表明miR-302的上调能够抑制脂肪间充质干细胞的成骨分化,同时促进其向成脂分化。miR-302在间充质干细胞向成脂和成骨分化平衡发挥了双向调控作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

骨髓间充质干细胞成骨分化调控的研究进展

骨髓间充质干细胞具有较强的自我更新能力和多向分化潜能，其应用是目前国际上组织工程领域中重要的研究内容之一。近年来，许多实验室从分子，生化，物理等水平对其成骨分化调控进行了深入研究，取得了较大的进展。     

microRNA-373参与调控人脂肪来源间充质干细胞成骨分化

目的用microRNA-373(miR-373)的模拟物转染人脂肪来源Flk1+间充质干细胞(MSC),探讨microRNA-373对Flk1+MSC成骨分化的影响。方法利用脂质体作为载体,用miR-373模拟物瞬时转染Flk1+MSCs,然后对其进行成骨诱导,碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色观察成骨情况,real-time PCR技术检测成骨标志性基因的表达。结果 ALP染色和茜素红可见明显差异;real-time PCR检测结果显示,实验组(miR-373组)成骨标志基因runt相关转录因子2(RUNX2)(0.543±0.021)、ALP(0.556±0.024)和骨钙蛋白(OC)(0.499±0.017)的表达都明显低于对照组(NC组)(P<0.05)。结论 miR-373参与调控Flk1+MSC向骨细胞分化。     

生物支架材料诱导脂肪来源干细胞成骨分化的最新热点

文题释义： 脂肪干细胞的优势：脂肪来源干细胞具有以下特点：高增殖能力和分泌活性;兼具多向分化潜能;通过其免疫调节能力,能够提高移植后的愈合效果;来源丰富,可在自体或异体上迅速提取,以上优势使其成为骨组织工程的理想种子细胞。 骨组织工程支架材料的分类：主要分为3类,无机材料、天然高分子材料、合成高分子材料,无机材料包括羟基磷灰石、磷酸三钙、生物活性玻璃、钛金属、镁金属,天然高分子材料包括胶原、丝素蛋白、壳聚糖,合成高分子材料包括聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物-聚乳酸-羟基乙酸共聚物。 背景：脂肪来源干细胞获取便捷且具有显著的成骨分化能力,被认为是骨缺损修复的理想种子细胞。然而骨组织工程学的研究进展揭示,生物支架材料改性能够直接调控干细胞的成骨分化。 目的：综述能够调控脂肪来源干细胞成骨分化效果的各种生物支架材料。 方法：由第一作者通过检索中国知网、万方、维普、PubMed、Embase和Web of Science数据库2016年1月至2019年5月发表的相关文献,检索词为“脂肪干细胞,支架材料,成骨,金属,钛;Adipose derived stem cells,scaffold,osteogenic,metal,Ti”,最终选取符合标准的文献62篇。 结果与结论：用于骨组织工程的支架材料分为无机材料、天然高分子材料、合成高分子材料3类,无机材料包括羟基磷灰石、磷酸三钙、生物活性玻璃、钛金属、镁金属,天然高分子材料包括胶原、丝素蛋白、壳聚糖,合成高分子材料包括聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物-聚乳酸-羟基乙酸共聚物。设计能与细胞相互作用以指导其生物反应和骨分化的材料研究一直层出不穷,但如何营造更安全、更合理、更贴近生物体内的细胞的生长微环境仍然面临着很多困难。对生物支架材料的改性能够直接调控干细胞的成骨分化,同时成骨诱导之外的血管化及植入后的感染也是需要关注的问题。 ORCID: 0000-0003-4520-3031(张圣敏) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

成人脂肪间充质干细胞的定向成骨诱导

背景：脂肪分离可获得大量的间充质干细胞并成功向骨、软骨、脂肪、心肌等多个方向诱导分化。 目的：建立成人脂肪间充质干细胞体外分离培养、成骨分化方法,并探讨脂肪间充质干细胞作为骨组织工程的种子细胞的前景。 方法：通过胶原酶消化法从成人脂肪中分离间充质干细胞,进行体外培养,流式细胞仪检测细胞表面标记物,CCK8检测细胞活性,成骨诱导液诱导干细胞向骨细胞分化,BCIP/NBT比色法染色检测碱性磷酸酶,茜素红染色检测钙结节形成,RT-PCR检测碱性磷酸酶,骨桥蛋白表达变化。 结果与结论：利用脂肪抽吸液成功培养出脂肪间充质干细胞,且能稳定传代,增殖能力旺盛;流式细胞仪检测证实有特定的间充质干细胞表面标记物表达;成骨诱导脂肪间充质干细胞后呈典型的成骨细胞形态;碱性磷酸酶染色阳性,茜素红染色后可见钙结节形成,成骨诱导培养0,3,7,14,21,28 d,RT-PCR定量检测结果证实碱性磷酸酶、骨桥蛋白阳性表达。说明用酶消化法可以从人脂肪中分离得到脂肪间充质干细胞;脂肪间充质干细胞可向骨细胞诱导分化,阳性表达骨桥蛋白,碱性磷酸酶,是一种优良的骨组织工程的种子细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

骨髓间充质干细胞成骨分化调控的研究进展

骨髓间充质干细胞具有较强的自我更新能力和多向分化潜能 ,其应用是目前国际上组织工程领域中重要的研究内容之一。近年来 ,许多实验室从分子、生化、物理等水平对其成骨分化调控进行了深入研究 ,取得了较大的进展     

人脂肪源干细胞分离培养及向成骨细胞的诱导分化

背景：脂肪源干细胞可分泌众多的免疫调节因子,不引起T细胞的细胞毒作用,并可通过调整T淋巴细胞的种类和数量。 目的：探讨人脂肪源干细胞在体外分离培养扩增的方法及向成骨细胞诱导分化的能力。 方法：以0.1%的Ⅰ型胶原酶通过组织消化的方法分离人脂肪组织中的干细胞,体外扩增培养至第2代后检测其表面抗原的表达,并在成骨诱导液中促进其向成骨细胞的分化,通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色及对碱性磷酸酶的RT-PCR检测来明确其分化能力。 结果与结论：体外分离培养的脂肪源干细胞生长稳定,扩增速度快。流式细胞仪检测结果显示其高表达干细胞相关抗原。向成骨细胞诱导后经免疫组化染色可见矿化结节形成,RT-PCR检测发现碱性磷酸酶表达阳性。提示脂肪源干细胞在体外分离培养方法简单,扩增速度快,并具有定向分化的能力,是可靠的组织修复和细胞治疗的种子细胞来源。     

The role of epigenetic modifications in the osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells

ABSTRACT

Over the last decade, stem cells have drawn extensive attention from scientists due to their full potential in tissue engineering, gene therapy, and cell therapy. Adipose-derived stem cells (ADSCs), which represent one type of mesenchymal stem cell (MSC), hold great promise in bone tissue engineering due to their painless collection procedure, their ability to self-renew and their multi-lineage differentiation properties. Major epigenetic mechanisms, which involve DNA methylation, histone modifications and RNA interference (RNAi), are known to represent one of the determining factors of ADSC fate and differentiation. Understanding the epigenetic modifications of ADSCs may provide a clue for improving stem cell therapy in bone repair and regeneration. The aim of this review is to present the recent advances in understanding the epigenetic mechanisms that facilitate ADSC differentiation into an osteogenic lineage, in addition to the characteristics of the main epigenetic modifications.     

Impact of adipogenic differentiation on stemness and osteogenic gene expression in extensive culture of human adipose-derived stem cells

Introduction

Adipose tissue is a source of multipotent adult stem cells. Most studies on human adipose-derived stem cells (ASC) have been on the early passages. Studies in extensive expansion have not been well established yet. In this study, we aim to investigate the effects of extensive expansion on the adipogenic differentiation capability of ASC.

Material and methods

The ability of ASC to undergo adipogenic differentiation in extensive expansion was evaluated by morphological changes, differentiation assay by using Oil Red O staining and changes in the genes expression levels of adipogenic genes, osteogenic genes and stemness genes using quantitative polymerase chain reaction (qPCR) after induction.

Results

Morphological study showed that the formation of lipid droplets can be observed at all passages but decreased at P20 after induction. Data from qPCR showed that most adipogenicgenes expression increased significantlyat P5, P10 and P15 but decreased at P20 after induction. On the other hand, osteogenic genes showed no significant changes after adipogenic induction indicating low potentiality of adipogenic-induced ASC to become osteogenic cells. While stemness genes expression levels showed a decrease or no significant changes after adipogenic induction except Nanog3, which showed a significant increase at P15 and P20.

Conclusions

The ability of ASC to differentiate into mature adipogenic cells decreased after P10 and the decrease in the osteogenics gene expression level during adipogenic induction suggested that the osteogenesis and adipogenesis are not parallel events.     

Mouse adipose-derived stem cells undergo multilineage differentiation in vitro but primarily osteogenic and chondrogenic differentiation in vivo

Human, rat, and mouse studies have demonstrated the existence of a population of adipose-derived adult stem (ADAS) cells that can undergo multilineage differentiation in vitro. However, it remains unclear whether these cells maintain their multilineage potential in vivo. The aim of this study was to examine the in vitro and in vivo characteristics and behavior of a potential population of murine ADAS (muADAS) cells isolated from the visceral fat of the abdominal cavity of C57BL/10J mice. We used flow cytometry to examine the cells' expression of CD29, CD31, CD45, CD34, CD44, CD144, CD146, Flk1, and Sca-1. The isolated cell population was CD45 negative, which precludes contamination by hematopoietic cells, but was partially positive for Sca-1 and CD34: 2 stem-cell markers. After induction in conditioned medium, the muADAS cells gained the ability to undergo adipogenic, osteogenic, chondrogenic, myogenic, and hematopoietic differentiation in vitro. The muADAS cells readily differentiated to form bone and cartilage in vivo for up to 24 weeks, but their ability to regenerate muscle or reconstitute bone marrow was found to be limited.     

微渠多孔羟基磷灰石支架诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的miRNA表达谱分析

文题释义： 羟基磷灰石：是目前最为理想的生物活性材料,具有生物相容性、骨传导性和骨诱导性,植入人体后对组织无刺激和排斥作用,能与骨形成很强的化学结合,用作骨缺损的充填材料,能为新骨的形成提供支架,发挥骨传导作用,是理想的硬组织替代材料。 MicroRNA(miRNA)：是一类内生的、长度为20-24个核苷酸的单链小分子RNA,由具有发夹结构的70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成,其可以通过几个miRNAs的组合在转录后水平精细调控基因的表达。 背景：多孔羟基磷灰石支架具有良好的体内外成骨效能,但其所涉及的miRNAs复杂调控机制相关研究较少。 目的：探讨多孔羟基磷灰石支架材料介导大鼠骨髓间充质干细胞成骨矿化过程中相关miRNA表达谱的变化。 方法：体外分离、培养和鉴定大鼠骨髓间充质干细胞,将骨髓间充质干细胞与多孔羟基磷灰石支架共培养为实验组,骨髓间充质干细胞单独培养为空白对照组,分别进行成骨诱导7 d,运用miRNA高通量测序技术分析两组骨髓间充质干细胞成骨矿化过程中相关miRNA表达谱的变化并进行GO分析,筛选出两组中表达差异明显的miRNA分子并进行qRT-PCR验证。 结果与结论：①与空白对照组比较,成骨诱导7 d时实验组BMP2、ALP、Runx2 mRNA表达上调,其中BMP2上调明显(P < 0.05);②microRNA高通量测序结果显示miR-210-3p、miR-146a-5p等13个miRNAs明显上调;let-7c-3p、let-3615等17个miRNAs明显下调;③GO分析上调的miRNA靶基因主要参与生物学调节、细胞基因表达、基因表达调节等,包括NF-κB、Toll样受体9、细胞间黏附、白细胞介素1调节、血管生成、Hippo等信号通路;④实时荧光定量qPCR验证结果显示miRNA-210在实验组上调15倍,miR-146a-5p在实验组上调10倍(P < 0.05);⑤结果表明,新型微渠多孔羟基磷灰石支架可以通过上调骨髓间充质干细胞miRNA-210-3p和miR-146a表达,促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。 ORCID: 0000-0002-8722-1548(郑佳俊) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

脂肪干细胞诱导分化的现状及前景

背景：脂肪干细胞是由中胚层发育而来的多能干细胞,在特殊的生长因子和环境等诱导培养条件下,可以向不同的谱系分化。 目的：详细阐述脂肪干细胞诱导分化的条件及鉴定方法。 方法：应用计算机检索万方数据库及PubMed数据库2005至2014年10年间的文献,中文检索词为“脂肪干细胞,诱导,分化”;英文检索词为“adipose derived stem cells,differentiation”。依据纳入排除标准选择37篇文献进行归纳总结。 结果与结论：脂肪干细胞在抗坏血酸、胰岛素、地塞米松、转化生长因子β作用下可向软骨细胞分化;成脂诱导液的配方包括3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、胰岛素、地塞米松、吲哚美辛;成骨分化常用的诱导剂包含地塞米松或维生素D3、抗坏血酸,β-甘油磷酸钠;碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子及维生素B27可联合应用诱导脂肪干细胞成神经分化;向心肌细胞分化普遍应用的诱导因子是5-氮杂胞苷;血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子共同作用可以诱导脂肪干细胞向血管内皮细胞分化。随着分子生物学和细胞生物学的迅速发展,脂肪干细胞的分化研究也会更加深入,在目前对脂肪干细胞诱导分化现象观察的基础上,应加强对其内在的分子机制及调控脂肪干细胞可塑性的基因和蛋白的研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：