骨髓间充质干细胞移植治疗急性一氧化碳中毒迟发性脑病大鼠*☆

背景：国内多采用药物治疗和高压氧治疗一氧化碳中毒迟发性脑病,但存在疗程长,见效慢,花费高等问题。 目的：观察骨髓间充质干细胞移植治疗一氧化碳中毒迟发性脑病前后神经元及细胞凋亡的变化。 方法：将SD大鼠抽签随机分为假手术组、对照组与干细胞移植组。制作一氧化碳中毒迟发性脑病模型后,干细胞移植组在造模后第0,3,6,12,24,72小时及1周时脑内注射同种异体骨髓间充质干细胞,对照组不进行细胞移植;假手术组扎闭颈外动脉,用PBS代替细胞悬液。 结果与结论：造模后3,6,12,24 h干细胞移植组脑内神经元核心抗原表达明显高于对照组与假手术组(P < 0.01),干细胞移植各组脑内神经元核心抗原表达无明显差异(P > 0.05)。造模后0,3,6 h干细胞移植组脑内细胞凋亡平均吸光度值明显低于对照组与假手术组及其他干细胞移植组(P < 0.05),且移植后第1周明显低于第2,3,4周(P < 0.05)。提示在一氧化碳中毒迟发性脑病大鼠体内移植间充质干细胞可以增加成熟神经元数量,其机制与减少细胞凋亡有关;移植的最佳时机为发病后0~24 h之间,细胞移植后的积极作用在第1周最明显。关键词：一氧化碳中毒迟发性脑病;骨髓间充质干细胞;神经元;凋亡;干细胞移植 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.19.025     

一氧化碳中毒引发迟发性脑病机制的研究进展

机体在短时间内吸入了高浓度的一氧化碳毒性气体即可导致急性一氧化碳中毒,它是冬季较为常见的中毒性疾病之一,尤其在我国的北方地区发病率较高.此病在临床上的致残致死率极高,是急诊科常见的急危重症.患者多在经历一定时间的“假愈期”后发生一氧化碳中毒迟发性脑病,并且无法完全治愈,从而给社会和家庭造成严重的经济负担.但直到现在,一氧化碳中毒迟发性脑病的具体发病机制仍未完全阐明,并存在着多种学说.在此对一氧化碳中毒迟发性脑病发病机制的研究进行探讨,以期为其临床治疗提供新的思路及理论基础.     

活化蛋白-1 在急性一氧化碳中毒迟发性脑病大鼠海马的表达变化

目的:观察急性一氧化碳中毒后不同时间点大鼠海马AP-1 的表达变化。方法:腹腔注射一氧化碳的方法制备一氧化碳中毒迟发性脑病模型,HE 染色观察大鼠海马区病理变化,免疫组化及Western blot 法检测AP-1 的表达水平,TUNEL 染色计数海马CA1 区凋亡神经元。结果:HE 染色,空气组(AC 组)、空白组(BC 组)各时间点海马区细胞形态正常;一氧化碳组(CO 组)海马区细胞肿胀、细胞数目减少,排列紊乱,细胞间隙扩大,细胞核碎裂、深染、固缩。免疫组化:CO 组各时间点AP-1 表达量均高于AC 组及BC 组,3 d 达峰值,组内第3 天与其余各时间点比较差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot:AP-1 表达在时间分布趋势上与免疫组化结果一致。TUNEL 染色:CO 组各时间点凋亡指数均较AC 组、BC 组多,于毒染后7 d 达高峰差异有统计学意义(P<0.05)。结论:大鼠海马区AP-1 表达增高,可能进一步导致细胞凋亡和炎症免疫反应,成为DEACMP 发病的重要机制之一。     

急性一氧化碳中毒后迟发性脑病患者EEG观察

目的:了解一氧化碳(CO)中毒后迟发性脑病(DEACMP)患者从急性CO中毒到DEAC- MP发病期、临床治愈期整个病程中的脑电图(EEG)改变及其在临床上的意义。方法:对60例DEAC- MP患者分别在急性CO中毒期、假愈期、DEACMP期及临床治愈期动态进行EEG检查,并与EEG检查时患者症状轻重进行对比。结果:急性CO中毒期EEG 68%为轻度异常,21%为中度异常;假愈期EEG 86%为界线及正常;DEACMP期EEG均异常,且54例(90%)为中、重度异常,并与患者临床症状轻重程度一致;临床治愈期EEG 82%已正常。结论:EEG动态观察对了解DEACMP病程中各期的脑功能变化及疗效判断有较大的指导价值。     

高压氧治疗一氧化碳中毒后迟发性脑病30例临床疗效观察

目的 观察高压氧治疗一氧化碳中毒后迟发性脑病的临床疗效.方法对30例一氧化碳中毒后迟发性脑病患者进行高压氧治疗,作治疗前、后临床疗效分析.结果高压氧治疗后患者临床症状改善的总有效率为 86.6%.结论高压氧对一氧化碳中毒后迟发性脑病有显著疗效.     

急性一氧化碳中毒后迟发性脑病的脑电图分析

目的:研究急性一氧化碳中毒后迟发性脑病(DEACMP)的脑电图变化。方法:对300例DEACMP患者不同时期的脑电图进行分析。结果:脑电图主要表现为额区广泛性慢波,脑电图的改变随着DEACMP的损伤程度和转归发生一致变化。结论:多次脑电图的检查对DEACMP的病情判断和预后评估及临床治疗有确定的价值。     

大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞和星形胶质细胞分化的研究

目的探讨体外诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化成神经细胞或星形胶质细胞。方法使用四种不同的诱导方式来处理BMSCs:-巯基乙醇(BME)、维甲酸(RA)、无血清培养基以及和新生鼠的脑星形胶质细胞共培养。结果四种方法处理后,BMSCs都能表达神经细胞标示物MAP2或星形胶质细胞标志物GFAP,并伴随着明显的细胞形态的改变。用RA诱导以及在无血清的培养基中培养,BMSCs主要分化成神经元样细胞,表达神经元的标志物MAP2,并且BME能促进这个过程。但在和星形胶质细胞共培养后,BMSCs主要分化成GFAP+细胞。结论BMSCs依赖于不同的诱导条件,具有分化成神经细胞或星形胶质细胞的可塑性。     

一氧化碳中毒后迟发性脑病患者的智能与脑电图分析

目的：观察一氧化碳中毒后迟发性脑病(DEACMP)患者的智力与EEG恢复的关系及其在临床上的指导意义。方法：对66例DEACMP患者定期进行长谷川痴呆量表、常识记忆注意测验、日常生活能力量表和中国修订韦氏成人智力量表、EEG等检测。结果：急性期DEACMP患者的智力与EEG的异常表现一致，均为100％异常，而恢复期EEG较智力恢复明显快。结论：智能及EEG检测对临床诊治DEACMP有较大的指导价值，恢复期智力检测对判断患者恢复情况意义更大，长期坚持治疗及锻炼均能不同程度地恢复患者的智能。     

36例急性一氧化碳中毒后迟发性脑病的P300电位分析

目的　了解急性一氧化碳中毒后迟发性脑病与 P30 0电位之间的联系 ,为诊疗本病提供更多的依据。方法　对 36例急性一氧化碳中毒后迟发性脑病患者与 4 0例健康者分别进行了 P30 0测定和智商测定 ,并将两组结果进行了比较。结果　患病组与对照组比较 ,P30 0电位成份中 N2、P3潜伏期延长 ,P3波幅降低与对照组存在显著性差异 ( P<0 .0 1 )。智商测定中 1 1分量表得分低于对照组 ,存在显著性差异 ( P<0 .0 1或 P<0 .0 5 )。结论　P30 0电位对急性一氧化碳中毒后迟发性脑病的认知功能及疗效判定有一定的价值。     

骨髓间充质干细胞经大鼠冠状动脉内移植可行性研究

目的 研究骨髓间充质干细胞经冠状动脉内移植的安全性及可行性。方法 左侧开胸结扎SD大鼠左冠状动脉，2周后取心脏建立Langerndorff模型。将CM-DiI标记的骨髓间充质干细胞悬液注入主动脉根部，同时收集右心房回流的液体，离心后通过流式细胞仪计数细胞数量。观察是否有细胞经冠状静脉回流及数量比例。并在不同时间测LVSP、LVDP、±dp/dt、心率，评价其安全性。在体实验中取心梗后2周的大鼠，经左心室--主动脉途径将细胞悬液注射到临时阻断的主动脉根部，分别在移植后1及24h和1及4周取材观察细胞在心脏内的位置及细胞的迁移情况。结果 离体实验发现经冠状动脉内注射髓间充质干细胞90%以上的细胞在心肌组织内存留，移植后对LVSP、LVDP、±dp/dt、心率没有明显变化。在体内实验中发现细胞移植后早期大部分细胞分布在心外膜下心肌组织内，在心内膜下组织内较少细胞分布，而且大部分细胞在正常心肌组织内，只有少量在心梗区域。而在细胞移植后1~ 4周存活的细胞多在心肌梗死及交界区组织内，在正常组织内很少有移植细胞存在。结论 经冠状动脉内途径进行细胞移植是安全可行的。     

骨髓间充质干细胞对大鼠异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的影响

目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）对异基因骨髓移植（allo—BMT）后移植物抗宿主病（GVHD）的影响。方法：从大鼠骨髓中分离培养问充质干细胞，通过形态学观察及流式细胞术检测表面标志以鉴定其纯度。通过混合淋巴细胞培养（MLR）检测MSCs体外对T细胞增殖的影响。建立大鼠GVHD模型（SD—Wistar），对其进行allo—BMT的同时，共移植不同数量供者源性的MSCs，观察受体大鼠的临床表现、绘制Kaplan—Meier生存曲线，并通过病理分析，综合评价MSCs，对allo-BMT后GVHD的影响。结果：在混合淋巴细胞培养体系中加入与反应淋巴细胞同源的MSCs，能够抑制T细胞的增殖，不同MSCs浓度组之问存在显著性差异（P〈0．01）。异基因骨髓移植时，供鼠MSC与T细胞比例为1：5、2：5共输注时，能推迟受鼠GVHD的发生时间，延长生存期，但并未避免GVHD的发生；当比例为1：1时，只有20％的受鼠发生了慢性GVHD反应，1—2周后逐渐缓解，并得到了长期生存，其余80％大鼠均未出现GVHD反应而长期生存。结论：大鼠MSCs不仅在体外能够抑制T细胞的增殖，体内共移植骨髓和高数量的MSCs也可以降低GVHD的发生率和严重程度，并延长受鼠的生存时间。本研究结果为临床GVHD的防治提供了新的思路。     

同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗急性肝功能衰竭

背景：对于急性肝功能衰竭的临床治疗,目前尚缺乏特效手段。骨髓间充质干细胞在特定环境下可分化为具有部分肝功能的类肝样细胞,从而参与肝功能的修复和重构,为急性肝功能衰竭的治疗提供了新的手段。 目的：评价同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性肝功能衰竭的疗效,为其临床应用提供理论依据。 方法：采用全骨髓培养法培养并纯化其骨髓间充质干细胞。30只健康SD大鼠随机均分为3组：正常对照组：不予任何处理;肝衰竭组和移植组：用腹腔注射四氯化碳石蜡油溶液的方法复制鼠急性肝功能衰竭模型后24 h分别经其尾静脉注射生理盐水和等量骨髓间充质干细胞。在移植后第1,2,3,7天抽血检测其肝功能,并取肝脏行病理学检查。 结果与结论：急性肝功能衰竭鼠经骨髓间充质干细胞移植治疗后生存率为70%,与肝衰竭组大鼠存活率20%相比差异有显著性意义(P < 0.05);肝功能指标中谷丙转氨酶和谷草转氨酶相比,移植组明显低于肝衰竭组,差异有显著性意义(P < 0.05)。肝脏组织病理学结果显示移植组肝细胞变性及坏死程度以及炎症浸润程度轻于肝衰竭组。因此,经尾静脉移植骨髓间充质干细胞能提高急性肝功能衰竭大鼠的生存率、改善肝功能及减轻肝脏坏死程度,对大鼠急性肝功能衰竭有一定的治疗作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构变化

背景：目前对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构观察的报道甚少。 目的：采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,成骨诱导并染色鉴定,利用电镜观察诱导前后细胞超微结构变化特点。 方法：全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,成骨染色鉴定向成骨方向诱导分化,扫描电镜及透射电镜观察成骨诱导前后细胞超微结构变化。 结果与结论：培养的第3代骨髓间充质干细胞纯度高、活力强,成骨诱导后的碱性磷酸酶活性染色、钙化结节染色均呈阳性。扫描电镜及透射电镜观察显示,经向成骨细胞诱导分化后,细胞形态铺展,不规则,其线粒体、粗面内质网、空泡明显增多,表明细胞功能活跃。     

骨髓间充质干细胞移植脊髓全横断模型大鼠运动和体感诱发电位的评价

背景：临床常用皮质运动诱发电位和皮质体感诱发电位来分别评价脊髓损伤后运动传导路和感觉传导路的损伤或修复情况。 目的：以脊髓诱导电位监测骨髓间充质干细胞移植后急性脊髓完全性损伤大鼠下肢神经功能的变化。 方法：选取健康Wistar大鼠50只,分成5组,即生理盐水组、骨髓间充质干细胞移植组、脑源性神经营养因子修饰组、神经营养素3+骨髓间充质干细胞移植组和假手术组。除假手术组外,其余各组均制作Allen’s脊髓完全性损伤动物模型,造模后各组均行相应治疗。治疗后4,8和12周行大鼠后肢运动功能评分,并于造模后24 h,3,7,14 d行运动和体感诱发电位检测。 结果与结论：运动诱发电位检测结果提示,各治疗组的运动功能均有不同程度的恢复,与生理盐水组间差异均有显著性意义(P < 0.05),大鼠后肢BBB评分也证实了各治疗组后肢运动功能明显优于生理盐水组(P < 0.05)。提示经脑源性神经营养因子修饰的骨髓间充质干细胞可移植到脊髓损伤处,可改善大鼠的后肢运动,神经营养素3蛋白有可能提高骨髓间充质干细胞在体内的生存率,促进受损脊髓的轴突再生。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。 目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。 方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化。 结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。     

一氧化碳中毒迟发性脑病大鼠模型复制方法

目的：复制一氧化碳（CO）中毒迟发性脑病大鼠模型。方法：50只Wistar大鼠随机分为1000 ppm组、1500 ppm组、1650 ppm组、1800 ppm组和对照组共5组，每组10只。每组中毒箱分别通入浓度为1000 ppm、1500 ppm、1650 ppm、1800 ppm的CO混合气体，对照组通入空气。连续通气12h。利用迷宫试验评估动物的智力状态。迟发性脑病大鼠诊断标准为中毒3d后、28d内出现昏迷或迷宫实验正确入臂次数少于3次者。采用TUNEL法和透射电镜等双重方法检测大脑皮质、海马区细胞凋亡情况。结果：1500 ppm组、1650 ppm组均有4只大鼠出现迟发性脑病表现，1000 ppm组和对照组大鼠未出现迟发性脑病表现，1800 ppm组通气5 h有3只大鼠死亡。两种方法检测凋亡细胞数，1000 ppm组均少于5.00%，对照组均少于1.60%，1500 ppm组均多于5%-65%，1650 ppm组均多于10%-80%。结论：建立大鼠CO中毒迟发性脑病模型以CO浓度1500-1650 ppm、吸入时间12 h比较适宜。     

不同途径移植骨髓间充质干细胞改善大鼠肝硬化

背景：骨髓间充质干细胞移植可减轻肝硬化程度,改善肝功能。 目的：观察不同途径移植骨髓间充质干细胞对四氯化碳诱导大鼠肝硬化的作用。 方法：将60只SD大鼠随机分为正常组、对照组、门静脉移植组、肝动脉移植组、尾静脉移植组,后4组采用四氯化碳联合乙醇制作肝硬化模型,对照组不进行移植,其余3组分别经门静脉、肝动脉、尾静脉移植大鼠骨髓间充质干细胞1×10⁶。 结果与结论：移植4周后,与对照组比较,移植3组大鼠肝功能均得到明显改善,血清白蛋白、胆碱酯酶显著升高(P < 0.05),转氨酶、胆红素、凝血时间、Ⅳ型胶原显著降低(P < 0.05),肝纤维化程度显著减轻(P < 0.05)。门静脉移植组及肝动脉移植组优于尾静脉移植组,前两者之间差异无显著性意义(P > 0.05)。说明经门静脉、肝动脉、尾静脉移植骨髓间充质干细胞均可减轻肝纤维化程度,改善肝功能,但肝动脉及门静脉移植途径优于外周血静脉途径。