骨髓间充质干细胞向肝细胞转化的研究进展

骨髓间充质干细胞具有自我更新和多向分化潜能的特性，在体内特定的微环境中可向肝前体细胞及成熟肝细胞转化，明显改善肝功能；在体外通过肝细胞生长因子等诱导作用可转化为肝细胞样细胞，有望成为肝细胞移植或生物人工肝支持系统的新型种子细胞。就骨髓间充质干细胞向肝细胞的转化研究进行了阐述。     

腺病毒介导的肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死***

背景：骨髓间充质干细胞可以分化为心肌细胞,促进血管再生,但在移植早期其自身分泌的细胞因子不足以维持良好的分化和再生。 目的：验证腺病毒介导的肝细胞生长因子和血管内皮生长因子双基因转染新西兰兔骨髓间充质干细胞移植对新西兰兔梗死心肌组织的修复重建和血管再生的影响。 方法：腺病毒介导肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染BrdU标记的新西兰兔骨髓间充质干细胞。取新西兰兔50只建立急性心肌梗死模型,4周后随机分为5组,分别于梗死心肌内注射：①骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子+肝细胞生长因子。②骨髓间充质干细胞/Ad. 肝细胞生长因子。③骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子。④骨髓间充质干细胞。⑤对照组注射等量无血清IMDM培养液。移植4周后观察移植细胞的分化和新生血管的形成,并通过超声多普勒检测心功能变化。 结果与结论：除对照组外,其余4组兔心功能都较移植前有明显改善(P < 0.05),其中移植双基因转染骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子+肝细胞生长因子组兔的心功能改善程度要明显高于其他3组。部分BrdU染色阳性的细胞可以分化成为内皮细胞,参与构成了梗死区域的新生毛细血管。与对照组比较,其余4组都有明显的血管新生(P < 0.05),而以骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子+肝细胞生长因子组最显著。提示肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染新西兰兔骨髓间充质干细胞移植于梗死心肌可以促进心肌再生和新生血管的形成,明显改善心功能。 关键词：基因转染;骨髓间充质干细胞;血管内皮生长因子;肝细胞生长因子;移植 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.029     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为肝细胞样细胞

背景：目前体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的研究主要集中在不同诱导因子的诱导作用,而微环境的诱导作用研究较少。 目的：观察肝细胞生长因子、胎肝细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的影响。 方法：采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞,反复贴壁法纯化扩增骨髓间充质干细胞;采用Ⅰ型胶原酶消化法分离孕3周大鼠胚胎肝脏细胞,差速贴壁法纯化肝脏细胞;阴性对照组骨髓间充质干细胞只加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基。诱导组在阴性对照组基础上加入一定浓度肝细胞生长因子或者与胎肝细胞共培养进行诱导分化。 结果与结论：诱导组白蛋白、甲胎蛋白水平均高于非诱导组(P < 0.01),诱导组糖原染色阳性,免疫细胞化学染色CK-18阳性,而非诱导组糖原染色、CK-18均阴性。结果显示肝细胞生长因子和胎肝细胞均可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞。     

骨髓间充质干细胞向肝细胞转化的研究进展

骨髓中存在多种具有很强的自我更新和多向分化能力的干细胞.研究表明,骨髓间充质干细胞在体外可通过肝细胞生长因子等的诱导作用转化成肝样细胞,在体内利用特定微环境的作用也可转化为肝前体细胞和成熟的肝细胞,并明显改善肝功能.骨髓间充质干细胞有望成为肝细胞移植或生物人工肝的新型种子细胞.本文就骨髓闻充质干细胞在治疗肝病中的研究进展作简要综述.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞

目的 研究HGF、aFGF及OSM诱导MSCs成为肝细胞的能力及其在分化中的作用。方法 用HGF、 aFGF、OSM诱导分化MSCs后,用化学发光法、RT-PCR法及谷氨酸脱氢酶法检测细胞AFP、ALB及尿素的表达情况。结果 除对照组外其余各组细胞均有AFP表达 (P<0.05);对照组及a+O组无ALB、尿素的表达,其余各组出现ALB及尿素的表达(P<0.05)。结论HGF联合aFGF、OSM及aFGF能够诱导MSCs分化为表达AFP、ALB、尿素的肝细胞;aFGF与OSM在没有HGF存在时不能诱导MSCs向较为成熟的肝细胞的分化。     

肝纤维化大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为类肝细胞

目的 观察正常、肝纤维化模型组大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）体外诱导分化为类肝细胞的差异。方法 Wistar大鼠随机分为对照组和肝纤维化模型组。用皮下注射CCl4乳剂建立肝纤维化模型。用密度梯度离心法和贴壁法分离大鼠的MSCs,经培养传代获得纯化的MSCs。用肝细胞生长因子（HGF）和成纤维细胞生长因子-4（FGF-4）诱导培养纯化的MSCs。留取15、21和27 d细胞培养液进行白蛋白（Alb）、甲胎蛋白（AFP）检测;于27 d收集细胞爬片,进行糖原染色和免疫细胞化学染色检测MSCs中CK-18、CK-19。结果 于诱导15、21和27 d,2组经诱导培养的MSCs AFP水平均高于未诱导的MSCs（P<0.01）,其中21 d AFP水平最高;而白蛋白水平21和27 d 2组经诱导培养的MSCs均高于未诱导的MSCs（P<0.01）,15 d无差异,27 d最高。27 d 2组经诱导培养的MSCs糖原染色和CK-18、CK-19免疫细胞化学染色均阳性,未诱导的MSCs糖原染色、CK-18、CK-19均阴性。从AFP、白蛋白水平综合比较,正常和肝纤维化模型组大鼠MSCs诱导效果无明显差别。结论 HGF、FGF-4可在体外诱导肝纤维化大鼠的MSCs分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞。     

骨髓间充质干细胞向肝细胞转化的研究进展

骨髓间充质干细胞具有自我更新和多向分化潜能的特性,在体内特定的微环境中可向肝前体细胞及成熟肝细胞转化,明显改善肝功能;在体外通过肝细胞生长因子等诱导作用可转化为肝细胞样细胞,有望成为肝细胞移植或生物人工肝支持系统的新型种子细胞。就骨髓间充质干细胞向肝细胞的转化研究进行了阐述。     

肝纤维化大鼠血清体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

背景：近年来临床运用骨髓间充质干细胞移植治疗晚期肝纤维化取得了较好疗效,但由于肝源稀少,骨髓干细胞体外分化为成熟肝细胞的技术仍然不成熟。 目的：探讨骨髓间充质干细胞体外诱导其分化为肝细胞的可行性。 方法：构建大鼠肝纤维化模型,分离、纯化并鉴定大鼠骨髓间充质干细胞,制备正常及肝纤维化大鼠血清,取第3代骨髓间充质干细胞分组培养,分别加入以下培养基：DMEM+体积分数10%胎牛血清;肝细胞生长培养基(HGM)+体积分数5%胎牛血清;HGM+5%正常大鼠血清;HGM+5%肝纤维化大鼠血清;HGM+5%肝纤维化大鼠血清+25 μg肝细胞生长因子。观察各组细胞形态变化,MTT法测定细胞生长曲线,采用Realtime-PCR检测甲胎蛋白和细胞角蛋白18的表达,溴甲酚绿法检测上清液中白蛋白水平,ELISA法检测培养上清液中转化生长因子β1表达。 结果与结论：正常大鼠血清能促进骨髓间充质干细胞的增殖;肝纤维化大鼠血清对骨髓间充质干细胞促增殖作用最好,且能有效诱导其向肝细胞分化,联合使用肝细胞生长培养基能提高分化率。     

过表达IDO 大鼠骨髓间充质干细胞改善异位移植心脏存活

目的:探讨过表达IDO 大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)改善大鼠腹腔异位移植心脏的存活机制。方法:通过慢病毒载体GV308 携带IDO 基因转染大鼠骨髓间充质干细胞构建过表达IDO 大鼠骨髓间充质干细胞。建立大鼠腹腔异位移植心脏模型,经尾静脉给予相应细胞处理:1.利用超声心动图检测移植心脏心功能变化。于采用小动物活体成像系统评估移植心脏局部荧光强度。2.再取各组受体大鼠的脾脏,采用流式细胞技术检测CD40、CD86、CD80、MHCⅠ、CD274、CD45RA、CD45RA+CD45RB、Treg 细胞的表达情况。3.取各组移植心脏,采用HE 染色评估炎性细胞浸润情况。虞利用液相芯片检测各组血清IL-1α、IL-4、IL-1β、IL-2、IL-10、IFN-γ、IL-18、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3 因子的变化情况。结果:淤给予相应细胞处理,可见过表达IDO-BMSCs 处理后2 d 移植心脏的EF、FS 较其余各组有提高。于采用小动物活体评估可见过表达IDO-BMSCs 组移植心脏局部荧光强度最强。盂给予干预措施后2 d 可见过表达IDO-BMSCs 组脾脏细胞CD40、CD86、CD80、MHCⅠ、CD45RA、CD45RA+CD45RB 表达降低,而CD274、Treg 细胞的表达增高。榆采用液相芯片检测各组提取血清可见在2 d 时,过表达IDO-BMSCs 组血清中IL-1α、IL-4、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-18 是降低的;IL-10、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3 表达量是升高的。HE 染色证实过表达IDO-BMSCs 组炎性细胞浸润少于其他组。结论:过表达IDO 的BMSCs 可以通过有效调节免疫DC、T 细胞及细胞因子,从多个免疫层面改善移植心脏存活。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离和体外培养

骨髓中的间充质干细胞 (ＭＳＣｓ ,ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ)是一种具有多向分化潜能的细胞 ,它的分化程度低 ,在特定的条件下 ,能诱导分化形成多种非造血组织细胞 (如 :成骨细胞、软骨细胞、肌细胞等 )。本实验对成体大鼠骨髓间充质干细胞进行了分离、培养和初步的组织化学检测 ,并对其生长方式进行了观察。1　材料与方法1.1　材料　实验动物为成年ＳＤ大鼠 ,由广西医科大学实验动物中心提供 ,饲养观察一周后使用。主要试剂为ＤＭＥＭ培养液 ,胎牛血清 ,胰蛋白酶和Ｐｅｒｃｏｌｌ分离液。1.2　方法1.2 .1　骨髓中间充质干…     

bFGF在局灶性脑缺血后内源性神经干细胞增殖过程中对Id2的影响

目的检测DNA结合抑制物2(inhibitor of DNA binding 2,Id2)在大鼠脑缺血再灌注海马组织神经干细胞中的表达及bFGF的干预作用。探讨影响神经干细胞增殖分化的分子调控机制。方法采用大脑中动脉栓塞(MCAO)制作大鼠脑缺血再灌注模型。用免疫组织化学法检测海马神经干细胞BrdU、Id2的表达及bFGF的干预作用。结果随着脑缺血再灌注第3天缺血海马神经元BrdU阳性细胞明显增多,第7天达高峰,Id2反应产物脑缺血再灌注第3天较正常组增多,随缺血再灌注时间的延长逐渐增多,第7天表达最强,以后表达逐渐减少。注射bFGF后BrdU、Id2的表达明显增加。结论 bFGF促进神经干细胞的增殖及缺血脑组织Id2的表达,提示bFGF促进神经干细胞增殖作用可能由Id2信号介导。     

肿瘤坏死因子α刺激骨髓间充质干细胞表达及分泌肝细胞生长因子

背景：有研究表明,肿瘤坏死因子α可以刺激骨髓间充质干细胞发挥免疫抑制功能,并促进骨髓间充质干细胞表达肝细胞生长因子。 目的：观察肿瘤坏死因子α刺激大鼠骨髓间充质干细胞是否可以促进肝细胞生长因子的表达及分泌。 方法：全骨髓贴壁法分离、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞,传代至第三四代使用。以100 µg/L肿瘤坏死因子α预刺激骨髓间充质干细胞 5 h后弃去培养基,换上新鲜培养基作为实验组,以正常培养的骨髓间充质干细胞为空白组。采用倒置相差显微镜观察细胞形态;流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面标记物CD29、CD34、CD44、CD45的表达;RT-PCR 、Western blot检测细胞肝细胞生长因子mRNA及蛋白表达;ELISA测定细胞上清液中肝细胞生长因子水平。 结果与结论：获得的骨髓间充质干细胞形态均一,呈典型的旋涡样生长。骨髓间充质干细胞表达CD29⁺99.45%,CD34^-97.91%、CD44⁺99.52%、CD45^-98.42%;骨髓间充质干细胞中肝细胞生长因子 mRNA及蛋白与上清液中肝细胞生长因子表达量呈时间依赖性增加,实验组肝细胞生长因子 mRNA及蛋白与上清液中肝细胞生长因子的表达量明显高于空白组(P < 0.01)。说明肿瘤坏死因子α刺激骨髓间充质干细胞可以有效促进肝细胞生长因子的表达及分泌。     

脂肪来源的干细胞移植对大鼠脑缺血后微血管生成及bFGF和VEGF表达的影响

目的:探讨脂肪来源的干细胞(ADSC)移植对大鼠脑缺血后微血管生成的可能机制.方法:72只清洁级成年雄性Sprague-Darley大鼠, 随机分为假手术组(Sham组)、局灶性脑缺血组(MCAO组)、溶剂对照组(vehicle组)和ADSC治疗组(ADSC组), 每组18 只, 采用改良Zea-Longa线栓法制作大脑中动脉栓塞(MCAO)模型, ADSC移植前用DAPI标记, ADSC 组于造模成功1 d后经侧脑室注射入30 μL的经DAPI标记的ADSC细胞悬液, 内含1×106细胞, vehicle组则注射同等剂量的PBS, 术后4 d、7 d和14 d分批处死实验动物, 并断头取脑, 采用免疫组织化学法和半定量RT-PCR法检测缺血区脑组织的新生血管及bFGF和VEGF表达的动态变化.结果:大鼠脑缺血后缺血区即可见大量的微血管生成, 2周达高峰.ADSC组较MCAO组和vehicle组缺血区微血管密度明显增高(P＜0.01);ADSC组术后4 d、7 d和14 d脑组织中bFGF和VEGF的表达水平较MCAO组和vehicle组明显增高.结论:ADSC移植促进脑缺血大鼠缺血区微血管的生成, 其机制可能与促进bFGF和VEGF的表达有关.     

骨髓间充质干细胞对大鼠异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的影响

目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）对异基因骨髓移植（allo—BMT）后移植物抗宿主病（GVHD）的影响。方法：从大鼠骨髓中分离培养问充质干细胞，通过形态学观察及流式细胞术检测表面标志以鉴定其纯度。通过混合淋巴细胞培养（MLR）检测MSCs体外对T细胞增殖的影响。建立大鼠GVHD模型（SD—Wistar），对其进行allo—BMT的同时，共移植不同数量供者源性的MSCs，观察受体大鼠的临床表现、绘制Kaplan—Meier生存曲线，并通过病理分析，综合评价MSCs，对allo-BMT后GVHD的影响。结果：在混合淋巴细胞培养体系中加入与反应淋巴细胞同源的MSCs，能够抑制T细胞的增殖，不同MSCs浓度组之问存在显著性差异（P〈0．01）。异基因骨髓移植时，供鼠MSC与T细胞比例为1：5、2：5共输注时，能推迟受鼠GVHD的发生时间，延长生存期，但并未避免GVHD的发生；当比例为1：1时，只有20％的受鼠发生了慢性GVHD反应，1—2周后逐渐缓解，并得到了长期生存，其余80％大鼠均未出现GVHD反应而长期生存。结论：大鼠MSCs不仅在体外能够抑制T细胞的增殖，体内共移植骨髓和高数量的MSCs也可以降低GVHD的发生率和严重程度，并延长受鼠的生存时间。本研究结果为临床GVHD的防治提供了新的思路。     

骨髓间充质干细胞移植对缺血心肌的血管新生及增殖-凋亡影响

 目的 探讨骨髓间充质干细胞（BMSC）移植对缺血心肌的血管新生及增殖-凋亡的影响。方法 将雄性小鼠BMSC经尾静脉输入异丙肾上腺素性心肌缺血雌性小鼠（BMSC组）。另设正常对照组和未治疗组。5周后处死小鼠,荧光定量PCR检测心肌Y染色体鉴别基因(SRY)、血管内皮生长因子（VEGF）的表达。天狼猩红染色分析心肌胶原含量。免疫组织化学染色观察心肌VEGF、核增殖抗原(PCNA)和细胞凋亡蛋白酶（caspase-3）的分布。 结果 BMSC组心肌SRY表达明显升高（11.22±0.90 vs 1.05±0.47, P<0.05）。与未治疗组相比,BMSC组的心肌胶原沉积减少(3.44±0.84 vs 8.44±1.09, P<0.05),VEGF(14.19±0.37 vs 11.88±0.28, P<0.05)和PCNA(4.08±0.18 vs 0.64±0.05, P<0.05)表达上调,caspase-3降低（0.46±0.11 vs 3.12±0.28, P<0.05）。 结论 BMSC能归巢至缺血心肌并促进微血管新生,改善心肌增殖-凋亡状态。     

骨髓间充质干细胞移植治疗肢体缺血的机制

背景：骨髓间充质干细胞移植治疗下肢缺血疾病已取得较好的效果,但其作用机制尚无定论。 目的：探讨骨髓间充质干细胞移植治疗SD大鼠后肢缺血的机制。 方法：结扎肾动脉下腹主动脉、腰动脉和髂腰动脉制备雌性SD大鼠后肢缺血模型。将扩增、纯化的雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞注射入大鼠缺血的右后肢股直肌中,对照组右后肢注射等量生理盐水。移植后2,4,6周,制备大鼠右股直肌切片行苏木精-伊红染色、血管内皮生长因子免疫组织化学染色、SRY基因免疫组织化学染色。 结果与结论：移植后2,4,6周移植组右股直肌毛细血管计数、血管内皮生长因子免疫组织化学染色阳性细胞计数均明显高于对照组(P < 0.01)。移植组股直肌切片中SRY免疫组织化学染色阳性细胞出现于毛细血管壁,并散在分布于肌组织中。结果表明局部注射移植骨髓间充质干细胞能促进缺血组织迅速生成大量毛细血管,改善大鼠缺血下肢的血供。骨髓间充质干细胞作为旁分泌细胞,通过增加血管内皮生长因子的分泌,促使大鼠缺血肢体的血管新生。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血区血管新生及神经前体细胞增殖的影响

目的：探讨骨髓问充质千细胞（MSC）移植促进大鼠脑缺血后神经功能恢复的可能机制。方法：用线栓法复制大鼠脑缺血再灌注动物模型,分缺血对照组和移植治疗组（经颈动脉移植体外培养异体MSC）。采用免疫组织化学染色及原位杂交技术观察缺血区脑组织的新生血管、细胞增殖及巢蛋白表达的变化。结果：（1）移植组比对照组缺血区皮层微血管密度（MVD）明显增高,血管内皮生长因子（VEGF）mRNA阳性信号明显增强。（2）缺血区顶叶皮层、尾壳核、室管膜、室管膜下区均可见大量Nestin阳性细胞及BrdU阳性细胞．各时间段移植组两种阳性细胞数均比对照组显著增多。结论：MSC可能通过改善缺血区血运及促进缺血区神经前体细胞再生达到修复缺粗区损伤组织．从而改善脑缺血大鼠神经功能。     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景：骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。 目的：观察hVEGF165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。 方法：体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1∶3比例的混合液转染,并分为3组：转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。 结果与结论：转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义(P < 0.05),但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义(P > 0.05),转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义(P< 0.05),hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。