不同组织冻存体系对牙周膜干细胞体外扩增的影响

背景：冻存是保证干细胞移植治疗的关键步骤之一。传统的冻存是将细胞直接置于冻存液中进行保存,然而冻存液中二甲基亚砜虽能减少细胞复苏过程中冰晶对细胞膜产生的机械性损伤,但同时又对细胞具有毒性作用,直接影响细胞生存状态,不利于临床移植治疗。 目的：寻找适宜牙周膜干细胞体外扩增的牙周周组织冻存的最佳方案。 方法：收集健康人牙,刮取牙周组织后将其平均分为3等份,随机分为新鲜组、5%二甲基亚砜组和10%二甲基亚砜组,后2组分别以体积分数5%和10%二甲基亚砜添加冻存1个月后提取牙周膜干细胞。新鲜组直接提取牙周膜干细胞。 结果与结论：5%二甲基亚砜组原代细胞游出组织团块所需时间和细胞收获量虽不及新鲜培养组,但却明显优于10%二甲基亚砜组(P < 0.05)。新鲜组、5%二甲基亚砜组和10%二甲基亚砜组第1代牙周膜干细胞克隆形成率、活细胞比率、第3代牙周膜干细胞BrdU细胞增殖能力、MTT细胞生长曲线和牙周膜干细胞表面标志物表达差异没有显著性意义(P > 0.05)。提示5%二甲基亚砜添加冻存体系不仅能比10%二甲基亚砜添加的普通冻存体系明显缩短牙周膜干细胞体外扩增所需时间,增加细胞收获量同时还能保持细胞基本生物学特性,降低二甲基亚砜的总体用量和其在反复冻存复苏细胞过程中对细胞造成的直接损伤,为未来更加安全的实施临床移植治疗提供了保障,是供体组织储存新的选择。     

-80℃冰箱直接冻存对细胞因子诱导的杀伤细胞杀伤活性的影响

目的:研究-80℃冰箱直接冻存对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)杀伤活性的影响。方法采用非程序降温方法-80℃冰箱冻存CIK,于冻存后6、12、18周复苏,通过LDH释放法分别测定其对K562细胞的杀伤活性,与新鲜未经冻存的CIK的杀伤活性进行比较。结果:未冻存的CIK在培养至第11天时,有较多贴壁成团细胞,而冻存后复苏培养的CIK贴壁成团细胞较少。比较各组细胞杀伤活性,冻存6、12周后复苏的CIK与未冻存的CIK,对K562细胞的杀伤活性无显著性差异(P>0.05),冻存18周后复苏的CIK的杀伤活性与未冻存的CIK对K562细胞的杀伤活性有显著性差异(P<0.05)。结论:采用-80℃冰箱直接冻存CIK,在12周内复苏应用于临床治疗较好。     

不同冷冻保护剂对低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响

背景：非程序降温-80 ℃低温冰箱保存方便快捷,程序降温-196 ℃液氮保存可靠长久,将两者合二为一简化流程已成功用于临床。 目的：观察不同冷冻保护剂对-80 ℃低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响。 方法：分设10%二甲亚砜组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉组、5%二甲亚砜联合0.25 mol/L海藻糖组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉及0.25 mol/L海藻糖组。采用  -80 ℃低温冰箱转液氮阶梯降温法对单采外周造血干细胞进行冷冻保存,通过透射电镜观察细胞超微结构变化,流式细胞仪观察Annexin-V、PI、Caspase-3水平。 结果与结论：4组冷冻保存细胞的存活率、凋亡率和死亡率差异均无显著性意义(P > 0.05)。透射电镜下各组细胞超微结构变化差异不明显。单个核细胞群落冷冻保存后存活率在90%以上,含成熟细胞较多的CD45⁺细胞群落凋亡发生率可达50%左右。造血干祖细胞群落中,早期细胞较晚期细胞更能耐受冷冻损伤。提示在基础冷冻保护剂二甲亚砜的基础上,加入羟乙基淀粉和海藻糖并未显示出对冷冻保存效果的增强作用。     

经冻存的APA微囊牛肾上腺髓质细胞功能研究

目的观察海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(alginate-polylysine-alginate,APA)微囊牛肾上腺髓质细胞经液氮冻存前后的微囊形态、细胞活性和儿茶酚胺分泌功能变化。方法APA微囊牛肾上腺髓质细胞(牛嗜铬细胞,bevine chromaffin cell,BCC)的冻存以DMSO为保护剂,冻存采取循序缓慢降温,复苏采取快速复温。通过微囊形态、细胞活性和儿茶酚胺分泌量检测观察细胞功能变化。结果与冻存前相比,冻存复苏后的APA微囊BCC形态及细胞活性无明显变化,儿茶酚胺分泌量约为冻存前的80%。结论经冻存复苏的APA微囊BCC仍然保持了较好的形态、细胞活性和儿茶酚胺分泌功能。     

超低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存造血干细胞的比较

背景：在造血干细胞整个冷冻保存过程中,受到降温速率、储存温度深浅、冷冻保护剂组合等因素影响,各国学者在提倡选择何种保存方法上面存在不同的主张。 目的：比较-80 ℃低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存外周造血干细胞的效果。 方法：将采集的造血干细胞分两组,第一组细胞浓度为1×10¹¹ L^-1,加入10%二甲基亚砜,放入程序冷冻仪内程序设置为室温至-4 ℃按1 ℃/min的速率降温,按35 ℃/min快速降至-45 ℃,再以15 ℃/min升至-21 ℃,然后以5 ℃/min降至-90 ℃,取出冷冻管置-196 ℃液氮罐内。第二组细胞浓度为1×10¹¹ L^-1,加入5%二甲基亚砜、3%羟乙基淀粉、4%人血白蛋白,将冷冻管置-80 ℃冰箱过夜后取出,置-196 ℃液氮罐内的气相,再过夜后置液氮罐液相内。 结果与结论：两组冷冻方法保存细胞的锥虫蓝拒染率、回收率、凋亡率和死亡率差异无显著性意义(P > 0.05)。结果显示用5%二甲基亚砜、4%白蛋白、3%羟乙基淀粉组成的冷冻保护剂,通过-80 ℃低温冰箱转液氮阶梯降温法冷冻保存造血干细胞与传统10%二甲基亚砜作为冷冻保护剂用程序降温的方法取得一样效果,操作简便易于临床应用。     

人胎脑神经干细胞来源少突胶质前体细胞冻存方法的优化

目的通过改变不同因素条件优化人胎脑神经干细胞来源的少突胶质前体细胞(OPC)冻存方法,进一步提高复苏活率。方法比较使用消化和机械吹打两种方法收集人OPC,采用人多能干细胞(hPSC)无血清冻存液、含930 mL/L胎牛血清(FBS)和70 mL/L二甲基亚砜(DMSO)的冻存液分别冻存细胞,比较两组冻存前后活率。择优后比较4种不同冻存液(含70 mL/L DMSO和930 mL/L FBS的冻存液,含70 mL/L DMSO、 300 mL/L FBS的OPC完全培养基,含70 mL/L DMSO、 300 mL/L FBS、 0.2 mol/mL海藻糖的OPC完全培养基,含70 mL/L DMSO、 100 mL/L FBS、 300 mL/L羟乙基淀粉溶液的OPC完全培养基)、冻存速率(冻存盒慢速降温和液氮气相快速降温)及冷冻保存时间3个因素对复苏活率的影响。在优选后的冻存方案基础上,复苏后7 d,使用免疫荧光细胞化学染色法比较OPC特异性标志物血小板源性生长因子受体α(PDGFRα)、 ST8α-N-乙酰神经酰胺α2, 8-唾液酸转移酶1(ST8SIA1/A2B5)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4/NG2)、增殖相关KI-67抗原(ki67)表达。结果消化组收集细胞,冻存前后活率明显高于机械组;快速降温4组复苏活率均低于30%且无法继续培养,慢速降温4组复苏活率均较高。使用消化法收集细胞,冻存细胞数为2×10~6/mL;使用含海藻糖的冻存液,慢速降温冻存,复苏活率最高;可达(75.73±6.66)%。与对照组相比,复苏后培养组增殖倍数、 ki67表达无明显差异,两组均表达PDGFRα、 A2B5、 NG2。短期和长期储存组复苏活率无明显差别。结论消化液收集OPC,使用含海藻糖的冻存液慢冻快融的方法,适用于人胎脑神经干细胞诱导OPC冷冻保存,复苏后不影响细胞增殖和标志物表达,储存时间对复苏活率无影响。     

传统及改良纱布包裹冻存法对人血管内皮细胞保护的比较*

背景：传统的细胞冻存多采用4,-20 ℃放置的阶梯式降温方法,程序复杂且浪费时间。 目的：比较传统法与改良冻存法对血管内皮细胞的保护效果。 方法：将常规培养的人血管内皮细胞用胰酶消化后,用配置好的冻存液(10%二甲基亚砜、体积分数60%胎牛血清、30%DMEM无血清培养基)调整浓度,将细胞悬液吸入冻存管,分组干预：实验组以纱布包裹,并直接投入-80 ℃冰箱;对照组按常规冻存法,4 ℃冰箱和-20 ℃冰箱分别预冷30 min和1 h后放入-80 ℃冰箱。1个月后快速复苏冻存细胞。 结果与结论：复苏后实验组细胞存活率及生长曲线与对照组比较差异无显著性意义;复苏后实验组细胞贴壁率、形态学变化及增殖能力明显优于对照组。说明改良的纱布包裹法优于传统的细胞冻存法,且更加方便快捷。     

海藻糖保护同种带瓣大动脉的最适浓度

背景：目前液氮低温保护组织和器官技术已经非常成熟,但其保护剂一直以来争论不一。 目的：观察不同冷冻保护剂对液氮深低温冻存同种带瓣大动脉组织细胞凋亡和代谢的影响,寻求最佳的冷冻保护剂及冷冻保护剂的最适浓度。 方法：取新西兰大白兔带瓣主动脉、肺动脉标本,将其在液氮中冻存12,15,18个月,冻存液分别使用0.1 mol/L二甲基亚砜,0.1 mol/L海藻糖,0.1 mol/L海藻糖+0.1 mol/L二甲基亚砜,0.2 mol/L海藻糖+0.1 mol/L二甲基亚砜,0.3 mol/L海藻      糖+0.1 mol/L二甲基亚砜。标本复温后,免疫组织化学方法检测标本的细胞凋亡情况,葡萄糖消耗量测定法检测组织细胞的代谢水平。 结果与结论：免疫组织化学和葡萄糖消耗量测定结果均显示经0.1 mol/L海藻糖+0.1 mol/L二甲基亚砜,0.2 mol/L海藻糖+  0.1 mol/L二甲基亚砜冻存液处理的标本冻存效果最好,其次是经0.3 mol/L海藻糖+0.1 mol/L二甲基亚砜处理和经0.1 mol/L海藻糖单独处理的标本,单独使用0.1 mol/L二甲基亚砜处理的标本冻存效果最差。说明海藻糖对液氮深低温保存同种带瓣大动脉活性有很好的保护作用,单独使用海藻糖优于单独使用二甲基亚砜,联合应用海藻糖和二甲基亚砜效果更好,且联合应用的海藻糖最佳浓度范围是0.10~0.20 mol/L。     

组织工程化肌腱种子细胞深低温保存的实验研究

对肌腱种子细胞进行深低温保存，研究保存过程中多个环节的影响因索对细胞存活率的影响及深低温保存对种子细胞生物学特性、胶原分泌功能的影响。实验结果表明二甲基亚砜是肌腱种子细胞深低温保存中比较好的抗冻保护剂；冻存后使用与培养时不同的营养血清处理对细胞有损害，可降低细胞存活率；在冷冻保存过程中，细胞存活率与细胞浓度有一定关系，浓度太低可能降低细胞存活率；细胞在冷冻保存时，降温速度对细胞存活率有影响，慢速的分步降温组细胞存活率明显高于直接人液氮的快速降温组；采用10％二甲基亚砜加15%小牛血清加75% DMEM配方保存肌腱种子细胞，对其分泌胶原功能无明显影响，对其生长曲线、细胞周期及染色体众数无明显改变，适于肌腱种子细胞的保存。     

两种不同纯度的嗅鞘细胞在体外存活与生长的比较

比较80%和50%两种纯度的嗅鞘细胞在体外培养条件下的存活与生长,为嗅鞘细胞体内移植选用最佳纯度提供依据。分离、培养并纯化成年SD大鼠嗅鞘细胞,将纯化的嗅鞘细胞和收集到的贴壁成纤维细胞进行约80%和50%的比例混合后接种,继续培养1d或3d。所有细胞于不同时间点行P75免疫细胞化学荧光染色,以鉴定嗅鞘细胞的初始及其后培养过程中数量和纯度的变化。观察细胞状态,计数细胞总数和P75免疫阳性细胞数目,求得各组嗅鞘细胞数量和纯度并行统计学分析。结果显示:两种不同纯度嗅鞘细胞在培养1d时形态正常,3d时纯度为50%的嗅鞘细胞胞体依然饱满,突起更加纤长,数量和纯度亦无明显下降。而纯度为80%的嗅鞘细胞在培养3d时已出现胞体萎缩和突起变短,数量从1d时每一观察区域内的35±13显著下降为23±5(P=0.02),但纯度未发生明显变化。结果表明50%纯度嗅鞘细胞的存活及生长状态优于80%者,提示细胞体内移植时应考虑选取50%纯度的嗅鞘细胞。     

pH对体外培养成年大鼠嗅鞘细胞存活的影响

为了研究不同pH培养环境对体外培养大鼠嗅鞘细胞(OECs)存活的影响,本研究采用成年大鼠嗅球培养OECs,培养第8d用S-100免疫组化鉴定纯度后,改用不同pH值(6.8,7.0,7.4,7.8)的DF12培养液继续,在相差显微镜下观察OECs的形态学变化。在不同pH条件下继续培养第3d时采用MTT方法检测不同pH环境中的细胞活力,并用碘化丙啶(PI)和Ho-echst33342荧光双重染色观察细胞死亡率。结果显示:大鼠OECs纯度为(70±4)%;pH7.4组OECs生长旺盛,pH6.8组及pH7.0组OECs生长增殖受到不同程度的抑制,出现死亡细胞;pH7.8组OECs广泛死亡;MTT试验表明,pH7.4组的OD值显著高于其他各pH组。PI/Hoechst33342双重荧光染色显示,在pH6.8、pH7.0和pH7.8组死亡OECs的百分比分别为(27.6±7.8)%、(31.7±7.2)%和(62.3±5.6)%。在pH7.4组未见到死亡的OECs。研究结果表明OECs对酸、碱性环境改变均较敏感,尤其是碱性环境。     

嗅鞘细胞的分离纯化及上清液中神经营养因子的测定

目的:创建理想的纯化嗅鞘细胞(OECs)的方法,并观察不同时间段OECs上清液中神经营养因子的含量,为选择OECs移植的最佳时机提供理论依据。方法:采用差速贴壁法结合免疫亲和吸附法纯化培养OECs,采用荧光染色法鉴定OECs并进行纯度测定;采用ELISA法检测培养上清液中神经生长因子(NGF),脑源性神经营养因子(BDNF)和胶质源性神经营养因子(GDNF)的水平。结果:通过上述方法,可以得到纯度85%以上的OECs,光镜下OECs突起细长,以典型的双极或三极细胞为主,背景有少量扁平的、折光性差的细胞存在;NGF、BDNF和GDNF在上清液中均有存在,其中NGF含量最高,NGF和BDNF含量随着培养时间延长逐渐升高,11 d达到高峰,GDNF仅在培养第11 d后检测到。结论:采用差速贴壁法结合免疫亲和吸附法可以获得较高纯度的OECs,培养11~14 d,OECs数量多且分泌旺盛,适合用于细胞移植。     

Viability and functionality of cells delivered from peptide conjugated scaffolds

Many cell-based therapies aim to transplant functional cells to revascularize damaged tissues and ischemic areas. However, conventional cell therapy is not optimally efficient: massive cell death, damage, and non-localization of cells both spatially and temporally all likely contribute to poor tissue functionality. An alginate cell depot system has been proposed as an alternative means to deliver outgrowth endothelial cells (OECs) in a spatiotemporally controllable manner while protecting them in the early stages of tissue re-integration. Here OECs exiting the alginate scaffold were measured for viability, functionality, and migration speed and characterized for cytokine and surface marker profiles. OECs were highly viable in the alginate and were depleted from the scaffold via migration at a speed of 21 ± 6 μm/h following release. Prolonged interaction with the alginate scaffold microenvironment did not detrimentally change OECs; they retained high functionality, displayed a similar angiogenic cytokine profile as control OECs, and did not have significantly altered surface markers. These results suggest that alginate-OEC interactions do not adversely affect these cells, validating control of cellular migration as a means to control the cell delivery profile from the material system, and supporting usage of the alginate scaffold as an efficient cell delivery vehicle.     

嗅鞘细胞联合神经干细胞脑内移植改善Parkinson病大鼠行为的观察

为了观察嗅鞘细胞(OECs)联合神经干细胞(NSCs)脑内移植对Parkinson病(PD)的治疗作用,首先将6-OHDA注射至左侧黑质致密部和腹侧被盖区制备PD大鼠。将成功制备的PD大鼠随机分为5组,即0.9%生理盐水对照组、单纯移植NSCs或OECs组、OECs+NSCs共移植组和PD模型对照组。将培养并传至第3代的NSCs、OECs和OECs+NSCs分别移植到PD大鼠的纹状体内,于移植后7、14、30、60d检测PD大鼠旋转行为变化后处死,取脑做冰冻切片,行BrdU、酪氨酸羟化酶(TH)、p75免疫荧光和TH免疫组织化学检测。移植后21d以内,各组大鼠的旋转行为无明显变化;30d和60d时,单纯移植NSCs或OECs组和OECs+NSCs共移植组与生理盐水和模型对照组相比,旋转行为有较明显的改善(P<0.05),其中OECs+NSCs共移植组的旋转行为改善更为显著。在移植后30d和60d,单纯移植NSCs或OECs组在移植区可见少数TH阳性神经元,而OECs+NSCs共移植组的TH阳性神经元明显多于单纯移植NSCs或OECs组(P<0.05)。上述结果表明:OECs能促进胚鼠中脑来源的NSCs向TH阳性神经元分化;单纯移植NSCs或OECs和OECs+NSCs共移植,均能不同程度地改善PD大鼠的旋转行为,但联合移植优于单纯移植。     

An efficient method for the cryopreservation of fetal human liver hematopoeitic progenitor cells

The use of human hematopoietic progenitor cells (HPC) for transplantation requires efficient recovery methods and cryopreservation procedures. The purpose of this study was to determine cryopreservation techniques for fetal human liver (FHL) CD34(+) cells. We assessed FHL HPC recovery efficiency after freezing and thawing by viability testing, fluorescence-activated cell sorting analysis, and colony-forming ability under different conditions. We also determined optimal cell freezing concentrations and the effect of rate-controlled freezing on cell recovery. Lastly, cell recovery after varying freezing time periods was examined. Our results indicated that optimal cell recovery occurs when: A) cryopreservation medium consists of either 5% dimethylsulphoxide (DMSO) or 10% DMSO in combination with either 20% fetal bovine serum (FBS) or 70% FBS and when Iscove's modified Dulbecco's medium consists of not more than 10% DMSO; B) a rate-controlled freezing device container is used; C) CD34(+) cells are frozen at a concentration of 1 x 10(6)/ml, and D) a thawing temperature of 37 degrees C is used. These observations indicate that cryopreservation of FHL HPC is possible for up to 18 months in optimal conditions without losing hematopoietic activity.     

大鼠嗅鞘细胞体外培养及免疫组化研究

目的：建立体外纯化培养嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells，OECs）的稳定方法并观察培养嗅鞘细胞（OECs）形态学特征。方法：原代培养成年雄性SD大鼠嗅球的嗅神经层和颗粒层中提取的OECs，利用差速贴壁和阿糖胞苷（Ara-c）抑制法除去混杂的成纤维细胞和星形胶质细胞以获得纯化的OECs。用P75抗体免疫组织化学染色鉴定OECs，计算纯化度。结果：此方法获得的OECs纯度可达93％以上。OECs的外形主要以突起细长的双极和三极为主，或无突起呈“煎蛋样”，随时间延长细胞生长排列呈现一定方向性。结论：此方法稳定易复制，可获得高纯度的OECs。     

Human oviductal epithelial cells express Toll-like receptor 3 and respond to double-stranded RNA: Fallopian tube-specific mucosal immunity against viral infection

BACKGROUND: The aim of this study was to evaluate the site-specific immunoregulatory mechanisms against viral infection in human Fallopian tubes. METHODS: We therefore investigated the effects of double-stranded RNA (dsRNA) on the production of interleukin (IL)-6, IL-8 and granulocyte chemotactic protein-2 (GCP-2) by cultured oviductal epithelial cells (OECs) using enzyme-linked immunosorbent assays. Phosphorylation of inhibitor kappaB-alpha (IkappaB-alpha) protein after dsRNA stimulation and the expression of Toll-like receptor (TLR) 3 in these cells were also evaluated by western blot analysis. RESULTS: Polyriboinosinic:polyribocytidylic acid (poly I:C), a synthetic dsRNA that antagonizes TLR3, stimulated the secretion of IL-6, IL-8 and GCP-2 by OECs. Poly I:C-induced production of these cytokines by OECs was inhibited by the pretreatment of these cells with anti-TLR3 antibody. The phosphorylation of IkappaB-alpha protein was detected in OECs after stimulation by poly I:C. The expression of TLR3 was also detected in OECs. CONCLUSION: These results suggest that the epithelial cells of the human Fallopian tube have evolved a unique, site-specific mechanism for recognizing viral infection. TLR3-mediated production of proinflammatory cytokines and chemokines in OECs in response to viral dsRNA may be important for antiviral immunity in the human female reproductive tract.     

成年大鼠嗅球成鞘细胞的原代培养

本实验取材于成年 Wistar大鼠嗅球的最外两层 ,进行原代培养嗅球成鞘细胞 ,用胶质纤维酸性蛋白抗体免疫组化方法确认。结果显示 :( 1)培养至第 10 d,原代培养物多见两种形态的细胞 :一种为单极、双极或多极细胞 ,带有细长的突起 ;另一种为所谓“煎蛋样”细胞 ,扁平状 ,胞质少极化 ,边缘不规则 ;( 2 )胶质纤维酸性蛋白反应显示这两种细胞均呈阳性 ,Nissl法复染后 ,可计数其纯度为 70 %～ 85 %。