Taq-Man实时荧光定量PCR同时检测O1和O139群霍乱弧菌

目的针对霍乱弧菌血清群各自编码O抗原的特异性基因建立能够快速、准确地同时检测O1和O139群霍乱弧菌的荧光PCR检测方法,并克服常用PCR检测方法中经常出现的假阳性现象。方法分别以rfbM和wbfR基因作为O1和O139群霍乱弧菌的模板设计引物和探针,通过优化反应条件建立了能够同时检测O1群和O139群霍乱弧菌的二联实时荧光定量PCR方法(FQ-PCR)。对该方法的特异性、灵敏度进行评估,并对10份模拟食品样品和133份临床样品进行了检测。结果特异性试验表明,该方法能选择性检测O1和O139群霍乱弧菌,能有效地避免O141群霍乱弧菌和拟态弧菌的假阳性,特异性为100%;灵敏度试验表明,O1群霍乱弧菌和O139群霍乱弧菌检出限分别为92cfu/ml和116cfu/ml;另外,试验建立的检测方法对模拟样品和临床样品检测结果与国标法的检测结果完全一致,符合率为100%。结论该实时荧光PCR检测方法能够同时检测O1和O139群霍乱弧菌,而且特异性好、灵敏度高,能有效克服假阳性,适用于基层疾病控制、口岸检疫单位日常疫情监测和临床诊断。     

实时聚合酶链反应检测O1群和O139群霍乱弧菌方法的建立及应用

目的建立检测O1群和O139群霍乱弧菌的实时荧光聚合酶链反应（RT—PCR）方法并进行水体标本的检测评价。方法根据O1群和O139群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb序列设计引物，利用SYBRGreen染料，建立同时检测霍乱弧菌O1群和O139群的RT—PCR方法，对所建立的方法分别进行实验室内的灵敏度、特异性及重复性评价。采集河口水标本增菌后进行RT—PCR检测，与分离培养方法比较评价实际应用价值。结果建立了检测O1群和O139群霍乱弧菌的双重RT—PCR方法，根据扩增产物的溶解温度能有效区分O1群和O139群霍乱弧菌两种目标片段的扩增；对其他10种弧菌染色体DNA没有扩增；RT—PCR检测524份河口水体标本的增菌液，与常规分离方法相比显示了明显的灵敏性，并且所有常规分离方法阳性标本其荧光PCR检测亦为阳性。结论以O1群和O139群rfb基因为目标检测片段建立的霍乱弧菌RT—PCR方法可用于环境水体样本中霍乱弧菌常规分离前的快速筛查。     

脉冲场凝胶电泳分型方法追溯霍乱传染源

目的　了解四川省 2 0 0 4年霍乱疫情分离菌株与常规监测的外环境和水产品中霍乱弧菌分离株之间的遗传相关性 ,追溯传染源 ,为预测疫情和制定防治措施提供依据。方法　O139群霍乱弧菌编码脂多糖 (LPS)特异性基因引物聚合酶链反应 (PCR)复核菌株 ,霍乱毒素 (CT)基因引物PCR检测霍乱毒力基因 ,脉冲场凝胶电泳 (PFGE)进行菌株的分子分型。结果　 2 5株受试菌株LPS基因 2对引物PCR结果均为阳性。所有 6株河水中分离的菌株均为CT基因阴性 ,其余均具有CT基因。 2 4株菌PFGE可分为 13个型。结论　LPS基因PCR检测结果从分子水平证实受试菌株均为O139群霍乱弧菌。河水中分离的 6株菌是非产毒株 ,其余菌株均具有致病性。环境水分离的O139群非产毒株之间以及产毒株与非产毒株之间遗传相关性较远。产毒株之间具有较高的同源性。四川省从甲鱼分离的O139群霍乱弧菌与同期流行的O139群霍乱弧菌分型的带型一致 ,在国内首次以分子流行病学分析提示甲鱼可能是四川省近年霍乱疫情主要传染来源之一。     

多重PCR检测霍乱弧菌的毒素相关基因

目的 探索建立一种快速、敏感地检测霍乱弧菌O1群、O139群、非O1／非O139群的毒素相关基因的方法。方法 针对霍乱弧菌霍乱肠毒素A亚单位基因(ctxA)、小带联结毒素基因(zot)、辅助霍乱肠毒素基因(oce)、霍乱弧菌毒素共调菌毛A基因(tcpA)、毒素表达调控蛋白基因(toxR)分别设计引物，建立多基因PCR方法；通过一次扩增反应之产物经琼脂糖凝胶电泳，可检测出菌株的毒素相关基因的携带情况。结果 阳性对照菌株：MO45(霍乱弧菌O139群)检出5种毒素相关基因，结果符合设计要求；其他不同来源的霍乱弧菌(O1群、O139群、非O1／非O139群)检出1—5种不等的毒素相关基因；根据毒素相关基因携带情况，可将菌株分为5个基因型，并可区分为产毒株和非产毒株；多重PCR敏感度可达10^2cfu／ml。结论 该方法快速、特异、敏感，具有较大的应用价值。     

霍乱弧菌多重PCR检测方法的建立及优化

[目的]建立一种快速检测样品中霍乱弧菌的多重PCR方法,优化霍乱弧菌多重PCR的反应体系和循环参数.[方法]根据霍乱毒素ctxA、toxR、O139群特异性基因、O1群特异性基因序列,设计特异性引物,对引物浓度、PCR缓冲液的浓度、Mg2+浓度、退火温度及其延伸时闻等条件进行优化.[结果]4对引物在不同血清型霍乱弧菌DNA模板中能特异扩增出不同的条带.在同一反应体系中,较低的延伸温度可以提高霍乱弧菌多重PCR检测的灵敏度.[结论]通过对霍乱毒素多重PCR反应体系不同因素的优化,建立了稳定可靠的霍乱弧菌多重PCR检测平台.     

多重荧光定量PCR甄别霍乱弧菌方法的建立

目的 利用多重荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异甄别霍乱弧菌的定量方法.方法 分别根据霍乱弧菌霍乱毒素A亚单位基因(ctxA)和糖基转移酶基因(LPSgt)作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan-MGB探针,探针的5'端分别用FAM和VIC进行荧光标记,3'端标记MGB.优化PCR扩增体系,对多重实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性评价,同时进行一定数量临床样本考核鉴定,与常规方法进行比较.结果 该方法可准确、特异地鉴定霍乱弧菌,同时能够甄别O139群霍乱弧菌.全部的霍乱弧菌用ctxA基因对应引物和探针检测均为阳性,其中只有O139群霍乱弧菌出现LPSgt基因阳性,其他菌株均无阳性结果.检测的灵敏度为2×102 cfu/ml.同时对收集的45例临床样本进行鉴定,结果显示10例为霍乱弧菌,其中O139群有4例,其余均为阴性结果,与常规鉴定方法一致.结论 研究建立的多重荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速,可有效鉴定产毒霍乱弧菌及甄别O139群霍乱弧菌,可用于霍乱监测和防制工作中的实验室诊断.     

实时荧光定量PCR检测O139群霍乱弧菌研究

目的：利用荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异检测O139群霍乱弧菌的定量方法。方法：选取O139群霍乱弧菌糖基转移酶基因（LPSgt）作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan探针,探针的两端均进行荧光标记。对PCR扩增体系进行优化,进一步评价实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性后,对收集的临床样本进行鉴定。结果：本文所建立的实时荧光定量PCR方法可准确、特异的检测和鉴定O139群霍乱弧菌,其他菌株均无阳性结果产生;该方法的灵敏度可达到10 cfu/ml;定量检测的批间和批内的变异系数均小于5%;对85例临床样本进行评价,结果获得9例O139群霍乱弧菌阳性,与常规培养法结果完全一致。结论：本文建立的检测O139群霍乱弧菌实时荧光定量PCR方法快速、准确,结果可靠,实用性强,可对结果进行定量分析,为O139群霍乱弧菌的实验室诊断和现场流行病学调查提供了较好的分析手段。     

霍乱弧菌多重PCR检测方法的建立和运用

[目的]建立一种快速检测霍乱弧菌O1群、O139群、非O1非O139群及是否产毒株的方法。[方法]以霍乱弧菌的外膜蛋白基因（ompW）、编码O1群O抗原基因（O1rfb）和编码O139群O抗原基因（O139 rfb）、霍乱肠毒素A亚单位基因（ctxA）为目的基因,建立一种多重PCR方法对霍乱弧菌进行检测和分型。[结果]根据相关基因携带情况分为6种型别,并分产毒株和非产毒株。以该法对140株霍乱弧菌分型结果与血清学诊断结果相一致,而其它弧菌和肠杆菌等均未检出相关基因。[结论]该方法快速、特异,可应用于霍乱弧菌的检测和分型。     

霍乱毒素基因(ctx)和耐热直接溶血素基因(tdh)双重TaqMan实时PCR检测方法的建立

[目的]建立霍乱毒素和耐热直接溶血素基因双重TaqMan实时-PCR实验室检测方法。[方法]根据霍乱毒素基因(Cholera toxin gene,ctx)和耐热直接溶血素基因(thermostable direct hemolysin,tdh)的保守序列设计引物和TaqMan探针,建立检测霍乱毒素和耐热直接溶血素两种毒力基因的双重TaqMan实时PCR方法。对所建立的霍乱毒素基因和耐热直接溶血素基因双重TaqMan实时PCR检测方法进行灵敏度和特异度评价。[结果]建立了霍乱毒素基因和耐热直接溶血素基因双重TaqMan实时PCR的实验室检测方法。优化的tdh和ct双重TaqMan实时PCR反应体系中,ct引物和探针的浓度分别为200nmol/L和100nmol/L;tdh引物和探针的浓度分别为200nmol/L和100nmol/L。反应体系的灵敏度和特异度均为100%。优化的反应体系对两种质粒模板的检测下限均为1.0×102拷贝/μl,扩增效率分别为94%和97.7%。[结论]本研究建立了基于TaqMan探针的tdh和ct双重实时PCR检测方法,具有令人满意的灵敏度和特异度。检测下限能达到1.0×102拷贝/μl,高于普通PCR100倍。并且双重实时PCR能够在一个反应体系中同时检测两种毒力基因,这为费时又繁琐的传统检测方法提供了一种可靠又快速的替代选择。     

四川省2005年霍乱分子流行病学特征

目的：分析四川省2005年霍乱弧菌分子特征,以及霍乱暴发疫情分离的菌株与菌株之间,疫情分离的菌株与海、水产品监测分离的霍乱弧菌之间的遗传相关性,查找霍乱传染来源,为预测疫情和制定防治措施提供依据.方法：利用聚合酶链反应（PCR）检测O139群霍乱弧菌特异性编码脂多糖基因（LPS）和霍乱毒力基因（ctxAB）;脉冲场凝胶电泳对菌株进行分子分型,所得结果以BioNumerics V4.0软件UPGMA方法进行聚类分析.结果：所试16株霍乱弧菌14株LPS阳性,为O139群霍乱弧菌;另2株为O1群稻叶型霍乱弧菌.2株稻叶型霍乱弧菌和1株O139群霍乱弧菌ctxAB阴性,其余13株菌均具有ctxAB,为产毒株.对16株菌以NotⅠ酶切后PFGE可分为5个型别.O139群霍乱弧菌优势流行株与从甲鱼分离的O139群霍乱弧菌PFGE型别一致,且同为产毒株.结论：甲鱼等海、水产品被O139群霍乱弧菌污染情况严重,甲鱼中分离的O139群霍乱弧菌与霍乱疫情分离菌株之间高度同源,被污染的甲鱼可能是本年度食源性霍乱暴发的主要传染来源之一,海、水产品的监测是近期霍乱防控的重点.     

非O1/非O139群霍乱弧菌感染病例分离株分子流行病学分析

目的 分析安徽省马鞍山市连续2个月内监测到的6例具有霍乱疑似症状、感染非O1/非O139群霍乱弧菌的病例,判断疫情的聚集性.方法 对病例分离株进行生化和血清型别鉴定以及溶血试验,药敏试验检测抗生素耐药谱,应用荧光PCR和常规PCR进行霍乱弧菌特异基因、毒力及其相关基因的检测,包括ompW、ctx 、tcpA、toxR、hlyA 、zot、ace、rstR和gⅢCTX,应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析其分子型别.结果 生化鉴定和血清学试验鉴别腹泻病例6株菌株为非O1/非O139霍乱弧菌,均产生β溶血;14种药物中有12种属于全部敏感;荧光PCR检测霍乱弧菌特异性基因ompW均为阳性,ctx、tcpA 、zot、ace、rstR和gⅢCTX基因均为阴性,toxR 、hlyA基因有5株菌扩增阳性,1株菌(1001434446)为阴性;PFGE显示6株菌带型均不相同,但有2株非常相似,分离株与霍乱弧菌产毒株相似性很低.结论 6例感染非产毒的非O1/非O139群霍乱弧菌病例发病虽相对集中,但属于散发病例,在局部地区频繁出现,提示其公共卫生意义不可忽视.     

广东省O1/O139群霍乱弧菌耐药监测分析

目的分析广东省霍乱病例及环境来源O1/O139群霍乱弧菌对抗生素的敏感性,为霍乱防控提供依据。方法选取2006-2008年广东省O1/O139群霍乱病例分离株38株,环境株145株,以毒素基因ctxAB的PCR检测区分产毒株与非产毒株;采用WHO推荐的改良Kirby-Bauer纸片法,分析霍乱弧菌对11种抗生素在体外的药物敏感性。结果183株O1/O139群霍乱弧菌中,ctxAB阳性44株,ctxAB阴性139株。分离自病例的菌株和ctxAB阳性菌株中,小川型菌株只对四环素、萘啶酸和复方新诺明有一定耐药;稻叶型菌株对萘啶酸和复方新诺明100%耐药,而O139群菌株对四环素、萘啶酸和复方新诺明等多种抗生素有一定耐药;分离自环境的菌株和ctxAB阴性菌株中,小川型和稻叶型菌株对四环素、萘啶酸和复方新诺明等多种抗生素有一定耐药,而O139群则仅对萘啶酸、复方新诺明和氨苄西林有一定耐药;分离自病例的菌株和ctxAB阳性菌株以耐多药为主,耐多药率分别为78.9%和75.0%,高于分离自环境的菌株和ctxAB阴性菌株的31.7%和30.9%(P0.01)。结论广东省O1/O139群霍乱弧菌中分离自病例的菌株和ctxAB阳性菌株耐多药率较高,应予以密切关注。     

2009-2012年江西省外环境霍乱弧菌致病力及药敏检测

目的掌握江西省外环境中霍乱弧菌菌型分布、毒力基因、耐药现状,为霍乱防治提供科学依据。方法采用血清学分型法对外环境中分离的霍乱弧菌进行分型,同时以主要毒力基因ctx为引物对检索的霍乱弧菌进行PCR扩增,并应用K-B纸片法对部分菌株进行10种抗生素的药物敏感试验。结果 2009-2012年期间,共从外环境中分离到霍乱菌株156株。毒力实验结果显示37株O139群中15株扩增出与阳性对照一致的毒力基因(ctx)条带,而119株O1群除2株小川型外,其余均未扩增出毒力基因(ctx)条带,与阴性对照一致。药敏结果显示:O139群和O1群对丁胺卡那霉素、诺氟沙星、环丙沙星、头孢噻肟90%以上敏感。结论江西省2009-2012年间外环境中分离到的霍乱弧菌中,O139群与O1群并存,O1群为优势菌;水产品中O139群菌株绝大多数为产毒株,而O1群菌株绝大多数为非产毒株。应重点加强水产品的霍乱监测。药敏结果供霍乱治疗和必要时的预防药物选择提供依据。     

非O1群霍乱弧菌致病因子检测与分析

〔目的〕非O1群霍乱弧菌有多种致病因子引能起人群腹泻 ,为了解非O1群霍乱弧菌中致病性因子 ,对其进行检测与分析。〔方法〕用平板法和试管法测定溶血素 ;用小鼠测定非O1群霍乱弧菌菌株的急性毒性 ;用VTEC -RPLA法测定菌株的Vero毒素 ;用EIA法测定菌株的ST毒素 ;用PCR法测定菌株的CT毒素。〔结果〕非O1群霍乱弧菌平板法溶血素 2 2 6株阳性 ,阳性率为 94.4% ;试管法溶血素 2 2 0株阳性 ,阳性率为 88.9% ;未检出耐热性溶血素。产ST毒素的菌株186株 ,阳性率为 78.8%。 45株产VTl毒素 ,67株产VT2毒素 ,同时产VTl和VT2两种毒素的 3 5株。 3株非O1群霍乱弧菌检出CT毒素其因 ,产毒率为 1.3 %。〔结论〕检测发现非O1群霍乱弧菌对小鼠有较强的致病能力 ,说明其对人群的危害较大、毒性较强 ;检出CT毒素说明非O1群霍乱弧菌具有引起重症腹泻 (霍乱样腹泻 )的能力 ;检出溶血素、ST毒素、Vero毒素致病因子 ,说明非O1群霍乱弧菌的致病因子有多种。由于菌株发生CT毒素基因频度较低 ,目前不可能成为非O1群霍乱弧菌腹泻的主要的致病因素 ,而菌株发生溶血素、ST毒素、Vero毒素的频度较高 ,尤其是溶血素、ST毒素 ,有可能是非O1群霍乱弧菌的主要致病因子。     

江西省霍乱外环境监测菌株分子分型研究

目的分析江西省1999-2006年外环境监测分离的O139群霍乱弧菌之间的分子分型特征和遗传相关性,为霍乱防制提供科学依据。方法利用聚合酶链反应检测霍乱毒素基因,用脉冲场凝胶电泳对菌株进行分子分型,所得结果以BioNumerics V5.01软件UPGMA方法进行聚类分析。结果 43株O139群霍乱弧菌中15株为产毒株,28株为非产毒株;43株O139群霍乱弧菌以NotⅠ酶切后脉冲场凝胶电泳可分为22个型别。结论江西省外环境分离菌株PFGE型别呈多态性。要加强对环境水体霍乱弧菌污染状况的监测工作,结合流行病学调查分析,为霍乱暴发或流行提供预测预警。     

双重套式PCR方法在霍乱弧菌外环境监测中的应用

目的 建立一种能够检测O1群和O139群霍乱弧菌的套式聚合酶链反应方法,并应用于外环境水体标本的监测.方法 根据GenBank发表的O1群和O139群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb的序列,运用DNAStar Primer Select软件各自设计6条引物,检测不同引物组合的特异性,建立双重套式PCR方法同时检测O1群和O139群霍乱弧菌;并对该方法进行敏感度、特异度、重复性及现场评价.通过比较套式PCR与常规PCR的DNA检出下限分析该方法的敏感度;对32份套式PCR阳性的水体样本(O1群11份,O139群21份)进行重复性评价,挑选部分阳性扩增产物进行测序,分析其与相应基因序列的一致性.结果 建立的检测O1群和O139群霍乱弧菌的双重套式PCR体系,根据其扩增的片段大小能够区分O1群和O139群霍乱弧菌,而对其他弧菌DNA样品都未见特异性扩增;敏感度比常规PCR高15 000倍,且在多引物或者多模板共存于一个反应管的试验条件下,不会对敏感度产生干扰;32份套式PCR阳性的水样标本,经2次或3次套式PCR试验,结果显示该体系具有较好的重复性和一致性,阴性水样均无任何扩增产物,说明所用引物的特异性较好;序列分析表明扩增产物仅同霍乱弧菌相应的基因序列有100%的一致性.结论 本检测相应霍乱弧菌的双重套式PCR方法,具有灵敏、特异、快速、适合基层实验室的特点,可用于监测外环境水体中霍乱弧菌的存在及消长情况.     

福建发现有毒力产色素的O139群霍乱弧菌

1998年10月作者在对本省外环境监测分离的霍乱菌株进行纯化鉴定中,发现一株能稳定产生铁锈色水溶性色素,携有ctxA霍乱毒素基因并且有产肠毒素能力的O139群霍乱弧菌(O139VC).生物学性状与毒力检测结果报告如下.     

江西省2006-2008年人间霍乱弧菌致病力及药敏检测

目的掌握江西省人群中霍乱弧菌菌型变迁、毒力基因、耐药情况,为霍乱防治提供科学依据。方法采用血清学分型法对人群分离的霍乱弧菌进行分型,同时以主要毒力基因ctx为引物对分离的霍乱弧菌进行PCR扩增,并采用改良K-B纸片法对部分菌株进行10种抗生素的药物敏感试验。结果 2006-2008年期间,共从人群中分离到霍乱菌株139株(O139群136株,O1群小川型3株),其中从患者中分离到O139群41株、O1群小川型1株;从密切接触者中分离到O139群95株、O1群小川型2株。毒力实验结果显示O139群中除1株外,其余的均扩增出与阳性对照一致的毒力基因(ctx)条带,而O1群小川型均未扩增出毒力基因(ctx)条带,与阴性对照一致。药敏结果显示:O139群和O1群小川型霍乱弧菌均对利福平、丁胺卡那、氟哌酸、环丙沙星、头孢噻肟100%敏感,耐药性在90%以上的药物是四环素、强力霉素。结论江西省2006-2008年间人群中分离到的霍乱弧菌中,O139群与O1群小川型并存,O139群为优势菌;O139群菌株绝大多数为产毒株,小川型均为非产毒株。药敏结果供霍乱治疗和必要时的预防药物选择提供依据。     

一起 O139 群霍乱疫情的调查

近年来,O139群霍乱疫情发生的比例不断上升,疫情的发生主要跟食用被霍乱弧菌污染的水产品,特别是甲鱼有关。2013年5月9日,麻城市疾病预防控制中心接到上级主管部门通知,该市熊家铺一男子因剧烈腹泻在武汉协和医院被临床诊断为疑似霍乱病例,该市疾病预防控制中心立即组织相关专业人员,赶赴现场进行调查处理,经湖北省疾病预防控制中心传染病所实验室复核诊断为O139群霍乱弧菌,毒素基因（ctxAB）阳性,对病因及实验室检测结果进行了流行病学调查分析。     

豆类及其制品中大肠杆菌O157和O104的双重real-time PCR检测方法

目的建立一种快速检测豆类及其制品中肠出血性大肠杆菌O157、O104的双重real-time PCR方法。方法分别选取大肠杆菌O157的特异性基因rfbE和大肠杆菌O104的特异性基因wzy作为靶基因,设计相应的特异性引物探针,建立双重real-time PCR反应体系,并对反应体系及引物浓度等反应条件进行优化。结果最终确定反应体系为:以大肠杆菌O157、大肠杆菌O104菌株的DNA按照1∶3比例混合作为模板,模板DNA 2μL,Master Mix 12.5μL,上游引物(10μmol/L)各1μL,下游引物(10μmol/L)各1μL,探针(10μmol/L)各0.5μL,灭菌水补齐至25μL。实现了同一次处理样品在同一反应体系中同时检测肠出血性大肠杆菌的两种血清型,检测灵敏度的下限可达102CFU/m L(g)。结论该方法特异性好,对其他常见病原菌无扩增,灵敏度高、快速、简便,为食源性致病菌的检测提供了理想手段。