Beclin1基因siRNA慢病毒载体构建和鉴定

本研究通过慢病毒载体(pRNAT-U6.2/Lenti)构建靶向Beclin1基因的RNA干扰(RNAi)重组体,用以建立Beclin1基因稳定沉默的非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞株。PCR鉴定结果显示3个扩增的阳性片段均已插入pRNAT-U6.2/Lenti载体;测序结果证明3个重组慢病毒载体pRNAT-U6.2/Lenti-si356、pRNAT-U6.2/Lenti-si423和pRNAT-U6.2/Lenti-si684的插入序列完全正确;重组慢病毒载体感染A549细胞后,RT-PCR和Westernblot检测结果均证实3组重组体感染的细胞内Beclin1mRNA和蛋白表达都受到不同程度的抑制,Beclin1mRNA的沉默效率分别为35.56%、89.22%和66.78%。结果显示成功构建了Beclin1基因的RNAi病毒重组载体,并建立了其稳定表达的NSCLC A549细胞株,为探讨Beclin1基因对NSCLCA549细胞生物学行为的影响提供了新的细胞模型。     

细胞因子信号转导抑制因子1 RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定*☆

背景：以往关于细胞因子信号转导抑制因子1的研究多用脂质体或其他载体转染的技术,但存在效率低和安全性差等问题。 目的：构建细胞因子信号转导抑制因子1 RNA干扰慢病毒载体并进行鉴定。 方法：实验设计3组针对细胞因子信号转导抑制因子1的短发夹RNA序列,应用基因重组技术插入pPll3.7载体,测序正确的重组病毒质粒与包装质粒通过共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,感染A549细胞,western blot检测目的蛋白细胞因子信号转导抑制因子1在靶细胞中的表达。 结果与结论：实验通过对重组载体进行测序分析证实短发夹RNA插入慢病毒载体,慢病毒载体上清成功转染A549细胞后western blot检测结果显示该载体抑制了细胞因子信号转导抑制因子1蛋白在A549细胞有表达。说明实验成功构建了细胞因子信号转导抑制因子1 RNA干扰慢病毒载体。 关键词：细胞因子信号转导抑制因子1;慢病毒载体;RNA干扰;A549细胞;组织构建 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.07.030     

LMP1基因重组慢病毒载体的构建及表达性能鉴定

为了进一步探讨EB（Epstein Barr）病毒潜伏膜蛋白1（LMP1）的作用机制及其功能，我们构建了EDL2-N-LMP-慢病毒载体，并对所构建的EDL2-N-LMP-慢病毒载体结构及表达进行鉴定。     

金黄色葡萄球菌肠毒素C3 过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建金黄色葡萄球菌肠毒素C3(SEC3)过表达慢病毒载体并体外检测其表达目的基因。方法:聚合酶链反应(PCR)扩增SEC3 基因片段;用AgeI 酶切线性化GV365 慢病毒载体,通过连接反应构建GV365-SEC3 载体,运用PCR方法鉴定阳性克隆载体;转染293T 细胞包装慢病毒,观察细胞荧光及Western blot 检测慢病毒载体表达,HIV-1 p24 ELISA 法测定慢病毒载体滴度。结果:获得目的基因,并成功构建GV365-SEC3 慢病毒载体,通过PCR 及DNA 测序鉴定,证明GV365-SEC3 质粒构建正确;转染293T 细胞后可观察到大量荧光细胞,经蛋白电泳得到29 kD 大小的蛋白条带,与目的基因蛋白相符合,ELISA 检测病毒载体滴度为5 108 TU/ ml。结论:成功构建GV365鄄SEC3 过表达慢病毒载体,为后期研究其体内外对抗肿瘤的作用与机制奠定基础。     

HIV-1包膜蛋白ENV慢病毒载体的构建及表达

目的:构建表达HIV-1包膜蛋白ENV的慢病毒载体,感染人胚肾细胞HEK293T,观察env基因在HEK293T中的表达。方法:通过点突变获得HIV-1 env完整基因,将env基因亚克隆至慢病毒穿梭载体pLVX-IRES-ZsGreen1的EcoRⅠ、XhoⅠ位点,构建重组质粒pLV-env,采用脂质体转染法转染HEK293T,经RT-PCR、Western blot检测目的基因表达,同时利用激光共聚焦技术对env基因的表达进行了定位。结果:成功获得了HIV-1 env基因,构建了重组慢病毒质粒pLV-env,RT-PCR、Western blot检测均表明外源基因能够表达,并具有抗原性,同时env基因表达后可以分泌到细胞膜表面膜上。结论:成功构建了含有HIV-1包膜蛋白env基因的重组慢病毒质粒,并验证了其表达,为下一步慢病毒的包装以及细胞模型和动物模型的构建奠定了基础。     

人PRMT1真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建人PRMT1基因真核表达载体,并进行表达检测及鉴定。方法:采用RT-PCR技术扩增人PRMT1全长cDNA;经过双酶切、连接等反应,构建pcDNA3.1(+)-PRMT1真核表达载体,并转化DH5α感受态细胞;用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆;经菌液PCR及测序鉴定重组质粒;瞬时转染A549细胞,采用实时定量PCR检测重组质粒的表达水平及PRMT1对eotaxin-1和ccr-3表达的影响。通过Western blot从蛋白水平检测重组质粒在真核细胞内的表达。结果:RT-PCR扩增的人PRMT1全长cDNA为1136 bp;所筛选出的pcDNA3.1(+)-PRMT1重组载体中插入片段与NCBI GenBank文库中人PRMT1 cDNA的序列完全一致;实时定量PCR和Western blot检测证实重组质粒在A549细胞内可高效表达;并且PRMT1与eotaxin-1和ccr-3的表达呈正相关性。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-PRMT1重组载体,为进一步研究PRMT1基因的作用机制奠定基础。     

大鼠CD86基因RNAi慢病毒载体的构建与功能鉴定

目的 构建大鼠CD86基因的RNAi慢病毒载体并在大鼠原代培养树突状细胞(DC)上鉴定其基因沉默效率.方法 将筛选获得的大鼠CD86基因特异性siRNA靶点,合成短发卡结构shRNA序列并退火成双链DNA,与pgC-GFP慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆.经由293T细胞包装shRNA慢病毒颗粒,随后将其感染原代培养的大鼠Dc细胞,采用real-time PCR和Western blot的方法检测靶基因在mRNA和蛋白水平的沉默效率.结果 构建的慢病毒载体shRNA的PcR鉴定和测序正确,shRNA慢病毒颗粒感染大鼠DC细胞后CD86基因的mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组下降了90.6%;蛋白表达显著抑制.结论 成功构建了大鼠CD86基因的shRNA慢病毒表达载体,能够在大鼠DC细胞上有效沉默靶基因.     

人microRNA-146a慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建针对has-miR-146a的慢病毒表达载体,并鉴定成熟has-miR-146a在细胞内表达水平。方法PCR扩增pri-miR-146a,克隆于慢病毒载体plenti-GFP中,转染293FT细胞,收获并浓缩慢病毒颗粒,感染Jurkat细胞。结果成功构建了has-miR-146a的慢病毒表达载体,建立了高效转染系统。结论建立了高效稳定表达has-miR-146a的慢病毒转染系统。     

SDF-1慢病毒表达载体的构建和鉴定

基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF-1)主要由骨髓基质细胞合成和分泌,是骨髓造血微环境的重要组成部分,在造血干细胞动员、归巢、定植和增殖中发挥重要作用,同时,可单独或协同G-CSF、TPO等细胞因子通过细胞内信号系统增强维持造血干细胞的功能,与自体外周干细胞移植后造血恢复密切相关[1].     

人BclGL基因慢病毒表达载体构建及其对T淋巴细胞凋亡的影响

目的 构建针对人BclGL的慢病毒表达载体,检测其对Jurkat T淋巴细胞系凋亡的影响,为进一步研究BclGL在细胞内信号转导及分子功能奠定基础.方法 RT-PCR方法扩增人全长BclGL基因,克隆于pGrP-N1质粒中构建BclGL绿色荧光蛋白融合基因(BclGL-GFP),将融合基因克隆于慢病毒载体FUGW并转染293FT细胞包装浓缩慢病毒颗粒.将浓缩慢病毒感染Jurkat细胞,同时设立PBS对照及FUGW病毒阴性对照组,流式细胞术及荧光定量PCR鉴定BclGL在Jurkat细胞中的表达,Annexin V-APC/PI双染检测细胞凋亡变化.结果 酶切及测序证实人BclGL慢病毒表达载体构建成功,转染Jurkat细胞72 h后Jurkat细胞凋亡明显增加.结论成功构建了高效稳定表达人BclGL的重组慢病毒转染系统,并证实其对Jurkat淋巴细胞的促凋亡效应,为进一步探讨BclGL的生物学功能奠定了基础.     

小鼠survivin基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

背景：间充质干细胞体内有限的存活能力严重制约其用于体内治疗方面的应用,因此寻找一种能延长存活能力的实验方法是间充质干细胞进行体内实验的重要前提。 目的：应用pLV.Des3d.P/hygro构建小鼠survivin基因的慢病毒表达载体。 方法：采用Oligo核酸软件对Genbank上所发表的小鼠survivin mRNA序列进行分析,设计一对survivin基因上下游引物,利用Gateway 克隆方法,分别在其两端添加attB重组位点,运用PCR扩增mSurvivin和IRES/EmGFP,将PCR产物进行BP反应然后转化到Stbl3感受态菌,通过卡那霉素抗性筛选、PCR鉴定,选取鉴定正确的pDown-mSurvivin和pTail-IRES/EmGFP克隆测序。将pDown-mSurvivin和pTail-IRES/EmGFP与pLV.Des3d.P/hygro混合进行LR反应,构建慢病毒载体pLV.EX3d.P/hygro-EF1A>mSurvivin>IRES/EmGFP,再次进行PCR、测序的鉴定。 结果与结论：显示基因序列克隆正确,成功构建了含有小鼠survivin基因的重组慢病毒表达载体。说明慢病毒表达载体pLV.EX3d.P/hygro-EF1A>mSurvivin>IRES/EmGFP构建成功,为下一步研究survivin在间充质干细胞中抗凋亡作用奠定基础。     

靶向TPX2基因shRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建靶向TPX2基因的RNA干扰慢病毒载体,获得稳定感染的人宫颈癌He La细胞株,为宫颈癌细胞TPX2基因的相关研究奠定基础。方法以TPX2基因为靶点,设计并合成四组对应于目标shRNA的双链DNA发卡结构,分别与慢病毒载体Pglv2-U6-Puro连接经转化感受态细胞,阳性克隆经测序、病毒包装、滴度测定、感染细胞、嘌呤霉素筛选得到TPX2基因沉默稳转细胞株。实时荧光定量PCR和Western blot检测TPX2 mRNA和蛋白的沉默效果。流式细胞计量术检测其对细胞周期分布及凋亡的影响。结果测序结果证实5种慢病毒载体均包装成功,采用0.4μg/m L嘌呤霉素成功筛选出TPX2沉默细胞株。He La细胞感染4种载有TPX2-shRNA的重组慢病毒后,均发挥了沉默效应,尤以TPX2-shRNA-1沉默效果最佳,TPX2 mRNA相对表达量为0.21±0.07,低于对照组的1.08±0.07(P0.01);TPX2蛋白质相对表达量为0.19±0.28,低于对照组的0.64±0.03(P0.01);G2及S期细胞高于对照组(P0.05);细胞凋亡率明显多于对照组(P0.05)。结论获得了一种有效TPX2基因的干扰序列,成功构建了TPX2 shRNA慢病毒干扰载体,并筛选出TPX2基因沉默的He La细胞株,为进一步研究TPX2基因在宫颈癌中的作用奠定了基础。     

NSBP1基因干扰RNA慢病毒载体的构建及效应检测

目的 构建和鉴定NSBP1基因RNA干扰慢病毒表达载体。 方法 针对NSBP1 mRNA设计了3条siRNA,并构建pGCSIL-GFP-NSBP1慢病毒质粒,测序鉴定。用pGCSIL-GFP-NSBP1 、pHelper1.0和 pHelper2.0质粒共转染293T细胞包装产生慢病毒,测定病毒滴度。将慢病毒转染前列腺癌DU145细胞,Western-blot检测NSBP1表达, MTT法检测细胞生长活性,用转染细胞种植裸鼠成瘤,观察抑瘤效果。结果 PCR和测序证实,成功构建LV-shNSBP1的慢病毒载体,病毒滴度达2×108TU/ml。转染细胞中NSBP1蛋白表达显著降低,且MTT检测细胞生长活性明显减慢,转染细胞在裸鼠体内成瘤率没有影响,但对肿瘤的生长有明显抑制作用。结论 人NSBP1基因RNA干扰慢病毒载体的成功构建,且NSBP1对前列腺癌激素非依赖DU145细胞的生长具有重要作用。     

Slug基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建Slug基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体。方法针对人Slug基因的序列,设计出RNA干扰的靶序列,合成靶序列Oligo DNA,退火形成双链DNA,通过Age I和EcoR I酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生shRNA慢病毒载体,质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆并用插入鉴定引物进行PCR鉴定阳性克隆并测序,同时应用Real-time PCR和Western blot方法检测HCT116结肠癌细胞中Slug基因mRNA和蛋白的表达情况。结果 PCR鉴定与DNA测序证实合成的含Slug shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。Western blot证实Slug RNAi慢病毒载体能够抑制Slug的表达。结论成功构建Slug基因RNAi慢病毒表达载体,为后续感染结肠癌细胞,为探索在结直肠癌发生和发展中的作用奠定基础。     

人神经菌毛素-1基因shRNA慢病毒载体的构建

目的:构建并鉴定靶向人神经菌毛素-1(NRP-1)基因的小发卡RNA的慢病毒载体.方法:针对NRP-1mRNA设计了4条shRNA,并构建pGCSIL-RFP-shNRP1慢病毒质粒,PCR扩增阳性克隆并测序鉴定.用pGCSIL-RFP-shNRP1、pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞包装产生慢病毒,测定病毒滴度.将慢病毒干扰RNA及含有NRP-1过表达载体共转染293T细胞,Western blot法检测Flag表达,观察NRP-1蛋白相对表达抑制效果.结果:PCR和测序结果与设计的干扰序列一致,病毒滴度达1×109 Tu/mL.转染细胞中NRP-1蛋白相对表达显著降低.结论:成功构建了高效率的人NRP-1基因shRNA慢病毒载体.     

小鼠BTLA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠BTLA慢病毒表达载体,并对表达产物进行鉴定.方法 以pET-28a-mBTLA质粒为模板,通过PCR技术构建pMD18-T-mBTLA质粒,将小鼠BTLA基因全长编码序列克隆到慢病毒转移载体,通过脂质体转染293T细胞包装成小鼠BTLA慢病毒颗粒.PCR技术和基因测序对重组质粒进行鉴定.荧光显微镜观察重组慢病毒感染293T细胞形态学变化.RT-PCR和Western blot法鉴定BTLA在重组慢病毒感染293T细胞中的表达.50％组织培养感染剂量法(TCID5o法)检测重组慢病毒滴度.结果 成功构建的pMD18-T-mBTLA质粒和pSL6-mBTLA质粒,经双酶切电泳后均出现大小约为1 kb的条带与mBTLA编码序列的大小相符.基因测序并比对分析进一步证实mBTLA编码序列成功整合到质粒载体.病毒上清PCR扩增和293T细胞形态学观察证实Lenti-mBTLA慢病毒包装成功.TCID50法测定Lenti-mBTLA慢病毒滴度为1.3×108 pfu/mL.RT-PCR和Western blot法证实Lenti-mBTLA慢病毒能有效表达mBTLA mRNA和蛋白质.结论 成功构建了表达小鼠BTLA的慢病毒.     

大鼠硫酸软骨素蛋白多糖基因shRNA慢病毒载体的构建及干扰效率鉴定

背景：最近研究发现硫酸软骨素蛋白多糖(NG2)在中枢神经系统中参与多种生理病理功能,慢病毒载体可感染分裂期细胞或非分裂期的细胞,并能在细胞内高效稳定的表达。 目的：构建大鼠源性NG2基因shRNA慢病毒载体并检测其干扰效率。 方法：选择大鼠NG2基因RNA干扰的靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与Hpa Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生pLV-NG2-RNAi,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。将重组载体与pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体通过lipofectamineTM 2000共转染293T细胞包装产生慢病毒LV-NG2-RNAi,收集病毒上清并浓缩。采用孔稀释滴度测定法计算病毒滴度。将LV-NG2-RNAi慢病毒感染C6细胞,于感染后96 h提取细胞总蛋白,采用Western blot检测NG2的表达。 结果与结论：经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目的序列一致,实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体LV-NG2-RNAi。包装浓缩慢病毒的滴度为8×1011 TU/L。Western blot检测显示在感染复数为50时,感染LV-NG2-RNAi慢病毒的C6细胞较感染对照慢病毒及未感染细胞NG2的表达明显降低,干扰效率可达100%(P < 0.05)。结果证实了实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体,且该载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

携eGFP及表达人gp100-TCR基因的慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建携eGFP的人gp100-TCR基因慢病毒表达载体。方法应用基因重组手段,从pGCsamgp100APB质粒上扩增出人gp100-TCR片段,将其插入到pLentiLox3.7(pLL3.7)慢病毒表达载体中,同时将其U6启动子替换为EF-1a启动子,形成慢病毒表达载体pLL3.7-gp100TCR-pEf-1a。将其与包装质粒混合,采用磷酸钙转染法转染293FT细胞,包装产生慢病毒,荧光显微镜观察GFP蛋白的表达水平。检测病毒滴度。结果 PCR、酶切及测序表明慢病毒表达载体pLL3.7-gp100TCR-pEf-1a构建成功。转染后的293FT细胞在荧光显微镜观察可见强绿色荧光,形成的慢病毒可感染293FT细胞,包装的慢病毒浓缩后滴度为4.5×106 TU/ml。结论成功构建eGFP和gp100-TCR共同表达的慢病毒表达载体,为gp100-TCR在肿瘤治疗中的功能研究提供了有效平台。