改良分步消化法培养原代软骨细胞

背景：胰蛋白酶和细菌胶原酶结合使用消化关节软骨基质获得大量纯度高的软骨细胞的方法步骤繁琐、过程复杂,容易污染,但更好的简单易行、安全可靠的方法至今少有报道。 目的：采用改良分步消化法进行软骨细胞培养,以获取大量纯净的软骨细胞。 方法：将新西兰白兔6只随机分2组,酶消化法组运用酶消化法分两步获取原代软骨细胞,对照组用传统法进行原代软骨细胞培养。培养1周后观察两组培养的软骨细胞的生长状态,并进行细胞鉴定、计数,评估改良后的方法对细胞的影响。 结果与结论：酶消化法组采用0.2%Ⅱ型胶原酶消化软骨细胞,与对照组相比,可将6 h以上的消化时间缩短至3 h。两组原代软骨细胞培养24 h均多呈圆形,悬浮状态,48 h后贴壁,培养1周后,两组软骨细胞可铺满培养瓶底。结果证实,采用改良分步消化法进行软骨细胞培养,在缩短了消化时间的同时其细胞生长及形态变化均无改变,可以顺利获取大量纯净的软骨细胞。     

小鼠肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定

目的 建立小鼠肾小管上皮细胞(mRTECs)原代培养、传代及鉴定的方法.方法 采用肾小管节段贴块培养法与3种消化培养法(胰蛋白酶、胰蛋白酶 EDTA、胶原酶Ⅰ)进行小鼠肾小管上皮细胞原代培养,锥虫蓝染色后镜下观察消化后细胞成活率、细胞形态和数量.胰蛋白酶消化传代,以免疫细胞化学方法鉴定细胞种类.结果 贴块法和胶原酶Ⅰ消化培养法均能成功培养小鼠肾小管上皮细胞,两者相比,胶原酶Ⅰ消化培养法培养的细胞生长更快.结论 胶原酶Ⅰ消化培养法是小鼠肾小管上皮细胞原代培养的理想方法.     

兔主动脉内皮细胞培养及鉴定:内皮细胞分离方式及培养条件的改良

背景:获取内皮细胞的方法有机械刮取、组织块移植和酶消化法3种。一直以来,内皮细胞的培养方法也在不断的更新。目的:探讨兔主动脉内皮细胞的培养和鉴定方法。方法:取1周龄新西兰大耳白兔主动脉,剥去外膜,内膜面向下铺入2g/LⅠ型胶原酶、2g/LⅢ型胶原酶,2g/LⅣ型胶原酶和2g/LⅤ型胶原酶混合消化液中(按1∶1∶1∶1∶1混合)消化20min,按1∶1加入培养基以终止消化。轻轻刮下内膜层细胞,将细胞悬液离心,用DMEM培养液(含胎牛血清20%、VEGF1μg/L、bFGF2μg/L,庆大霉素6U/L)混匀沉淀细胞,吹打分散至单个细胞培养,48h后用首次换液。再按1∶2分瓶传代培养。采用倒置相差显微镜观察细胞培养结果。免疫组织化学及免疫荧光鉴定Ⅷ因子相关抗原。电镜观察Weibel-Paladed小体。结果与结论:体外获得并培养5代内皮细胞。Ⅷ因子相关抗原及电镜观察W-P小体均证实实验成功的培养了原代及传代内皮细胞。提示兔主动脉内皮细胞可从主动脉获得并通过培养成为细胞系,Ⅷ因子相关抗原及电镜观察W-P小体联合鉴定是确定内皮细胞的良好方法。     

正常人乳腺上皮细胞的原代培养

目的研究正常人乳腺上皮细胞原代培养的可行性,以及激素对其增殖的影响。方法从乳房区段切除术切除组织中获取正常人乳腺组织,用胶原酶溶液消化乳腺组织分离得到较纯净的上皮细胞,用烧灼法结合酶消化法解决细胞纯化问题。细胞形态观察和电镜检测鉴定细胞。结果正常人乳腺上皮细胞的原代培养是可行的。1×10-5的雌二醇和孕酮混合液可以促进细胞增殖。     

乳兔成骨细胞原代培养与鉴定:改良胶原酶与胰酶的分段消化

背景:成骨细胞获取的方法较多,如何简便而迅速的获得高纯度的成骨细胞成为研究的热点。目的:比较组织块法、胶原酶消化法、改良胶原酶和胰酶分段消化法体外培养纯化乳兔颅骨来源的成骨细胞结果及其细胞的生物学特点。方法:取新生24 h内新西兰大白兔乳兔颅盖骨,采用组织块法、胶原酶消化法和改良胶原酶和胰酶分段消化法分离获取兔原代成骨细胞,并进行传代培养。通过倒置显微镜下形态学观察、锥虫蓝排斥法计数活细胞率及MTT法绘制细胞生长曲线、茜素红染色、细胞培养上清液碱性磷酸酶和骨钙素检测、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原免疫组织化学法和RT-PCR检测骨钙素和Ⅰ型胶原mRNA的表达等对成骨细胞进行鉴定。结果与结论:分离培养的成骨细胞均一性好、增殖能力强,具备成骨细胞的典型特征,茜素红染色阳性,Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性,Ⅲ型胶原免疫组织化学染色阴性,细胞培养上清液碱性磷酸酶、骨钙素均有表达,PT-PCR结果有Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素mRNA表达。改良胶原酶和胰酶分段消化法较传统胶原酶消化法有更高的细胞获取率,更好的细胞活性,且比传统胶原酶消化法耗时短(P0.05);组织块法操作方法最为简单,细胞活性最高,但是细胞产出率最低、耗时最长,不适合用于成骨细胞大规模培养。用改良的胶原酶和胰酶分段消化法可获得数量较多且纯度较高的成骨细胞,可以成为一种相对可靠、有效的原代成骨细胞的体外培养方法。     

犬阴道上皮细胞和平滑肌细胞可在体外长期稳定培养

背景：体外分离培养获得足够活性良好的种子细胞是构建阴道组织工程的关键。文献报道阴道上皮细胞体外纯化培养和传代较为困难,尤其是体外长期培养犬等大动物的阴道种子细胞尚未见报道。 目的：建立体外稳定培养犬阴道上皮细胞和平滑肌细胞方法。 方法：获取犬小块阴道组织,机械分离阴道黏膜上皮,Dispase酶和胰蛋白酶分步消化收集上皮细胞,接种于无血清角化细胞培养液中培养和传代;机械分离阴道平滑肌组织后采用Ⅱ型胶原酶消化获得平滑肌细胞,在含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液中连续培养传代。动态观察上皮细胞和平滑肌细胞生长增殖情况,分别采用特异性抗体行细胞免疫化学染色鉴定。 结果与结论：原代培养的上皮细胞24-36 h后开始贴壁铺展,四五天后呈对数生长,七八天可达70%融合,为单一的上皮细胞,呈典型铺路石样,未见成纤维细胞混杂。每四五天可传代1次,连续传代六七次,细胞免疫化学染色角蛋白AEl/AE3抗体阳性。平滑肌细胞原代培养24 h后贴壁呈梭形,此后呈对数生长,4 d后融合呈典型的“峰和谷”样,每三四天可传代1次,连续传代七八次,细胞免疫化学染色示α-肌动蛋白染色阳性。结果证实,犬阴道上皮细胞和平滑肌细胞可在体外长期稳定培养,可为体外构建组织工程化阴道提供足够的种子细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

肺泡Ⅱ型上皮细胞的原代培养及生物学特性比较研究

目的：建立大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ) 的改良体外原代培养法，并对其生物学特性进行比较研究。方法：AECⅡ用胰蛋白酶和胶原酶消化法分离后，接种于大鼠免疫球蛋白G （IgG）包被的培养瓶黏附纯化。将获得的AECⅡ用碱性磷酸酶(AKP) 、电镜和肺表面活性物质相关蛋白A(SPA) 免疫细胞化学方法进行鉴定，并对它的SPA表达和转染特性与AECⅡ来源A549细胞进行比较研究。结果：胰蛋白酶和胶原酶消化加IgG黏附纯化后所得的AEC Ⅱ,产量为2×107-3×107，纯度为75%-84%，细胞活力93％以上，AKP 染色快捷简便。AECⅡ 同A549细胞 相比具有某些不同的特性。结论：采用IgG黏附纯化能提高AECⅡ纯度，AKP 染色简便实用。对于AECⅡ 细胞的某些特性研究发现其并不能完全用A549细胞系来代替。     

人脐带来源间充质干细胞分离培养方法的优化

背景：关于人脐带间充质干细胞的分离培养方法不一,如何提高人脐带来源间充质干细胞获得效率的问题尚未解决。 目的：优选人脐带来源间充质干细胞制备的消化酶组分。 方法：无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带近胎儿段,按不同混合酶浓度比值划分为3组,混合酶Ⅰ组成分为0.4%Ⅱ型胶原酶、0.1%胰酶、0.02%EDTA和0.1%透明质酸酶;混合酶Ⅱ组成分为0.1%Ⅱ型胶原酶、0.4%胰酶、0.02%EDTA和0.1%透明质酸酶;混合酶Ⅲ组成分为0.3%Ⅱ型胶原酶、0.1%胰酶、0.02%EDTA、0.1%透明质酸酶和0.1%DNA酶。每组再按消化时间分为1,2,3 h 3个亚组。最后重悬细胞终体积均定位4 mL并计数,采用含血清的DMEM培养液体外培养细胞。 结果与结论：采用3种不同混合酶浓度进行消化,发现相同消化时间内,混合酶Ⅲ组消化细胞最多(P < 0.05)。在作用3 h时,混合酶Ⅲ组获取的细胞中活细胞比值显著低于混合酶Ⅰ组和混合酶Ⅱ组(P < 0.01)。提示0.3%Ⅱ型胶原酶、0.1%胰酶、0.02%EDTA、0.1%透明质酸酶和0.1%DNA酶混合液消化脐带组织块2 h为获取脐带间充质干细胞的最佳条件。     

改良酶消化联合植块法培养兔骨膜成骨细胞

背景:骨膜成骨细胞具有很强的增殖能力和分化成骨潜能,而且取材方便,但以往常规培养方法时间较长,如何能够缩短培养时间,是骨膜源性成骨细胞成为理想种子细胞的关键之一。目的:应用改良酶消化法培养兔骨膜原代成骨细胞,观察其在喷砂钛片上的黏附及增殖情况。方法:切取雄性日本大耳白兔胫骨近端前内侧面骨膜0.5～1.0cm2:①常规方法:以0.25%胰蛋白酶在37℃消化30min后,用0.1%Ⅰ型胶原酶在37℃消化30min,不断振荡,弃掉胰蛋白酶后植入培养瓶,干涸培养2h,加入含体积分数15%胎牛血清的DMEM完全培养基培养。②改良方法:将Ⅰ型胶原酶消化时间由30min改为1h。碱性磷酸酶染色、钙结节染色鉴定成骨细胞。将原代培养成骨细胞与喷砂钛片联合培养,采用扫描电镜、MTT法检测不同时间点成骨细胞在喷砂处理钛片上的黏附及增殖情况。结果与结论:培养第5天,改良法培养的骨膜成骨细胞从组织块周围爬出,第25天细胞汇聚成单层,细胞呈三角形或多角形;传代培养1个月后,可见细胞成复层生长,并有黑色钙结节生成,具有典型的成骨细胞形态特征,碱性磷酸酶染色、钙结节染色呈阳性。常规法培养的细胞爬满单层时间推迟12d左右。在喷砂处理的钛片表面上成骨细胞立体感强,有伪足伸出,伪足嵌入小的孔洞内,细胞表面有基质分泌。两种方法培养的成骨细胞在钛片表面的黏附及增殖差异无显著性意义。提示改良消化法可明显缩短成骨细胞培养时间,对成骨细胞的黏附及增殖能力无影响。     

人宫颈癌细胞的体外培养及鉴定*

背景：由于肿瘤存在个体差异,对癌株的研究不能准确反映个体之间的差异,原代细胞培养则与体内状态更相近。 目的：体外培养建立宫颈癌细胞原代培养方法。 方法：采用胰蛋白酶及Ⅰ型胶原酶联合消化法从23例新鲜宫颈癌组织获取宫颈癌细胞,测定其细胞生长曲线,并用免疫荧光染色检测细胞表面标记物CD44、CK17进行鉴定。 结果与结论：23例中有21例成功从宫颈癌组织中获取宫颈癌细胞并能连续传代,稳定增殖,免疫荧光染色显示宫颈癌细胞表面标记物CD44、CK17表达呈阳性。说明胰蛋白酶及Ⅰ型胶原酶联合消化法能成功分离原代宫颈癌细胞。 关键词：原代培养;鳞状上皮细胞;宫颈癌;增殖;胰蛋白酶 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.11.014     

Maintenance of normal human breast organoids within rat mammary fat pads in organ culture

Summary Normal human breast organoids, derived by collagenase digestion of reduction mammaplasty tissue specimens, have been cultured in vitro for up to 28 days after injection into organ cultures of virgin rat mammary fat pads. The culture medium was serum-free Waymouth's MB 752/ 1 with hormonal additives. The rat mammary tissue responded well to growth-promoting and lactogenic stimuli in the culture medium, in agreement with previous investigations. Using immunohistochemistry casein was identified in rat epithelia exposed to lactogenic medium. Human organoids in culture remained viable but did not show hormone-responsiveness. Electron microscopy confirmed the presence of both luminal epithelial cells and myoepithelial cells.The serum-free culture of normal human breast organoids in a three-dimensional matrix provides a system in which to study factors controlling growth and differentiation.     

人羊膜上皮细胞体外培养重建角膜上皮的实验研究

目的: 探讨人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells, HAECs)诱导分化为角膜上皮细胞的可塑性及其重建角膜上皮的可行性。方法: 取足月产人羊膜,通过胶原酶、胰蛋白酶和EDTA消化获得HAECs,将细胞在体外培养扩增、传代,将2~3代HAECs接种于去上皮的兔角膜基质上培养,待HAECs融合形成单层后,置于插入式培养皿中进行气液界面培养14 d。对角膜基质上培养的HAECs用光镜、扫描电镜和透射电镜进行形态学及超微结构观察,以及细胞角蛋白(CK)3/12的免疫组织化学检测。结果: HAECs可在角膜基质上生长,培养1~2 d可形成单层,气液界面培养14 d可形成4~5层细胞的复层上皮,扫描电镜观察细胞表面有丰富的微绒毛,透射电镜下可见上皮细胞之间有桥粒连接,免疫组化检测复层细胞表达CK3/12,所形成的复层结构与正常角膜上皮相似。结论: HAECs有可能作为种子细胞用于组织工程角膜上皮重建。     

原代人宫颈癌细胞的培养方法

背景：在体外分离、培养宫颈癌上皮细胞, 从细胞水平及分子水平研究肿瘤病因及治疗的基础,是宫颈癌组织工程研究的最基本环节。 目的：探讨适用于组织工程宫颈癌研究的人宫颈癌原代细胞培养方法以及传代后细胞形态变化、增殖的特性。 方法：0.25%胰蛋白酶和2%Ⅰ型胶原酶联合消化法体外培养宫颈癌原代细胞,荧光倒置显微镜下观察肿瘤细胞形态、体外生长情况,免疫组化法检测体外培养宫颈癌细胞表面标记物CK17和肿瘤细胞增殖抗原Ki67表达。 结果与结论：采用胰蛋白酶与Ⅰ型胶原酶联合消化法体外分离培养人宫颈癌细胞,该法相对简单且重复性较好,所得到的原代细胞纯度较高。经体外传代培养的宫颈癌细胞仍可保持稳定的细胞表型。宫颈癌细胞表面标记物CK17阳性表达,证实细胞为上皮源性,肿瘤细胞增殖抗原Ki67表达阳性提示所培养细胞具有肿瘤细胞恶性增殖的特性。     

人腹膜间皮细胞的改良分离及其鉴

背景：腹膜间皮细胞作为腹膜的重要组分,分泌多种细胞因子,在参与抗炎、免疫调节、腹膜纤维化等方面起着重要作用,如何获得优质、均一的腹膜间皮细胞成为解决这些问题的关键。 目的：拟建立改良的人腹膜间皮细胞消化培养法。 方法：0.1%胶原酶Ⅰ消化腹部大网膜组织,去除红细胞后用含体积分数为10%胎牛血清的1640培养基培养。在培养过程中以倒置显微镜观察细胞形态变化,CCK-8观察培养液对间皮细胞生长的促进作用,透射电子显微镜观察细胞超微结构,激光共聚焦免疫荧光鉴定细胞。 结果与结论：分离培养的细胞为多角形,汇合时呈铺路石样排列,培养细胞的纯度达90%以上;生长良好,迅速,可传代至四五代。透射电子显微镜下见细胞表面大量的微绒毛,免疫荧光显示角蛋白、波形蛋白抗原阳性,白细胞CD45、第Ⅷ因子相关抗原阴性;所有被鉴定特征均符合间皮细胞的特点。结果提示胶原酶Ⅰ消化法是一种简单、高效、重复性高的分离腹膜间皮细胞的方法。     

两种方法分离子宫内膜干细胞的比较

背景：目前国内外尚无统一方法分离培养子宫内膜干细胞,实验重复性较差。 目的：寻找一种方便、高效、科学的体外分离子宫内膜干细胞的方法。 方法：采用混合法(机械和酶消化相结合)及胶原酶Ⅰ法分离子宫内膜干细胞,比较两种方法分离所得活细胞数及细胞生长周期的差异;并采用免疫细胞化学法和RT-PCR法检测CD90和CD117的表达情况。 结果与结论：经过15 d的原代培养后,子宫内膜干细胞形态呈圆梭形,细胞贴壁平铺生长,具有成纤维细胞形态,细胞排列无极性;细胞化学染色及RT-PCR法均检测到干细胞标志物CD90和CD117表达,证明培养的细胞具有干细胞特性。混合法获得的活细胞数多于胶原酶Ⅰ法,其差异有显著性意义 (P < 0.01),两种方法分离所得的细胞具有相同的生长周期。结果说明混合法是一种方便、高效、科学的体外分离子宫内膜干细胞的方法。     

小鼠乳鼠原代心肌细胞的改良培养

背景：大鼠心肌细胞原代培养技术日渐成熟,但小鼠心肌细胞在同样实验条件下不易获得,而小鼠基因组与人类基因组有更多相似之处,具有更高的研究价值。目的：改进小鼠乳鼠原代心肌细胞的培养方法,得到纯度高、活力强、保持心肌细胞原有结构和功能的心肌细胞。方法：将小鼠心肌组织利用酶消方法分离为单个的心肌细胞,实验步骤中将经典的胰酶、胶原蛋白酶混合酶消法分解开,先用胰酶消化心肌组织,使心肌组织变得松散,再用胶原蛋白酶,作用于细胞间质的胶原纤维,使心肌组织分离为单个的心肌细胞。调整胰酶和Ⅱ型胶原蛋白酶的浓度和作用时间,严格控制试剂pH值和各步骤的温度。结果与结论：心肌细胞在接种24 h后开始贴壁,48 h后可观察到部分心肌细胞出现自主搏动,72 h后彼此形成交联,96 h后可观察到心肌细胞形成细胞簇,并出现一致性搏动。心肌细胞的存活率和纯度均达95%以上。结果证实,实验采用改良方法成功培养出小鼠乳鼠心肌细胞,并且保留心肌细胞的结构和功能,纯度和成活率高,是可行的培养方法。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程     

纤维蛋白胶为载体构建人羊膜上皮细胞植片的实验研究

目的： 探讨利用纤维蛋白胶作为支架构建组织工程人羊膜上皮细胞(HAECs)植片重建眼表的可行性。方法：取足月剖宫产胎盘羊膜,经胶原酶和胰蛋白酶消化后,获得HAECs。在体外构建的纤维蛋白胶片上培养HAECs，细胞融合成片后，利用气液界面复层化，采用倒置显微镜、组织切片、HE 染色、细胞角蛋白免疫组织化学染色和扫描电子显微镜观察HAECs的生长情况。结果：HAECs在纤维蛋白胶表面生长良好，细胞呈圆形或多角形,长满后呈上皮细胞特有的铺路石样外观，扫描电镜观察细胞表面有丰富的微绒毛，细胞广谱角蛋白单克隆抗体染色阳性。细胞有复层生长趋势，植片较为透明。结论：以纤维蛋白胶为载体构建组织工程人 HAECs 植片，具有眼表重建的潜在运用价值。     

预损伤与改良传代体外培养许旺细胞的比较

背景：通过组织工程方法构建神经桥接体修复神经损伤,需要大量纯化体外培养的许旺细胞。 目的：对比观察预损伤法和改良传代法获取许旺细胞的纯度与质量。 方法：①预损伤法：预损伤SD乳鼠坐骨神经,3 d后取出坐骨神经,分离神经外膜,用胰酶、胶原酶消化,差速贴壁除去成纤维细胞,接种培养。②改良传代法：直接获取SD乳鼠坐骨神经,分离神经外膜,运用双酶消化法结合单酶消化法进行许旺细胞原代培养,5~7 d后采用单酶快速消化离心法行传代培养,同时纯化许旺细胞。 结果与结论：预损伤法和改良传代法体外培养的许旺细胞纯度均达95%以上,两种方法获得的许旺细胞纯度差异无显著性意义(P > 0.05)。两种方法获取的许旺细胞形态正常,数量及纯度高,增殖旺盛,说明预损伤法和改良传代法都是体外获取高质量与高纯度许旺细胞的理想方法。