尿酸对人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中Wnt信号通路的影响

背景：尿酸作为一种内源性的抗氧化剂,其抗氧化、抗DNA 损害作用及发挥促成骨作用近年受到关注。目的：探讨不同浓度尿酸对人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中Wnt/β-catenin 信号通路相关基因表达的影响。方法：采用全骨髓贴壁法体外分离培养健康成年人骨髓间充质干细胞,培养至第3代时,用含不同浓度尿酸(0,140,280,560 μmol/L)的成骨诱导液进行成骨向诱导分化培养,检测细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶活性、增殖能力以及Wnt信号通路中Wnt-3α,β-catenin mRNA的表达。结果与结论：各组细胞碱性磷酸酶染色为阳性,尿酸干预后各组细胞碱性磷酸酶活性和增殖能力增高,Wnt信号通路相关基因Wnt-3a、β-catenin的表达上调,且呈现浓度依赖性,各指标在实验组与对照组间比较以及实验组组间比较,差异均有显著性意义(P < 0.05)。结果显示尿酸可通过促进Wnt-3a/β-catenin信号通路进而促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞增殖和分化,具有浓度依赖性。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

胰岛素样生长因子1对小鼠成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响

背景:胰岛素样生长因子1是骨形成的调节因子,具有促进有丝分裂、促进成骨等作用。由骨细胞所产生的胰岛素样生长因子1在调节成骨细胞和破骨细胞介导的骨骼重建中起着重要的作用。目的:观察胰岛素样生长因子1作用后,小鼠成骨细胞的增殖和碱性磷酸酶的表达。方法:在体外培养的小鼠成骨细胞中分别加入25,50,100及200μg/L的胰岛素样生长因子1,于培养的第1,2,3,4,5天用Cell CountingKit-8比色法检测细胞增殖率;用流式细胞仪检测细胞的增殖周期和凋亡率;于培养的第3,6,9天应用酶联免疫法检测细胞内碱性磷酸酶活性。结果与结论:胰岛素样生长因子1质量浓度在25～200μg/L时,对小鼠成骨细胞的增殖率有明显的促进作用(P0.05),且呈明显的浓度依赖效应。当胰岛素样生长因子1质量浓度在200μg/L时,能明显提高细胞S期所占的比例。说明胰岛素样生长因子1可加速细胞的增殖活动,以保证参与骨改建的成骨细胞数量而促进骨组织再生。同时,胰岛素样生长因子1在25～200μg/L时,能显著提高细胞内碱性磷酸酶活性(P0.05),促进成骨细胞分化。     

牙周膜干细胞成骨分化中细胞因子的作用

背景：牙周膜干细胞是牙周组织中的成体干细胞,具有高度增殖、自我更新能力和多分化潜能。促进牙周膜干细胞向成骨细胞分化有助于牙周疾病的治疗。 目的：观察胰岛素样生长因子1和成纤维细胞生长因子2对牙周膜干细胞向成骨细胞分化的影响。 方法：采用胶原酶消化人牙周膜组织,获得牙周膜干细胞,经体外鉴定、扩增后,通过倒置显微镜、苏木精-伊红染色、流式细胞仪对牙周膜干细胞进行生物学检测。分别在成骨细胞诱导培养液中加入成骨诱导液(对照组)及胰岛素样生长因子1和成纤维细胞生长因子2持续诱导7,14 d后,进行碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性检测,以及茜素红染色,并用实时定量PCR法检测向成骨细胞分化的标志性基因的表达情况。 结果与结论：胰岛素样生长因子1刺激组的碱性磷酸酶活性以及钙化结节明显高于对照组,Runx2、Alp、col-1的mRNA呈高表达;成纤维细胞生长因子2刺激组的碱性磷酸酶活性以及钙化结节也高于对照组,Runx2、Alp、col-1的mRNA表达量也高于对照组。提示胰岛素样生长因子1和成纤维细胞生长因子2在不同程度上促进体外培养的牙周膜干细胞向成骨细胞方向分化。     

模拟失重状态下成骨细胞胰岛素样生长因子1基因表达与降钙素的干预

背景：航天飞行、长期卧床等低重力负荷状态会引起骨吸收和骨形成的代谢紊乱,导致骨质疏松。有研究显示降钙素有直接促进成骨细胞增殖的作用,并可增加成骨细胞胰岛素样生长因子1 mRNA的表达。 目的：观察降钙素和体外模拟失重状态对成骨细胞功能及胰岛素样生长因子1基因表达的影响。 方法：采用二次酶消化法提取新生SD大鼠颅骨的成骨细胞,凝胶化形成成骨细胞海藻酸钠微包囊后进行实验。实验分为正常重力组、模拟失重组、模拟失重+降钙素(10,40,80 IU/L)组。将细胞置于模拟失重三维回转培养器中培养72 h后,检测成骨细胞的增殖、凋亡及碱性磷酸酶活性;采用RT-PCR 方法检测胰岛素样生长因子1、碱性磷酸酶、骨钙素mRNA的表达。 结果与结论：与正常重力组比较,模拟失重组细胞增殖率及培养基中碱性磷酸酶活性均明显降低(P < 0.01),胰岛素样生长因子1、骨钙素、碱性磷酸酶mRNA表达减少,凋亡增多;与模拟失重组比较,模拟失重+降钙素组细胞增殖率,胰岛素样生长因子1、骨钙素、碱性磷酸酶mRNA表达均有所增加,但无剂量依赖关系。说明降钙素可通过上调胰岛素样生长因子1 mRNA表达改善模拟失重条件下成骨细胞的增殖与分泌功能。     

辛伐他汀对成骨细胞增殖分化及连接蛋白43表达的调控

背景：辛伐他汀对成骨细胞增殖分化的影响以及分子机制尚不完全明了,尤其对连接蛋白43的作用知之甚少。 目的：探讨辛伐他汀对成骨细胞增殖分化及成骨基因和连接蛋白43表达的调控作用。 方法：选取新生SD大鼠,采用颅盖骨消化法培养成骨细胞。采用不同浓度辛伐他汀(0.062 5,0.125,0.25,0.5和1.0 μmol/L)处理成骨细胞,MTT检测辛伐他汀对成骨细胞增殖作用的影响;碱性磷酸酶活性检测辛伐他汀对成骨细胞分化作用的影响;实时定量RT-PCR和免疫印迹检测细胞成骨基因和间隙连接蛋白43 mRNA和蛋白的表达。 结果与结论：细胞培养第3天,辛伐他汀组各浓度组MTT吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05);但是培养第4天和第5天,辛伐他汀各浓度组MTT吸光度值低于对照组(P < 0.05)。通过不同浓度辛伐他汀处理成骨细胞后,与对照组比较,成骨细胞碱性磷酸酶活性增加(P < 0.05),且0.25 μmol/L 浓度组作用对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响最为显著。采用0.25 μmol/L辛伐他汀处理成骨细胞后,辛伐他汀组与对照组比较,成骨细胞骨钙蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原和连接蛋白43 mRNA和蛋白表达均增加(P < 0.05)。提示辛伐他汀可能通过上调成骨基因和间隙连接蛋白43 mRNA和蛋白的表达来抑制成骨细胞增殖和促进其分化,这为他汀类药物治疗骨质疏松症提供新的干预靶点。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

人成骨细胞分化及骨保护素分泌:R-脊椎蛋白1通过Wnt/β-catenin通路的作用

背景:研究表明Wnt/β-catenin信号通路活性受抑是类风湿关节炎骨侵蚀的始动因素,增强该通路有望治疗类风湿关节炎关节破坏。R-脊椎蛋白1(RSpo1)可能是Wnt激活剂,尚无人成骨细胞相关研究。目的:验证R-脊椎蛋白1抑制DKK1促进该细胞的分化成熟。方法:给予S40转染人成骨细胞株h FOB 1.19 Wnt-3a、R-脊椎蛋白1及Wnt信号通路抑制剂DKK1不同刺激,通过检测细胞增殖、碱性磷酸酶活性及骨保护素水平,观察R-脊椎蛋白1在成骨细胞中的作用。结果与结论:R-脊椎蛋白1对hF OB 1.19细胞增殖无影响,Wnt-3a上调碱性磷酸酶活性,与R-脊椎蛋白1共刺激可增强该作用;R-脊椎蛋白1可减少DKK1对h FOB1.19细胞碱性磷酸酶活力的抑制作用。R-脊椎蛋白1可提高骨保护素质量浓度,但R-脊椎蛋白1对骨保护素的增强作用大于DKK1对其的抑制作用。提示R-脊椎蛋白1通过抑制DKK1,参与Wnt/β-catenin信号通路,促进成骨细胞分化成熟,分泌骨保护素。     

骨髓基质干细胞成骨分化过程中Wnt、骨形态发生蛋白2信号通路相关因子与辛伐他汀的作用

背景：辛伐他汀可促进体外培养的人或鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化,但作用机制尚不清楚。 目的：观察辛伐他汀对大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化过程中Wnt与骨形态发生蛋白2信号途径中相关因子表达的影响。 方法：取6周龄雌性SD大鼠双侧股骨、胫骨全骨髓进行体外成骨细胞诱导培养。实验分为对照组及SIM组。SIM组加入浓度为10-7 mol/L辛伐他汀,对照组加入等量无水乙醇和PBS。培养14 d,行碱性磷酸酶染色,28 d时,行von Kossa染色观察细胞外基质矿化情况;培养14,21 d,免疫荧光细胞化学染色观察成骨细胞中β-catenin,Smad1/5,Cbfa1的表达及分布。  结果与结论：大鼠骨髓基质干细胞经体外诱导后可分化为具有碱性磷酸酶活性和矿化细胞外基质能力的成熟成骨细胞。辛伐他汀可显著上调骨髓基质干细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶的表达。同时,与对照组比较,SIM组β-catenin,Smad1/5,Cbfa1表达明显增多(P < 0.05),且呈现明显的核内聚集趋势。说明辛伐他汀促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的作用可能与调控Wnt与骨形态发生蛋白2信号通路中相关因子的表达及细胞内分布有关。     

重组人胰岛素样生长因子Ⅰ对成骨细胞的影响

背景：人胰岛素样生长因子Ⅰ在成骨细胞中含量丰富,与骨密度有密切关系。 目的：观察重组人胰岛素样生长因子Ⅰ对体外培养大鼠成骨细胞的增殖、凋亡及碱性磷酸酶合成的影响。 方法：不同质量浓度重组人胰岛素样生长因子Ⅰ刺激体外培养的大鼠成骨细胞,噻唑蓝法测定活细胞数量;肿瘤坏死因子α单独或与重组人胰岛素样生长因子Ⅰ共同刺激成骨细胞,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率,采用对硝基酚磷酸盐法测定细胞裂解液中碱性磷酸酶活性。 结果与结论：与对照组相比,一定剂量的重组人胰岛素样生长因子Ⅰ能明显增加大鼠成骨细胞数量(P< 0.05),在质量浓度为0.1~100 μg/L时,成骨细胞数量的增加与质量浓度呈正相关;肿瘤坏死因子α在0.1~100 μg/L范围内呈剂量依赖性地促进成骨细胞凋亡(P< 0.05),并使S期细胞减少(P < 0.05),而重组人胰岛素样生长因子Ⅰ能抑制肿瘤坏死因子α对成骨细胞的促凋亡作用(P < 0.05);与对照组相比,重组人胰岛素样生长因子Ⅰ刺激的成骨细胞碱性磷酸酶的活性明显增高(P< 0.05)。重组人胰岛素样生长因子Ⅰ对大鼠成骨细胞有明显的促增殖作用,且能明显抑制肿瘤坏死因子α诱导的大鼠成骨细胞凋亡,提示增加成骨细胞数量可能是重组人胰岛素样生长因子Ⅰ促进骨形成的机制之一;重组人胰岛素样生长因子Ⅰ能促进大鼠成骨细胞碱性磷酸酶的合成,提示重组人胰岛素样生长因子Ⅰ有可能促进骨基质的合成和钙化。     

梓醇促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖过程中Wnt信号通路的变化

 目的：观察梓醇促进大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）增殖过程中Wnt信号通路的变化。方法：（1）采用机械分离及差速贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs,将细胞分为空白对照组与梓醇（1.0 mg/L）处理组,流式细胞术检测各组细胞细胞周期分布情况,计算其增殖指数。（2）实时荧光定量PCR法检测各组细胞中Wnt3a、Wnt5a、Wnt11及β-catenin mRNA的表达水平;Western blotting技术检测各组细胞β-catenin蛋白的表达变化。结果：（1）空白对照组与梓醇处理组BMSCs增殖指数分别为8.90%±0.46%和17.93%±1.68%（P<0.01）。(2）与空白对照组相比,梓醇处理组Wnt5a、Wnt11、β-catenin mRNA及β-catenin蛋白表达均明显提高,但Wnt3a mRNA表达无显著变化。结论：梓醇在促进BMSCs增殖过程中可同时激活经典与非经典Wnt信号通路。     

siRNA沉默WT1对小鼠足细胞Wnt/β-catenin和nephrin表达的影响

 目的:研究小干扰RNA(siRNA) 干扰WT1基因表达的小鼠足细胞Wnt/β-catenin信号通路的变化及其对足细胞活力和nephrin表达的影响。方法:采用RPMI-1640培养基在33 ℃条件下传代培养足细胞,在37 ℃条件下诱导足细胞分化。应用WT1基因的siRNA转染分化成熟的小鼠足细胞,用MTT法测定细胞活力,用实时qRT-PCR和Western blotting技术分别检测mRNA和蛋白的表达。结果:RNA干扰WT1可诱导小鼠足细胞Wnt1 mRNA和蛋白表达上调,p-β-catenin水平降低及足细胞活力下降,伴有足细胞nephrin mRNA和蛋白的表达明显下调。结论: 沉默WT1基因的表达可诱导足细胞活力下降和nephrin表达下调,可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。     

乳腺癌中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达及意义

目的:本研究旨在探讨乳腺癌组织和细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt-1和β-catenin的表达及意义。方法:选取我院于2015年1月~2017年1月间收治的150例乳腺癌患者作为研究对象。150例乳腺癌的肿瘤组织样本(实验组)来源于手术切除的、临床病理资料保存完整的乳腺癌石蜡切块;相应的临近非肿瘤组织样本(对照组)取自距离肿瘤组织0.5~1 cm的上述乳腺癌患者相应癌旁组织。采用real-tme PCR和Western blot法检测Wnt-1和β-catenin的表达情况。将乳腺癌细胞MCF-7分为3组:阴性对照组(MCF-7细胞)、激动剂组[MCF-7细胞+Wnt3a(1 mg/L)]和拮抗剂组[MCF-7细胞+DKK1(16μmol/L)]。采用real-time和Western blot检测Wnt-1和β-catenin表达情况。结果:与对照组相比,实验组患者Wnt-1和β-catenin的mRNA和蛋白表达量均升高(P0.05)。实验组患者肿瘤组织的Wnt-1表达阳性率和β-catenin表达阳性率均高于对照组(P0.05)。Wnt-1表达与乳腺癌患者肿瘤转移(x~2=5.352,P=0.021)、肿瘤分期(x~2=9.412,P=0.002)及肿瘤直径(x~2=9.412,P=0.002)密切相关(P0.05)。β-catenin表达与乳腺癌患者肿瘤转移(x~2=9.851,P=0.002)、肿瘤分期(x~2=5.661,P=0.017)密切相关(P0.05)。与对照组相比,激动剂组Wnt-1和β-catenin mRNA和蛋白表达量升高(P0.05);与对照组相比,拮抗剂组Wnt-1和β-catenin mRNA和蛋白表达量降低(P0.05)。结论:乳腺癌中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt-1和β-catenin表达上调,且其表达与肿瘤恶性状态密切相关。     

流体切应力对成骨细胞Wnt/β-连锁蛋白信号转导通路的影响

背景：力学刺激对Wnt/β-连锁蛋白信号转导通路对成骨细胞的分化,增殖和凋亡有重要作用。Wnt/β-连锁蛋白信号转导通路的影响是近年来研究的热点。 目的：探讨流体切应力对Wnt/β-连锁蛋白信号转导通路的影响在促进骨细胞骨形成和修复中的作用。 方法：应用计算机检索CNKI 期刊全文数据库和PubMed数据库(1990-01/2009-12)与流体切应力对成骨细胞Wnt/β-连锁蛋白信号转导通路影响有关的文章,纳入43篇符合标准的文献进行综述。 结果与结论：力学负荷刺激Wnt/β-连锁蛋白信号转导通路可提高LRP5 G171V鼠骨细胞骨形成敏感性,导致骨量增多,密度增大。体内和体外力学实验都支持Wnt/β-连锁蛋白信号转导通路是力学刺激的正常反应通路,Wnt/β-连锁蛋白信号转导通路在力学刺激作用下能提高成骨或骨细胞的成骨敏感性。     

Sp3对β-catenin基因转录调控作用初探

 目的:观察转录因子Sp3对β-catenin启动子转录活性的影响,探讨Sp3与Wnt/β-catenin信号通路的关系。方法:采用脂质体法将Sp1和(或)Sp3转录因子表达质粒单独/共同与β-catenin启动子（-410/-1 bp）报告基因质粒瞬时转染HEK293T细胞;通过双萤光素酶报告基因实验检测报告基因转录活性的变化。结果:（1）Sp1表达质粒在0.4 μg剂量时能提高启动子的活性2.4倍,Sp3表达质粒在0.4 μg剂量时能显著提高启动子的活性5.3倍。（2）0.4 μg总量的Sp1与Sp3表达质粒共转染293T细胞,随着Sp3/Sp1比例的递增,β-catenin启动子转录活性无明显变化。（3）共同转染Sp1 0.3 μg与Sp3 0.1 μg时,启动子活性提高3.5倍,比单独转染的转录活性强。结论: Sp3能促进β-catenin基因启动子（-410/-1 bp）的转录,Sp1的转录激活作用则较弱;在转录过程中Sp1和Sp3可能存在协同作用;Sp3可能在转录水平调控β-catenin的表达从而影响Wnt/β-catenin信号通路。     

山柰酚通过Wnt/β-catenin信号通路抑制HBx-HepG2细胞增殖、侵袭及迁移

目的:探讨山柰酚对HBx-HepG2细胞增殖、侵袭及迁移的影响,并研究其潜在分子作用机制。方法:利用实时荧光定量PCR检测相关基因的表达水平,利用蛋白印迹实验检测相关蛋白的水平,流式细胞术检测细胞的凋亡率,MTT实验和平板集落形成实验检测细胞的增殖,Transwell侵袭实验和划痕愈合实验检测细胞的侵袭和转移。结果:山柰酚(10~200μmol/L)能够剂量和时间依赖性地抑制HBx-HepG2细胞的增殖。山柰酚(100μmol/L)能显著抑制HBx-HepG2细胞的集落形成数量、细胞侵袭能力以及细胞愈合率,诱导HBx-HepG2细胞凋亡,引起cleaved caspase-3、cleaved caspase-9及Bax蛋白水平上升,Bcl-2蛋白水平下降,降低β-catenin、c-Myc和cyclin D1 mRNA及蛋白的表达水平。山柰酚(100μmol/L)同时能够降低p-GSK-3β蛋白水平以及细胞质和细胞核中的β-catenin蛋白水平,对GSK-3β蛋白水平没有影响。Li Cl处理能够反转山柰酚(100μmol/L)对HBx-HepG2细胞的增殖、侵袭以及迁移抑制作用。结论:山柰酚对HBx-HepG2细胞的增殖、侵袭及转移有显著的抑制作用,这种抑制作用很有可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性来实现的。     

人参皂苷Rg1通过抑制Wnt/β-catenin通路促进退变人腰椎间盘髓核细胞的生长及胞外基质合成

目的:探讨人参皂苷Rg1对退变人腰椎间盘髓核细胞(HNPCs)生长的调控及其作用机制。方法:培养正常HNPCs,构建HNPCs的氧糖剥夺(OGD)模型模拟退变HNPCs的微环境。光镜观察正常HNPCs和OGD组细胞的形态。分别给予25、50和100μmol/L人参皂苷Rg1后,用real-time PCR和Western blot法分别检测II型胶原(collagen II)和聚集蛋白聚糖(aggrecan)的表达,CCK-8法检测细胞活力的变化,real-time PCR法检测增殖蛋白Ki67的转录水平,流式细胞术检测细胞凋亡水平,caspase-3试剂盒检测caspase-3活性,Western blot法检测Wnt/β-catenin通路蛋白的表达。加入Wnt/β-catenin通路激活剂Li Cl后,检测其对Wnt/β-catenin通路蛋白、细胞活性、细胞凋亡及基质合成蛋白表达的影响。结果:正常HNPCs细胞贴壁快,形态呈类圆形,胞质丰富;OGD组细胞贴壁较慢,形态多为长梭形,胞质减少,初步证实了退变HNPCs模型构建成功。与HNPCs组相比,OGD组中collagen II和aggrecan的m RNA和蛋白表达均显著降低(P0.05),人参皂苷Rg1可升高collagen II和aggrecan的表达(P0.05)。与HNPCs组相比,OGD组的细胞活力显著降低(P0.05),Ki67表达下调(P0.05),而不同浓度的人参皂苷Rg1可增加细胞活力和上调Ki67的表达(P0.05)。同时,不同浓度的人参皂苷Rg1可减少OGD增加的细胞凋亡和caspase-3活性(均P0.05)。此外,100μmol/L人参皂苷Rg1可显著减弱OGD触发的Wnt/β-catenin通路的活化(P0.05)。而用Wnt通路激动剂Li Cl处理后可明显减弱人参皂苷Rg1对OGD细胞的保护作用(P0.05),提示该通路参与人参皂苷Rg1对退变HNPCs的保护作用。结论:人参皂苷Rg1可通过抑制Wnt/β-catenin通路促进HNPCs的生长和胞外基质合成。本研究将为退变HNPCs的防治提供新的思路。