骨髓基质干细胞移植和成骨生长肽对股骨头坏死修复作用的实验研究

目的 本实验探讨骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)移植和成骨生长肽(osteogenic growth peptide,OGP)对激素性股骨头坏死的影响.方法 实验取25只成年日本大耳白兔,5只为正常组,其余20只制成激素性股骨头坏死模型,随机分为实验组和对照组,每组10只.实验组为BMSCs移植于动物股骨头后OGP注射4、8周,对照组注射等量生理盐水.测定血清碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP),测试股骨头力学性质,通过光镜和扫描电镜观察股骨头的形态结构.结果 实验组ALP、BGP明显高于对照组(P＜0.05).实验组股骨头的最大压缩载荷及载荷/位移较对照组高(最大压缩载荷差异有显著性P＜0.05,载荷/位移差异没有显著性P＞0.05).光镜、扫描电镜观察到实验组动物股骨头中骨小梁形态及胶原纤维排列有序性明显好于对照组.结论 BMSCs移植和OGP注射对股骨头坏死具有一定的修复作用.     

不同基因转染对骨髓基质干细胞成骨活性的影响

为了优化骨组织工程种子细胞，探讨不同基因对骨髓基质干细胞（MSCs）成骨活性的影响，我们首先利用RT—PCR方法获得了全长BMP-2．VEGF 165及bFGF基因，克隆入真核表达载体peDNA3．0，鉴定正确后，经脂质体介导转入分离培养的大鼠骨髓基质干细胞，G418筛选出稳定表达株。并利用RT—PCR、免疫组织化学方法证明目的基因能够在骨髓基质干细胞中得到稳定表达。MTT实验结果显示转基因后的MSCs增殖能力有不同程度的提高。细胞内碱性磷酸酶活性明显上调，BMP-2、bFGF转染组骨钙索水平升高，成骨活性增强。提示：BMP-2、bFGF基因修饰的骨髓基质干细胞作为种子细胞能够更为有效地在骨组织工程中发挥作用。     

pcDNA3.1-Smac真核表达载体的构建及表达

目的:构建人的smac基因真核表达载体pcDNA3.1-Smac,并在肺腺癌A549细胞中表达.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人睾丸组织中扩增到smac基因,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Smac.酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至肺腺癌A549细胞中.采用RT-PCR、Western blot法检测外源基因smac的表达,MTT法检测细胞生长抑制率.结果:PCR扩增片段与预期片段大小相符,插入片段测序结果与GenBank公布的一致,表明人smac基因克隆及真核表达载体peDNA3.1-Smac构建成功.在mRNA水平和蛋白水平,转染后的细胞中外源基因smac表达均明显增加.转染smac质粒72 h后,细胞的生长抑制率较转染空质粒组显著增加.结论:成功构建重组真核表达载体peDNA3.1-Smac,并在肺癌A549细胞中进行了表达;验证了转染后对肺癌细胞生长有抑制作用.     

小鼠骨髓基质干细胞体外成骨的实验研究

目的　建立一种良好的分离和培养小鼠骨髓基质干细胞 (moasebonemarrow derivedmesenchymalstemcells ,mMSCs)的方法 ,观察小鼠骨髓基质干细胞体外成骨潜能。方法　应用贴壁选择法结合细胞克隆收集法进行mMSCs的分离纯化 ,应用细胞生长因子 (EGF和PDGF BB)刺激法进行MSCs的体外培养和传代 ,并在低糖DMEM (DMEM LG)培养液中培养。为促进mMSCs体外成骨性分化 ,传代培养到一定时期时加入成骨性添加剂和 1 0 %胎牛血清。培养第 2 0天分别用Gomori钙钴法显示碱性磷酸酶和VonKossa改良法显示钙化结节。结果　mMSCs呈克隆化增殖并贴壁生长形成形态均一的梭形细胞群。成骨性添加剂可有效作用于传代培养的mMSCs,表现为细胞之间相互连接形成结节状聚合体 ,碱性磷酸酶阳性细胞数量增多 ,VonKossa染色可见钙化结节的形成。结论　建立的mMSCs的分离、培养和成骨条件有效 ,所分离培养的mMSCs具有良好的体外成骨潜能     

基因芯片分析成骨生长肽对OPG-/-小鼠骨髓间充质干细胞的作用

背景：合成成骨生长肽在体外可刺激骨髓间充质干细胞增殖和向成骨细胞分化,体内可增加骨密度改善骨质疏松,但具体作用机制尚未明确。 目的：应用小鼠全基因组芯片筛查合成成骨生长肽作用下OPG-/-小鼠骨髓间充质干细胞的差异表达基因,探索成骨生长肽作用下可能影响到的基因与信号传导通路。 方法：应用上海伯豪生物技术有限公司提供的小鼠全基因组Oligo芯片,筛选成骨生长肽干预组与空白对照组OPG-/-小鼠骨髓间充质干细胞差异表达基因,实时定量PCR分析验证部分与增殖分化相关的差异表达基因,并结合聚类分析及通路分析来探索成骨生长肽的作用机制。 结果与结论：芯片结果显示,成骨生长肽作用后使346条基因表达下调,121条基因表达上调。PCR验证结果与芯片结果相符。经BioCarta通路分析,涉及6条通路蛋白;经KEGG通路分析,涉及12条通路。成骨生长肽对OPG-/-小鼠骨髓间充质干细胞的作用涉及多条信号传导通路,其中MAPK信号传导通路可能对其促增殖起着至关重要作用。     

骨髓基质干细胞与骨基质明胶复合培养体内异位成骨的实验研究

目的：探讨骨髓基质干细胞(MSC)与骨基质明胶复合培养体内异位成骨的可行性。方法：将SD大鼠来源的MSC与同种异体的骨基质明胶复合培养后植入SD大鼠背部竖脊肌肌膜内，分别于术后不同的时间点处死大鼠，标本进行碱性磷酸酶(ALP)活性测定及组织形态学观察：结果：实验组标本自术后第3周ALP活性起就表现出阳性，第4周MSC与骨基质明胶复合体内大量成骨。结论：MSC与骨基质明胶复合培养体内异位成骨完全可行的。     

真核表达载体pcDNA3.1(+)-vIL-10的构建及其在SD大鼠骨髓基质干细胞的表达

目的构建携带免疫调节因子vIL-10c DNA的真核表达载体,转染至SD大鼠骨髓基质干细胞,观察免疫调节因子vIL-10在骨髓基质干细胞的表达。方法PCR扩增原核载体PET-28α/vIL-10,获得目的基因vIL-10,目的基因在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体Pc DNA3.1(+),转染大鼠骨髓基质干细胞。用G418筛选得到vIL-10高表达的细胞,对照组为pcDNA3.1(+)直接转染的骨髓基质干细胞。结果经PCR、酶切、测序鉴定显示按设计构建的载体pc DNA3.1(+)-vIL-10,已成功转染骨髓基质干细胞。RT-PCR检测到510bp目的片段vIL-10在骨髓基质干细胞表达,SDS-PAGE电泳表明在骨髓基质干细胞有vIL-10蛋白的表达。结论vIL-10 mRNA和蛋白在骨髓基质干细胞中表达。     

脂质体介导骨保护素基因转染大鼠骨髓基质干细胞及其表达

背景：基因修饰骨组织工程种子细胞,可提高对骨缺损的修复能力。 目的：构建含有骨保护素的真核表达载体并检测转染骨髓基质干细胞后的表达。 方法：取4周龄SD大鼠胫骨和股骨行骨髓基质干细胞的分离和培养,分为载体组、空载体组、对照组。空载体组转染plRES2-EGFP载体,载体组转染plRES2-EGFP-OPG。 结果与结论：转染后激光扫描共聚焦显微镜观察可见骨髓基质干细胞内绿色荧光蛋白表达;RT-PCR检测结果可见质粒载体组在1 200 bp有明显条带,空载体组及对照组未见表达;免疫细胞化学检测骨髓基质干细胞内骨保护素蛋白呈阳性;MTT法检测各组细胞增殖活力无明显改变(P > 0.05)。证实应用plRES2-EGFP-骨保护素质粒转染大鼠骨髓基质干细胞,可获得外源性骨保护素的基因及蛋白表达。     

骨髓间充质干细胞中突变型人低氧诱导因子1α真核表达载体的表达

背景：转基因小鼠体内实验证实,重组的低氧诱导因子1α可以促进皮肤形态功能正常的血管新生。 目的：构建能够在常氧条件下同时表达突变型低氧诱导因子1α目的蛋白和绿色荧光蛋白报告分子的新型腺病毒真核表达载体,并转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,检测该基因在细胞中的表达情况。 方法：利用Lipofectamine 2000介导将构建成功的重组腺病毒真核表达载体pAd-HIF1αmu- IRES-hrGFP-1转染HEK293A细胞,包装病毒,以最佳感染指数=50将重组腺病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞,并设3个对照组,即阳性对照组：转染Ad-CMV-HIF1α-IRES-hrGFP-1;阴性对照组：转染Ad-CMV-IRES-hrGFP-1组;空白组：未转染病毒。 结果与结论：①腺病毒载体成功转染HEK293A细胞,包装成功,细胞内有大量绿色荧光表达。②转染突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体的细胞在常氧条件下蛋白表达量明显高于转其他3组,3个对照组间差异无显著性意义(P > 0.05)。提示突变型腺病毒真核表达载体Ad-HIF1α-IRES-hrGFP-1在HEK293A内成功包装;突变后低氧诱导因子1α基因能够在常氧条件下大量且高效表达。     

负载大鼠VEGF120基因的真核细胞表达载体pCDNA 3.1的构建及鉴定

目的构建负载大鼠VEGF120基因的真核细胞表达载体pCDNA 3.1,使外源性VEGF120基因可以在真核细胞中表达。方法利用缺氧后大鼠脑组织,提取总RNA,采用RT-PCR技术,利用已知引物合成cDNA,将VEGF120基因扩增后插入真核细胞表达载体pCDNA 3.1。重组质粒热转化至感受态E.ColiJM109细胞中,获得重组菌株。提取质粒,进行酶切鉴定及插入基因进行测序。结果限制性内切酶酶鉴定及测序证实已将VEGF120cDNA成功插入真核细胞表达载体。结论成功构建负载大鼠VEGF120基因的真核细胞表达载体pCDNA3.1,本实验研究为外源性VEGF基因导入真核细胞提供一种途径。     

pcDNA3.1+-MBL 真核表达载体构建及其在不同哺乳动物细胞株中的表达

目的　比较人甘露聚糖结合凝集素 (MBL)基因在不同哺乳细胞株中的表达效率。方法　应用PCR从含有中国人野生型MBLcDNA的质粒pGEM MBL中扩增目的基因片段 ,将其克隆至pcDNA3.1 表达载体 ,经酶切及测序鉴定后 ,以电穿孔法转染CHO、HEPG2和HEK2 93细胞 ,以RT PCR、ELISA分析其在 3株细胞中的表达情况。结果　从pGEM MBL中扩增得到约 75 0bp的MBLDNA片段 ,构建成重组表达载体pcDNA3.1 MBL ,经酶切出现 75 0bp片段 ,测序鉴定与预期的完全一致。将其转染进细胞后 ,经G4 18选择转染子并克隆化培养 ,RT PCR和ELISA分析显示 ,在CHO和HEK2 93细胞中及培养上清液中分别有较高的MBLmRNA和蛋白表达 ,而HEPG2细胞表达较低。结论　人MBL在CHO和HEK2 93细胞中的表达效率较高 ,为今后在哺乳动物细胞中高效表达人MBL积累了经验     

重组慢病毒载体转染羊骨髓间充质干细胞及成骨基因表达量的变化

背景：碱性成纤维细胞生长因子具有促进骨髓基质细胞分裂增殖作用,而骨形态发生蛋白2在诱导新骨形成方面有重要的研究意义。目的：分析骨形态发生蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子基因单独和联合转染对体外培养的骨髓间充质干细胞的增殖和骨向分化的影响,比较Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白等非特异性成骨基因于转染前后骨髓间充质干细胞相对表达量的差别,为构建组织工程骨的种子细胞做理论依据。方法：构建碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白2慢病毒载体,分别转染羊骨髓间充质干细胞,得到碱性成纤维细胞生长因子组、骨形态发生蛋白2组、联合组、对照组细胞,提取RNA后采用实时定量PCR的方法检测Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白等非特异性成骨基因的mRNA水平相对表达量的变化。结果与结论：对照组、碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白2及联合组4组间非特异性成骨基因表达量存在明显差异(P < 0.05),且碱性成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白2具有交互作用(P < 0.05),碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白2联合组的Ⅰ型胶原蛋白和骨钙蛋白基因表达量明显高于其他3组,且差异有显著性意义(P < 0.05);但是骨桥蛋白基因中差异无显著性意义(P > 0.05)。体外实验结果显示联合转染组中的Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白等非特异性成骨基因mRNA水平相对表达量较多,该组细胞的成骨功能最强,适合作为组织工程骨的种子细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

人骨形态发生蛋白2基因重组腺病毒表达载体转染兔骨髓间充质干细胞*

背景：采用GatewayTM技术构建腺病毒载体,显著弥补了外源性细胞因子局部应用的缺陷。 目的：观察人骨形态发生蛋白2重组腺病毒表达载体(Ad-BMP-2/GFP)转染兔骨髓间充质干细胞后骨形态发生蛋白2的表达情况。 方法：密度梯度离心联合贴壁培养法,分离、培养、纯化兔骨髓间充质干细胞;GatewayTM技术构建的Ad-BMP-2/GFP腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞。 结果与结论：RT-PCR检测转染诱导后的细胞表达成骨细胞特异性产物骨钙素;转染后兔骨髓间充质干细胞在mRNA水平和蛋白水平均有人骨形态发生蛋白2的表达。结果表明构建的Ad-BMP-2/GFP可高效转染兔骨髓间充质干细胞,骨形态发生蛋白2在细胞中能高效表达。     

端粒酶逆转录酶基因修饰人骨髓间质干细胞的实验研究

目的： 观察外源性hTERT基因的异位表达对人骨髓间质干细胞（MSCs）端粒酶活性及细胞生命周期的影响。方法： 将携带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因和人端粒酶逆转录酶（hTERT）目的基因的质粒pEGFP-hTERT通过脂质体转染法转入人骨髓MSCs中，并用G418筛选法进行抗性克隆的筛选与扩增。通过RT-PCR和PCR-ELISA对转染前后hTERT mRNA的表达情况及其对端粒酶活性的影响进行检测。将转染细胞在EGF和bFGF的联合诱导下向神经元样细胞定向诱导分化，并用RT-PCR进行鉴定。结果： 未转染的人骨髓MSCs hTERT mRNA表达阴性，且端粒酶呈阴性而转染hTERT基因的人骨髓MSCs hTERTmRNA表达阳性，且端粒酶呈阳性。转染hTERT基因的人骨髓MSCs在体外已连续传到第35代，而未转染的人骨髓MSCs传到第20-25代左右已衰老死亡。 转染hTERT基因的人骨髓MSCs经EGF和bFGF的联合诱导后，较多细胞出现了典型的神经元样形态，且经RT-PCR检测表明，神经元特征性蛋白微管相关蛋白（MAP₂）和神经丝亚单位M（NF-M）表达增强。结论： 外源性hTERT基因可以在人骨髓MSCs中获得异位表达，并能诱导人骨髓MSCs的端粒酶活性。外源性hTERT基因的异位表达不仅可以使人骨髓间质干细胞的寿命明显延长而且不影响其维持干细胞的多向分化潜能特性。     

pcDNA3.1/hIL-18真核表达载体的构建及表达

目的 :构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并在哺乳动物细胞COS 7和Rlc310中进行瞬时和稳定性表达。方法 :从含hIL 18基因的中介载体 pGEM TEasy( pGEM T/hIL 18)中 ,以限制性内切酶酶切方法获得目的片段 ,克隆入真核表达质粒 pcDNA3.1( )中。以脂质体法转染COS 7和Rlc310细胞 ,用RT PCR检测IL 18mRNA的水平 ,免疫组化染色法检测蛋白表达。结果 :构建了hIL 18基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并可在哺乳动物细胞中瞬时、稳定表达 ,获得了可稳定表达hIL 18基因的Rlc310细胞株。结论 :pcDNA3.1/IL 18的构建及表达 ,为IL 18抗肿瘤作用的研究奠定了基础