骨形态发生蛋白7转染骨髓间充质干细胞再生骨组织

背景：骨形态发生蛋白7具有促进骨髓间充质干细胞分裂增殖的作用,在诱导新骨形成方面有重要的研究意义。 目的：观察携带人骨形态发生蛋白7慢病毒载体转染后骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白7蛋白及mRNA的表达。 方法：提取并培养大鼠骨髓间充质干细胞,通过形态学和细胞表面标记进行鉴定;构建携带人骨形态发生蛋白7的慢病毒载体,转染大鼠骨髓间充质干细胞,提取RNA后采用RT-PCR的方法检测骨形态发生蛋白7 mRNA水平相对表达量的变化,Western blotting检测骨形态发生蛋白7蛋白水平相对表达量的变化。 结果与结论：成功构建了携带骨形态发生蛋白7基因的慢病毒载体PLV-sfGFP(2A)-BMP7,重组载体质粒成功转染至大鼠骨髓间充质干细胞中,转染组的骨形态发生蛋白7 mRNA和蛋白表达高于空载体组和空白组,差异有显著性意义(P < 0.05),说明外源性骨形态发生蛋白7基因被有效整合到骨髓间充质干细胞并进行表达。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

携带肾上腺髓质素基因腺病毒体外转染骨髓间充质干细胞及其蛋白的表达

背景：肾上腺髓质素具有促进骨髓间充质干细胞增殖、生长及减少凋亡等作用。 目的：观察携带肾上腺髓质素基因的腺病毒体外转染骨髓间充质干细胞及其蛋白的表达。 方法：培养293A细胞,并扩增携带肾上腺髓质素基因的腺病毒(Ad-ADM),实验分为对照组、空载体组和Ad-ADM转染组,3组分别于细胞长满至50%~60%时加入等量的无血清L-DMEM、Ad-lacZ和Ad-ADM,噬斑法检测扩增后腺病毒的滴度;贴壁法体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞;Ad-GFP体外感染骨髓间充质干细胞后检测转染效率;RT-PCR检测Ad-ADM转染后肾上腺髓质素mRNA的表达。 结果与结论：病毒扩增后噬斑试验测定Ad-ADM的病毒滴度为1.1×10⁹ pfu/mL。Ad-ADM感染骨髓间充质干细胞后,肾上腺髓质素mRNA的表达明显增加,对照组、空载体组未见ADM mRNA表达;量化结果表明其表达量从第1天开始逐渐增加,第7天达高峰,在11 d时仍可检测其表达。提示腺病毒对骨髓间充质干细胞有较高的转染效率。感染Ad-ADM后,骨髓间充质干细胞可有效表达肾上腺髓质素。     

慢病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染大鼠骨髓内皮祖细胞

背景：基因治疗已成为疾病治疗的新趋势,为某些难治性疾病带来了曙光,合适的细胞、基因及载体的选择是治疗的关键。 目的：探讨慢病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染大鼠骨髓内皮祖细胞应用于基因治疗的有效性和可行性。 方法：从SD大鼠骨髓分离、培养、鉴定内皮祖细胞,采用构建的慢病毒载体(LV)将空载体(LV-eGFP)或骨形态发生蛋白2基因(LV-eGFP-BMP2)转染至内皮祖细胞,通过eGFP荧光检测转染效率。ELISA法检测上清液中骨形态发生蛋白2蛋白的分泌,Western blot法检测细胞骨形态发生蛋白2蛋白的表达,比较转染后细胞的迁移、增殖和抗凋亡能力。 结果与结论：慢病毒介导骨形态发生蛋白2载体的转染效率可达90%。与正常内皮祖细胞、转染空载体内皮祖细胞比较,转染骨形态发生蛋白2基因的内皮祖细胞分泌和表达骨形态发生蛋白2蛋白增加(P < 0.01),迁移和增殖能力无明显改变(P > 0.05),肿瘤坏死因子α损伤后的细胞凋亡率明显降低(P < 0.05)。结果表明慢病毒介导骨形态发生蛋白2载体可成功转染内皮祖细胞,转染后可增加内皮祖细胞分泌和表达骨形态发生蛋白2蛋白,增强对炎性损伤的抗凋亡能力,对迁移能力和增殖活性无明显影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

骨形态发生蛋白7腺病毒基因转染对骨髓基质干细胞生物学功能的影响

背景：基因转染技术正积极地应用于组织再生治疗之中,研究表明骨形态发生蛋白7具有骨诱导特性,可以有效促进成骨细胞的发育以及新骨的形成。 目的：探讨骨形态发生蛋白7腺病毒基因转染对骨髓基质干细胞生物学功能的影响。 方法：分离、培养羊骨髓基质干细胞,利用重组骨形态发生蛋白7腺病毒(adenovirus bone morphogenetic protein 7,Adeno-BMP7)对第2代骨髓基质干细胞进行基因转染,透射电镜观察转染后细胞超微结构。流式细胞仪检测转染后的细胞周期,Western blot检测骨形态发生蛋白7的表达,Von Kossa染色观察钙结节形态情况。取转染后第3天及相应未转染的骨髓基质干细胞制备珊瑚-细胞复合物,于裸鼠脊柱两侧背部皮下注射4周和8周后进行大体观察和组织学检测。 结果与结论：体外细胞超微结构观察可见Adeno-BMP7基因转染骨髓基质干细胞存在活跃的物质合成代谢;流式细胞仪检测发现转染不会对骨髓基质干细胞的细胞周期产生明显影响;Western blot检测转染后的骨髓基质干细胞存在骨形态发生蛋白7蛋白的表达;Von Kossa染色可见转染Adeno-BMP7后的骨髓基质干细胞形成较大的钙结节。经裸鼠皮下回植实验发现,Adeno-BMP7转染后骨髓基质干细胞的成骨能力和成骨质量明显提高。以上结果表明经Adeno-BMP7转染可以有效促进骨髓基质干细胞成骨分化。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

尾悬吊大鼠骨髓基质干细胞体外分化能力及相关因子的表达

背景：尾悬吊模拟失重可造成骨丢失,骨髓基质干细胞增殖能力与分化方向也直接影响着骨髓腔内细胞水平骨代谢的平衡并最终改变骨的质量。 目的：观察尾悬吊大鼠骨髓基质干细胞体外向成骨细胞和脂肪细胞分化的能力及相关因子的表达。 方法：SD大鼠随机分为正常对照组、尾悬吊组。取大鼠骨髓细胞体外培养,传1代后分别向成骨细胞和脂肪细胞两个方向诱导分化,成骨组第16天行碱性磷酸酶染色,第28天检测细胞外基质矿化能力,real-time PCR法检测第28天骨形态发生蛋白2 mRNA的表达,成脂组第21天检测脂蛋白酯酶的比活性及mRNA的表达,第30天油红O法检测脂滴形成能力。 结果及结论：尾悬吊组大鼠骨髓基质干细胞成骨分化早期碱性磷酸酶阳性细胞表达率显著高于对照组,但分化晚期骨形态发生蛋白2 mRNA的表达水平及细胞外基质矿化能力较对照组显著降低;尾悬吊大鼠骨髓基质干细胞成脂分化过程中脂蛋白酯酶的表达、比活性及脂滴形成能力均显著高于对照组。说明尾悬吊可潜在刺激骨髓基质干细胞早期成骨分化能力,但显著抑制其矿化能力,从而抑制成骨,其机制可能与抑制骨形态发生蛋白2的表达有关;可显著促进骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化。尾悬吊造成大鼠骨量的丢失可能与其对骨髓基质干细胞分化方向的影响有关。     

腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞

背景：骨髓间充质干细胞作为骨、软骨创伤缺损及退变修复的种子细胞越来越受到关注。 目的：分析人骨形态发生蛋白2基因转染对白色封闭群大鼠(SD大鼠)骨髓间充质干细胞的影响。 方法：分离纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞并体外扩增,通过腺病毒载体介导人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞,分别通过荧光显微镜观察荧光表达情况及蛋白质水平来测定转染后人骨形态发生蛋白2的表达,碱性磷酸酶定量测定鉴定成骨活性及MTT法评估人骨形态发生蛋白2转染对骨髓间充质干细胞的影响。 结果与结论：从SD大鼠骨髓提取物中分离培养的细胞形态为梭形,呈铺路石状、漩涡状生长,经流式细胞仪检测及多项分化能力鉴定符合骨髓间充质干细胞的特征;经转染人骨形态发生蛋白2基因后,骨髓间充质干细胞表达人骨形态发生蛋白2、碱性磷酸酶;MTT法检测转染人骨形态发生蛋白2基因后,骨髓间充质干细胞增殖能力明显增强(P < 0.05)。说明人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞后可以持续、高效表达人骨形态发生蛋白2和碱性磷酸酶,在体外明显促进骨髓间充质干细胞的增殖。     

人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体转染人骨髓基质干细胞后的细胞增殖

背景：利用重组腺病毒载体转染外源性基因到组织工程骨的种子细胞是骨缺损基因治疗研究的热点。 目的：用人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体转染人骨髓基质干细胞,以探讨基因转染对人骨髓基质干细胞增殖的影响。 方法：将Ad-hBMP2-IRES-hFGF2转染至人骨髓基质干细胞中,荧光显微镜观察转染效果,RT-PCR方法观察人骨形态发生蛋白2 cNDA和人成纤维细胞生长因子2 cNDA在人骨髓基质干细胞中的转录情况,Wester blot 方法检测人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2蛋白表达情况,锥虫蓝测定细胞活力,流式细胞仪分析其对细胞增殖的影响。 结果与结论：转染后人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达,细胞活力无明显变化,流式细胞仪分析细胞周期中增殖细胞比例明显增加。说明该双基因可高效转染人骨髓基质干细胞,且促进细胞增殖。     

真核表达载体pcDNA3.1(+)-vIL-10的构建及其在SD大鼠骨髓基质干细胞的表达

目的构建携带免疫调节因子vIL-10c DNA的真核表达载体,转染至SD大鼠骨髓基质干细胞,观察免疫调节因子vIL-10在骨髓基质干细胞的表达。方法PCR扩增原核载体PET-28α/vIL-10,获得目的基因vIL-10,目的基因在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体Pc DNA3.1(+),转染大鼠骨髓基质干细胞。用G418筛选得到vIL-10高表达的细胞,对照组为pcDNA3.1(+)直接转染的骨髓基质干细胞。结果经PCR、酶切、测序鉴定显示按设计构建的载体pc DNA3.1(+)-vIL-10,已成功转染骨髓基质干细胞。RT-PCR检测到510bp目的片段vIL-10在骨髓基质干细胞表达,SDS-PAGE电泳表明在骨髓基质干细胞有vIL-10蛋白的表达。结论vIL-10 mRNA和蛋白在骨髓基质干细胞中表达。     

转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因共转染骨髓干细胞

背景：骨形态发生蛋白2及转化生长因子β是骨再生中重要的因子,提高其表达可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。 目的：构建携带转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的慢病毒载体,观察其在骨髓间充质干细胞中的表达情况。 方法：应用重组慢病毒技术构建同时携带转化生长因子β3、骨形态发生蛋白2和绿色荧光蛋白基因的重组慢病毒表达载体,并用其转染体外培养的第3代兔骨髓间充质干细胞,以转染携带转化生长因子β3或骨形态发生蛋白2单一基因的慢病毒或单独慢病毒的骨髓间充质干细胞作为对照。转染后1周分别提取各组细胞的总RNA和蛋白进行检测。 结果与结论：荧光显微镜下见转染转化生长因子β3和(或)骨形态发生蛋白2基因3 d的骨髓间充质干细胞发绿色荧光,转染效率达90%以上。RT-PCR和Western blot结果显示,转染转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2 mRNA和蛋白的表达均高于单一基因转染组及空白对照组。可见应用慢病毒可成功将转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因转染至骨髓间充质干细胞并实现其高效表达,且两种基因具有协同促表达作用。     

pcDNA3.1-成骨生长肽真核表达载体在骨髓基质干细胞中的表达

背景：成骨生长肽具有明显的促进成骨细胞增殖、分化、成熟的作用。 目的：观察成骨生长肽基因转染兔骨髓基质干细胞后的表达及表达产物对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响。 方法：构建重组真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,并在脂质体介导下,将其导入兔骨髓基质干细胞。通过G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR方法检测成骨生长肽基因在骨髓基质干细胞内的表达,并观察转染pcDNA3.1-成骨生长肽后骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的情况。 结果与结论：实验成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,转染pcDNA3.1-成骨生长肽的骨髓基质干细胞可见成骨生长肽mRNA的表达,同时羟脯氨酸的分泌水平增加,碱性磷酸酶活性增高。证实经pcDNA3.1-成骨生长肽转染的兔骨髓基质干细胞不仅可以表达成骨生长肽,而且具有向成骨细胞分化的特性。     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景：骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。 目的：观察hVEGF165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。 方法：体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1∶3比例的混合液转染,并分为3组：转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。 结果与结论：转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义(P < 0.05),但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义(P > 0.05),转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义(P< 0.05),hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

RNA干涉抑制破骨细胞分化因子表达对骨髓基质细胞成骨成脂分化的影响

背景：RNA干涉是目前分子生物学研究领域重要的基因下调技术,护骨素/κB受体活化因子/破骨细胞分化因子偶联系统是目前骨改建平衡研究中的热点。 目的：应用RNA干涉特异性抑制大鼠骨髓基质细胞内破骨细胞分化因子基因的表达,研究破骨细胞分化因子表达下调后对骨髓基质细胞成骨成脂分化的影响。 方法：获取骨髓基质细胞,转染前24 h按5×105/孔接种于6 孔培养板中,分为实验组、阴性对照组和空白对照组,前2组细胞分别转染针对破骨细胞分化因子的siRNA或阴性对照siRNA。观察骨髓基质细胞增殖活性、碱性磷酸酶活性及Real-Time PCR检测成骨成脂基因mRNA的表达。 结果与结论：实验组碱性磷酸酶活性降低,RunX-2,骨形态发生蛋白2,4表达降低,而PPAR-γ和C/EBP-α的表达升高(P < 0.05)。提示,通过RNA干涉使骨髓基质细胞的破骨细胞分化因子表达下调对骨髓基质细胞成骨分化有抑制作用,而对成脂分化有促进作用。     

慢病毒介导的CCN1基因对大鼠骨髓间充质干细胞

 目的：探讨外源性CCN1对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）生长和迁移的作用。方法：构建带有绿色荧光蛋白的大鼠CCN1慢病毒载体（Lenti-GFP-CCN1）并感染大鼠BMSCs,筛选最适感染复数（MOI）;实验分为空白组、感染Lenti-GFP组和感染Lenti-GFP-CCN1组,倒置荧光显微镜下观察BMSCs感染后荧光表达情况;MTT法检测细胞存活率,划痕愈合实验检测细胞迁移作用。结果：与空白组和阴性对照组相比,Lenti-GFP-CCN1感染大鼠BMSCs后,细胞的存活率未见明显差异;感染组细胞划痕愈合实验的愈合宽度/原宽度值与空白组及阴性对照组相比差异显著（P<0.05）。结论：外源性CCN1对正常大鼠BMSCs存活率无影响,可促进BMSCs迁移。     

过表达Shootin1的骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤

BACKGROUND:Genetic modification by Shootin1 aims to effectively improve neural differentiation of bone marrow mesechymal stem cells (BMSCs) in the injured spinal cord, thereby promoting functional recovery from spinal cord injury after cell transplantation. OBJECTIVE:To explore the nerve regeneration ability of transplanted BMSCs overexpressing Shootin1 in rats with spinal cord injury. METHODS:BMSCs were transfected using adenovirus-Shootin1 for 48 hours. Then, immunofluorescence staining was used to detect Nestin and NeuN expression levels in the transfected cells under in vitro neuronal induction and differentiation. Animal models of spinal cord injury were made in rats using modified Allen’s method. Thirty minutes later, Shootin1-transfected BMSCs and non-transfected BMSCs were respectively injected into the subarachnoid space of the rats in the transfection and non-transfection groups, respectively. Rats in the model group were given no treatment. Five weeks after modeling, spinal cord samples were taken from each rat to make frozen sections for detection of nerve related markers RESULTS AND CONCLUSION:After 48-hour adenoviral transfection, Shootin1 expression was successfully detected in BMSCs. After 7-day in vitro induction, the cell morphology in the three groups varied, and there was no significant difference in the expression of Nestin and NeuN between the transfection and non-transfection groups. Basso, Beattie and Bresnahan scores were higher in the two cell transplantation groups than the model group. Increased expression levels of Nestin, NeuN, GFAP, MAP-2, ChAT and SYN were observed in both two cell transplantation groups, indicating a strengthened ability of nerve regeneration. Our experimental findings further confirm that BMSCs transplantation for spinal cord injury has achieved good outcomes, and Shootin1 protein plays a certain role in nerve regeneration and functional recovery after spinal cord injury. However, Shootin1 overexpression shows no obvious additional effects in combination with BMSCs transplantation, and further studies on the optimization of BMSCs transplantation for spinal cord injury are necessary.     

骨髓间充质干细胞中突变型人低氧诱导因子1α真核表达载体的表达

背景：转基因小鼠体内实验证实,重组的低氧诱导因子1α可以促进皮肤形态功能正常的血管新生。 目的：构建能够在常氧条件下同时表达突变型低氧诱导因子1α目的蛋白和绿色荧光蛋白报告分子的新型腺病毒真核表达载体,并转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,检测该基因在细胞中的表达情况。 方法：利用Lipofectamine 2000介导将构建成功的重组腺病毒真核表达载体pAd-HIF1αmu- IRES-hrGFP-1转染HEK293A细胞,包装病毒,以最佳感染指数=50将重组腺病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞,并设3个对照组,即阳性对照组：转染Ad-CMV-HIF1α-IRES-hrGFP-1;阴性对照组：转染Ad-CMV-IRES-hrGFP-1组;空白组：未转染病毒。 结果与结论：①腺病毒载体成功转染HEK293A细胞,包装成功,细胞内有大量绿色荧光表达。②转染突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体的细胞在常氧条件下蛋白表达量明显高于转其他3组,3个对照组间差异无显著性意义(P > 0.05)。提示突变型腺病毒真核表达载体Ad-HIF1α-IRES-hrGFP-1在HEK293A内成功包装;突变后低氧诱导因子1α基因能够在常氧条件下大量且高效表达。     

Expression of SP7/osterix and alkaline phosphatase in bone marrow mesenchymal stem cells with Cbfal/RUNX2 gene silencing regulated by the water extracts from Bushen huoxue decoction北大核心

BACKGROUND: Bushen Huoxue Decoction (BSHXD) can promote osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in vitro. Exploring the molecular mechanisms involved is of clinical benefits. OBJECTIVE: To discuss the changes in the expression of SP7/Osterix and alkaline phosphatase (ALP) in BMSCs with Cbfal/RUNX2 gene silencing regulated by the water extracts from BSHXD. METHODS: BMSCs were isolated and cultured by the bone marrow adherent method, and BMSCs at passage 3 were used in the assay. BMSCs were transfected with nothing (blank control group), Cbfal/RUNX2 gene silencing lentivirus (silencing group), and negative viral vector (negative control group), respectively. Then, the cells were cultured in 100 mg/L BSHXD water extract, and 3 days later, the protein and mRNA expression of RUNX2 and Osterix was detected by western blot and qPCR, respectively. Activity of ALP in the BMSCs was also detected in each group. RESULTS AND CONCLUSION: The transfection efficiency of Cbfal/RUNX2 gene silencing lentivirus was about 90%. The protein and mRNA expressions of RUNX2 and Osterix were significantly decreased in the BMSCs transfected with Cbfal/RUNX2 gene silencing lentivirus as compared with the other two groups, and so was the ALP activity (P < 0.01). After treated with the water extracts from BSHXD, the expression of RUNX2 and Osterix as well as the ALP activity in the BMSCs transfected with Cbfal/RUNX2 gene silencing lentivirus increased significantly (P < 0.01). To conclude, the water extract from the BXHXD can up-regulate the expression of RUNX2 and Osterix and the activity of ALP, thus promoting BMSCs osteogenic differentiation. © 2018, Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research. All rights reserved.     

同种异体和异种来源骨髓间充质干细胞诱导成软骨修复喉软骨缺损

BACKGROUND: Because chondrocytes have no regeneration ability, to select suitable seed cells is the primary problem to repair cartilage defects. OBJECTIVE: To investigate the effect of allogeneic versus heterologous bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in repairing laryngeal cartilage defects after chondrogenic induction. METHODS: BMSCs from human and rabbits were isolated and cultured. Passage 3 cells were cultured in chondrogenic induction medium containing transforming transforming growth factor beta 1 and bone morphogenetic protein, and then were dropped onto a poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) scaffold. Thirty New Zealand rabbits were randomly assigned into three groups: blank control group, human BMSCs group, rabbit BMSCs group. Animal models of laryngeal cartilage defects were made in the three groups. After modeling, saline-soaked PLGA scaffold, PLAG scaffold with human BMSCs or with rabbit BMSCs were implanted respectively into the rabbits in the normal blank, human BMSCs and rabbit BMSCs groups. The expression of type II collagen in the larynx and its surrounding tissues was detected by immunohistochemistry at 4 and 8 weeks postoperatively. RESULTS AND CONCLUSION: The animals in each group breathed normally with no presence of wheezing, and their eating and activity were good. Moreover, there was no purulency or infection in the three groups. At 4 and 8 weeks after operation, the positive rates of type II collagen in the two BMSCs groups were significantly higher than that in the blank control group (P < 0.05). There was no significant difference between two BMSCs groups (P > 0.05). These results show that both allogeneic and heterologous BMSCs have good therapeutic effects on the repair of laryngeal cartilage defects in rabbits.      

体外培养猪骨髓间充质干细胞hHCN2基因的转染及表达

背景：通过超极化活化的阳离子电流调制心脏自律性成为该领域研究的焦点。 目的：将起搏基因质粒CMV-hHCN2-3xha-IRES-EGFP转染到猪骨髓间充质干细胞,检测其在骨髓间充质干细胞中核酸和蛋白水平是否表达。 方法：采用单纯直接贴壁法或密度梯度离心结合直接贴壁法分离、纯化、增殖获得骨髓间充质干细胞,脂质体2000转染质粒CMV-hHCN2-3xha-IRES-EGFP至骨髓间充质干细胞。 结果与结论：单纯直接贴壁法收集到的细胞增殖速度慢,而密度梯度离心结合直接贴壁法细胞增殖速度较快,原代细胞培养第3代后转染48 h荧光显微镜下可见骨髓间充质干细胞发出荧光,对照组无荧光。细胞转染率达15%-20%。RT-PCR检测及Western blot 印迹检测证明了hHCN2基因在骨髓间充质干细胞有表达。密度梯度离心结合直接贴壁法较单纯直接贴壁法培养骨髓间充质干细胞的培养效率更高。转染目的基因hHCN2的骨髓间充质干细胞蛋白有表达。     

过表达胶质细胞神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤

文题释义： 胶质细胞源性神经营养因子：作为轴突再生的一种重要神经营养因子,可诱导间充质干细胞向神经样细胞分化并对中枢神经系统退行性疾病、脊髓损伤后神经功能恢复起到重要作用。 突触素：作为突触的特异性蛋白是突触形成过程中最重要的标志物,主要位于神经元胞体及轴突,可调节神经元轴突延伸,参与突触囊泡的介导转运、神经递质释放,对促进脊髓损伤后神经功能恢复起到重要作用。 背景：胶质细胞神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF)在诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)体外定向分化及促进脊髓损伤大鼠神经功能恢复过程中起到重要作用。 目的：观察过表达GDNF基因的BMSCs分化情况及其促进脊髓损伤大鼠神经功能恢复的潜在分子机制。 方法：①以重组目的基因腺病毒转染BMSCs并分为Ad-GDNF-GFP转染组、Ad-GFP转染组、未转染组,免疫荧光鉴定各组细胞神经元特异性烯醇化酶及微管相关蛋白2的表达,Western blot检测各组细胞GDNF、Wnt3a、Wnt7a蛋白表达。②以改良Allen法制备大鼠脊髓损伤模型,将造模成功的45只SD大鼠随机分为3组,分别以过表达GDNF基因BMSCs(GDNF-BMSCs)、BMSCs、PBS移植至脊髓损伤局部。移植后4周采用BBB评分法评估大鼠运动功能恢复情况,苏木精-伊红染色观察脊髓形态变化,免疫组化检测损伤局部神经元特异性烯醇化酶、突触素Ⅰ及胶质纤维酸性蛋白表达,Western blot检测损伤局部Bcl-2、肿瘤坏死因子α蛋白表达。 结果与结论：①Ad-GDNF-GFP转染组BMSCs可向神经元样细胞形态转变并表达神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2;Wnt3a、Wnt7a蛋白表达量显著高于Ad-GFP转染组、未转染组;②移植后4周,GDNF-BMSCs移植组大鼠BBB评分明显提高、脊髓空洞面积显著缩小。GDNF-BMSCs移植组脊髓损伤局部胶质纤维酸性蛋白、肿瘤坏死因子α表达量显著低于BMSCs移植组及PBS移植组,而神经元特异性烯醇化酶、突触素Ⅰ及Bcl-2表达量显著高于BMSCs移植组、PBS移植组;③结果表明,Wnt信号通路参与过表达GDNF基因 BMSCs向成熟神经元分化过程,移植后通过降低脊髓损伤局部炎症反应、减少细胞凋亡及胶质瘢痕形成、促进轴突再生,提高BMSCs移植治疗脊髓损伤的疗效。 ORCID: 0000-0001-6467-730X(黄成) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

骨形态发生蛋白4和骨形态发生蛋白4/7基因转染对骨髓基质干细胞成骨活性差异的比较

背景：有文献报道骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)异源二聚体比同源二聚体的活性高,目前国内外尚无BMP-4/7异源二聚体与BMP-4同源二聚体间诱导成骨活性比较的报道。 目的：观察不同基因BMP-4、BMP-4/7对骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨活性的差异,探讨融合基因BMP-4/7的生物学活性。 方法：经脂质体转染分离培养的兔BMSCs,G418筛选出稳定表达株,利用RT-PCR法证明目的基因在BMSCs中的表达情况;以BMP-4和BMP4/7融合基因修饰的AAV载体,转染兔BMSCs,MTT法检测不同基因转染细胞的增殖能力;以BMP-4单基因和BMP-4/7融合基因修饰的AAV载体转染兔BMSCs 7 d后,测定两组细胞内碱性磷酸酶及骨钙素水平,观察成骨活性的变化。 结果与结论：实验成功构建高滴度的分别携带BMP-4单基因、BMP-4/7融合基因的重组腺相关病毒载体AAV-BMP-4、AAV-BMP-4/7;RT-PCR结果证明目的基因能够在BMSCs中得到稳定表达。AAV-BMP-4及AAV-BMP-4/7载体转染效率分别为68.20%、72.18%;转染BMSCs后,细胞增殖能力均明显提高,BMP-4/7融合基因的细胞增殖能力活性高于BMP-4单基因。以BMP-4和BMP-4/7融合基因修饰的AAV转染细胞7 d后,细胞内碱性磷酸酶活性明显上调,骨钙素水平升高,成骨活性均增强;两种基因比较,BMP-4/7融合基因成骨活性强于BMP-4单基因(P < 0.01)。提示BMP-4、BMP-4/7修饰的AAV载体转染效率高,对BMSCs均有成骨活性,其中BMP-4/7融合基因成骨活性强于BMP-4单基因。