丹参酮Ⅱ A对LPS诱导EA.hy926细胞TLR4和TNF-α的影响

目的:观察丹参酮ⅡA对脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞EA.hy926炎症反应Toll样受体4(TLR4)和TNFα表达的影响,探讨丹参酮ⅡA抗动脉粥样硬化(AS)的作用机制.方法:体外培养EA.hy926细胞;RT-PCR和免疫细胞化学法检测TLR4 mRNA和蛋白的表达;RT-PCR和ELISA法检测TNF-αmRNA和蛋白的表达.结果:经LPS刺激后TLR4和TNF-α的表达与正常组比较均明显升高(P＜0.05),丹参酮ⅡA组TLR4和TNF-α的表达与刺激组相比明显受抑制(P＜0.05).结论:抑制TLR4和TNF-α的表达是丹参酮ⅡA抗AS作用的可能机制之一.     

NF-κB p65 siRNA抑制人脐静脉内皮细胞迁移的研究

目的:观察RNA干扰技术(RNAi)特异性抑制人脐带静脉血管内皮细胞( EAhy926)内NF-κB p65基因效果及对细胞迁移力的影响.方法:10 μg/L血管内皮生长因子(VEGF)刺激培养EAhy926细胞,给予转染NF-κB p65 siRNA,同时设立对照组,分别是阴性对照siRNA转染组、空白脂质体组及正常对照组(不给予其他任何处理),48 h后分别采用RT-PCR、 Western blot检测细胞内NF-κB p65 mRNA及蛋白的表达水平,并计算细胞迁移抑制率.结果:与正常对照组比较,NF-κB p65 siRNA组的细胞内NF-κB p65 mRNA及蛋白的表达量均明显减少( P <0.05);而阴性对照siRNA转染组及空白脂质体组的细胞内相应的表达量则无统计学意义.同时,siRNA转染后对细胞的迁移抑制率达64.5%,空白脂质体组和阴性对照siRNA组则仅为7.5%和11.3%.结论:siRNA能通过抑制血管内皮细胞内NF-κB p65的信号通路,抑制细胞的迁移能力,这为今后抗血管生成治疗研究打下了基础.     

早期应用生长反应因子1小干扰RNA可抑制烟草烟雾刺激大鼠主动脉平滑肌细胞白细胞介素1β mRNA的表达

背景：研究表明,在动脉粥样硬化的血管壁细胞中白细胞介素1β表达水平升高。 目的：观察早期生长反应因子1的小干扰RNA对烟草烟雾提取物刺激大鼠主动脉平滑肌细胞中白细胞介素1β mRNA表达的影响。 方法：体外培养大鼠主动脉平滑肌细胞,用不同体积分数(0%,5%,10%,20%和40%)烟草烟雾提取物刺激细胞,筛选最佳体积分数烟草烟雾提取物干预细胞0,8,16和24 h,以确定最佳干预时间,最后用生长反应因子1小干扰RNA以沉默细胞中生长反应因子1的表达。  结果与结论：RT-PCR结果显示,烟草烟雾提取物可诱导大鼠主动脉平滑肌细胞白细胞介素1β mRNA的表达,且有时间和浓度依赖性,烟草烟雾提取物最佳干预时间为8 h,最佳干预体积分数为10%。将生长反应因子1小干扰RNA转染10%烟草烟雾提取物刺激的细胞后8 h,白细胞介素1β mRNA表达明显减少(P < 0.05)。证实早期应用生长反应因子1小干扰RNA可以抑制烟草烟雾提取物诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞中白细胞介素1β mRNA的表达。     

IL-8对血管内皮细胞紧密连接的影响

目的 研究白细胞介素-8(IL-8)对血管内皮细胞紧密连接的影响.方法 采用免疫荧光染色检测经不同浓度和时间IL-8处理后EA.hy926细胞的3种紧密连接蛋白occludin、claudin-5和ZO-1的形态和分布;逆转录PCR(RT-PCR)检测3种蛋白mRNA的表达水平.结果 IL-8可改变内皮细胞紧密连接蛋白...     

ZNF580在1-磷酸鞘氨醇诱导内皮细胞迁移和增殖中的作用

 目的：研究人锌指蛋白ZNF580在1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate, S1P)诱导内皮细胞迁移和增殖中的作用,为探讨ZNF580功能提供科学依据。方法：RT-PCR检测S1P受体在EA.hy926细胞的表达情况;不同浓度(0~10 μmol/L) S1P刺激EA.hy926细胞不同时间(0~12 h)后,RT-PCR和Western blotting检测S1P对ZNF580表达的影响;利用p38 MAPK信号通路特异性抑制剂SB203580研究S1P是否通过此信号通路影响ZNF580的表达;脂质体转染法获得瞬时过表达和瞬时低表达ZNF580的EA.hy926细胞;Transwell实验及MTT比色法分析ZNF580对内皮细胞迁移和增殖活性的影响。结果：EA.hy926细胞表达S1P1、S1P3和S1P5三种受体,其cDNA的特异性扩增产物分别为352 bp、701 bp和236 bp;S1P刺激EA.hy926细胞后,ZNF580的表达呈现剂量和时间依赖性增高;SB203580能够抑制S1P诱导的ZNF580的上调作用;ZNF580过表达（低表达）后内皮细胞迁移和增殖活性明显增强（减弱）。结论：S1P通过p38 MAPK信号通路影响ZNF580的表达;ZNF580在内皮细胞迁移和增殖过程中起着重要的调控作用。     

miR-126对EA.hy926细胞血管内皮生长因子表达的调控作用

 目的：探讨miR-126对EA.hy926细胞血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法：选用EA.hy926细胞株作为研究对象,采用阳离子介导的转染方式,将miR-126 inhibitor 和miR-126 mimics 进行细胞转染,分析miR-126对血管内皮细胞功能的影响。采用转染negative control作为阴性对照,转染36 h后提取细胞总RNA,利用 real-time PCR和Western blotting分别检测EA.hy926细胞 VEGF  mRNA 和蛋白水平的表达。结果：转染miR-126 inhibitor 50 nmol/L 36 h后,EA.hy926细胞的VEGF mRNA及蛋白水平各组间差异有统计学意义（P<001）,与阴性对照组相比,miR-126 inhibitor 使EA.hy926细胞的VEGF mRNA及蛋白水平显著上调（P<001）;转染miR-126 mimics 50 nmol/L 36 h后,EA.hy926细胞的VEGF mRNA及蛋白水平各组间有显著差异（P<001）,与阴性对照组相比,miR-126 mimics 使EA.hy926细胞的VEGF 在mRNA及蛋白水平显著下调（P<001）。结论：miR-126 能够抑制VEGF的表达,VEGF有可能是其调节的靶基因之一。     

人脐静脉内皮细胞单层通透性改变的效应因子

背景：外源性刺激引起血管屏障功能损伤的分子机制是血管病理生理学尚未阐明的热点问题之一。 目的：探讨炎症递质脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞单层通透性改变的效应分子,寻找有效治疗靶点。 方法：应用脂多糖刺激并观察人脐静脉内皮细胞骨架蛋白F-actin和细胞单层通透性的改变。应用荧光免疫组化和Western blot方法检测脂多糖刺激前后细胞中RhoA和SRF等信号分子的改变。并通过阻断实验证实RhoA-SRF信号通路的作用。 结果与结论：100 µg/L脂多糖刺激6 h可引起人脐静脉内皮细胞中F-actin快速重构并形成大量应力纤维,细胞单层通透性明显增强。细胞中活化RhoA的表达明显增加,SRF发生明显的入核转位现象。应用特异性分子抑制剂Y27632抑制RhoA的活化后,细胞中F-actin重构现象消失,细胞单层通透性增加也受到明显抑制,SRF蛋白发生明显的出现转位。而应用Latrunculin B抑制脂多糖刺激的人脐静脉内皮细胞中F-actin应力纤维形成,对抗通透性增加,但RhoA活化未受到干扰,SRF入核现象则受到抑制。提示RhoA-SRF通路的活化介导了脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞中F-actin重构和内皮单层通透性增加,特异性抑制F-actin也可以阻断脂多糖引起的血管内皮单层通透性增加,同时反馈抑制SRF的入核活化现象。     

肝癌肿瘤微环境对血管内皮细胞增殖及血管生成能力的影响

研究间接共培养条件下肝癌细胞培养基对血管内皮细胞增殖及血管生成能力的影响,初步探讨肿瘤微环境下血管新生的分子机制。体外培养人脐静脉内皮细胞株EA.hy926,与肝癌细胞株HepG2条件培养基进行共培养;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测肝癌细胞条件培养基对血管内皮细胞增殖的影响;血管管腔形成实验检测血管内皮细胞的血管生成能力。Western blot测定肝癌细胞条件培养基对血管内皮EA.hy926细胞血管内皮生长因子(VEGF)及其受体Flk-1表达的影响。结果表明,EA.hy926细胞经HepG2条件培养基处理后,其增殖能力明显增加。接种于Matrigel胶的EA.hy926细胞经HepG2条件培养基刺激后,形成管腔数目增加,成血管能力明显增强;同时,其胞内VEGF及其受体Flk-1的表达呈时间依赖性上调。肿瘤微环境下肝癌细胞作用于血管内皮细胞,可促进血管内皮细胞的增殖并提高其血管生成能力。     

RNA干扰对人肺泡上皮A549细胞巨噬细胞移动抑制因子基因表达抑制作用

目的探讨巨噬细胞移动抑制因子(MIF)小干扰RNA(siRNA)干扰对人肺泡上皮A549细胞株MIF基因表达的影响.方法将MIF siRNA用转染剂Interferin介导转染体外培养的A549细胞,通过RT-PCR方法观察不同浓度MIF siRNA转染后,对MIF mRNA表达的影响;采用细胞免疫荧光方法分析MIF蛋白表达的强弱;应用MTT方法测定MIF siRNA转染对细胞的毒性,及脂多糖(LPS)刺激对A549细胞生存率的影响.结果 (1)MIF siRNA转染人肺泡上皮A549细胞株后,可下调细胞中MIF mRNA的表达,只有当MIF siRNA转染浓度大于50 nmol/L时,才能明显下调MIF mRNA的表达;(2)MIF siRNA转染人肺泡上皮A549细胞株后,A549细胞MIF的荧光蛋白表达也明显降低,在此基础上再加入MIF刺激,MIF的蛋白表达又明显增加;(3)MIF siRNA转染对A549细胞几乎没有毒性,且对LPS刺激A549细胞导致细胞死亡及细胞的生存率下降有一定的保护作用.结论 MIF siRNA能在A549细胞特异沉默目的基因MIF和抑制MIF蛋白的表达,且对LPS刺激导致细胞死亡有一定的保护作用.     

类风湿关节炎滑膜血管内皮细胞中Smoothened的表达及其意义

 目的:初步观察Sonic Hedgehog信号通路分子Smoothened（Smo）在类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）滑膜血管内皮细胞的表达及其生物学意义。方法:收集4例病情中度活动的RA患者的滑膜组织,同时收集4例外伤或半月板损伤（无关节炎）者滑膜组织作为对照组,免疫组化检测滑膜组织Smo蛋白表达情况。采用人脐静脉内皮细胞系EA.hy926作为滑膜血管内皮细胞的模型,予不同浓度肿瘤坏死因子α（TNF-α）处理,Western blotting检测Smo蛋白表达;采用RNAi技术转染体外合成的特异性Smo-siRNA,应用Western blotting检测沉默效果;转染siRNA 24 h后,经TNF-α/放线菌素D（actinomycin D, ActD）诱导细胞凋亡,CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:RA患者滑膜组织Smo表达高于对照组,以血管内皮细胞表达尤为明显。EA.hy926细胞经TNF-α刺激后,Smo蛋白表达上调（P<0.05）。RNA干扰EA.hy926细胞Smo表达后,细胞存活率为（24.30±0.45）%,低于阴性对照组的（36.86±0.62）%（P<0.05）,细胞凋亡率为（48.00±1.96）%,高于阴性对照组的（31.70±0.82）%（P<0.05）。结论: Smo可能参与了RA患者滑膜组织血管内皮细胞凋亡的调控。     

IL-3基因转染的肿瘤细胞体内对巨噬细胞数目和功能的影响

曾发现转染IL—3基因的黑色素瘤细胞(B16—IL—3)体内致瘤性下降,肿瘤组织有包括巨噬细胞在内的大量炎症细胞浸润。进而研究了C57BL/6小鼠在皮下接种B16—IL—3细胞后,腹腔巨噬细胞数目和功能的变化。在接种B16-IL-3细胞后第4天,腹腔巨噬细胞的数目就升高1倍,接种后第10～15天升高5～6倍。而且体外无需LPS的刺激,腹腔巨噬细胞就能分泌一定水平的细胞因子IL—1、IL—6和TNF,具有较强的杀伤活性,体外经LPS刺激后,其分泌水平和杀伤活性继续升高,明显高于对照组。此外。腹腔巨噬细胞MHC二类抗原Ia的表达也明显增强。提示B16—IL—3细胞分泌的IL—3有效地激活了体内的巨噬细胞,这可能是B16—IL—3细胞体内致瘤性下降的原因之一。     

短发夹状RNA特异性抑制HeLa细胞的Hax-1基因表达

目的:构建靶向Hax-1基因的短发夹状干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体pGenesil-Hax-1,并探讨siRNA靶向抑制Hax-1基因表达的作用。方法:根据shRNA设计的原则,在Hax-1全长序列中选取含19个核苷酸靶序列,设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pGenesil-1中,获得可靶向抑制Hax-1基因的重组shRNA表达载体。采用LipofectamineTM2000转染试剂将pGenesil-Hax-1导入HeLa细胞中;分别采用RT-PCR以及Western blot从mRNA和蛋白水平上检测干扰效果。结果:半定量PCR及Western blot结果表明,siRNA可使Hax-1mRNA的转录水平得到显著抑制(P<0.01),Hax-1蛋白的表达较对照组减少约70%。结论:靶向Hax-1基因的重组shRNA表达载体pGene-sil-Hax-1介导的siRNA可显著抑制Hax-1基因在人宫颈癌HeLa细胞中的表达。     

TRAF6 knockdown promotes survival and inhibits inflammatory response to lipopolysaccharides in rat primary renal proximal tubule cells

Aim: TRAF6 is a unique adaptor protein of the tumour necrosis factor receptor-associated factor family that mediates both tumour necrosis factor receptor (TNFR) and interleukin-1 receptor/Toll-like receptor (IL-1R/TLR) signalling. Activation of IL-1R/TLR and TNFR pathways in renal tubular cells contributes to renal injury. This study aimed to investigate if blockade of lipopolysaccharide (LPS)-triggered TLR4 signalling by small interfering RNA (siRNA) targeting TRAF6 protects survival and inhibits inflammatory response in isolated rat renal proximal tubular cells (PTCs). Methods: PTCs isolated from F344 rat kidneys were transfected with chemically synthesized siRNA targeting TRAF6 mRNA. Real-time quantitative PCR was applied to measure mRNA level of TRAF6, TNF-α, IL-6 and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Protein levels of extracellular signal-regulated kinase (ERK), c-jun N-terminal kinase (JNK), p38 mitogen-activated protein kinase, caspase 3 and cleaved caspase 3 were evaluated by Western blotting. Cell viability was analysed with XTT reagents. Results: We found that the TRAF6 gene was effectively silenced in PTCs using siRNA. TRAF6 knockdown resulted in reduced TNF-α and IL-6 mRNA expression upon LPS challenge. LPS-induced phosphorylation of JNK and p38 was attenuated in TRAF6 siRNA-transfected cells while the change in the phosphorylation of ERK was not remarkable. TRAF6 knockdown was associated with increased cell viability and reduced protein level of cleaved caspase-3, both, in the absence and presence of LPS. Conclusion: Our studies suggest that TRAF6 knockdown may inhibit inflammatory response and promote cell survival upon LPS challenge in primary rat proximal renal tubular cells.     

RNA干扰CREB对缓激肽作用的胶质瘤细胞IL-1β分泌的影响

目的探讨转录因子cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)的磷酸化是否介导了缓激肽刺激大鼠C6胶质瘤细胞内白细胞介素-1β(IL-1β)的表达。方法利用RNA干扰(RNAi)技术,以CREB为靶基因,将体外化学合成的CREB序列特异性双链小干扰RNA(siRNA)和无关序列的siRNA分别与Lipofectamine2000结合后转染细胞,用Western blot分析CREB蛋白的表达水平。利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量技术和放射免疫法分别检测CREB siRNA转染前后,缓激肽诱导C6胶质瘤细胞IL-1βmRNA及细胞培养上清液中IL-1β的表达水平。结果CREB序列特异性siRNA转染细胞72h后,可较强的抑制CREB蛋白的表达,而无关序列的siRNA对CREB蛋白表达水平无明显的抑制作用。RT-PCR和放射免疫法结果均显示CREBsiRNA干预C6细胞后,并未改变缓激肽刺激IL-1β表达的能力。结论化学合成的siRNA可有效抑制C6胶质瘤细胞中CREB的表达,CREB可能未参与缓激肽刺激C6细胞IL-1β表达的信号转导过程。     

Effect of shRNA targeted against RhoA on proliferation and migration of human colonic cancer cells

Objective: To study the effects of RhoA siRNA on the malignant phenotypes of human colorectal cancer cell line LoVo. Methods: The siRNA expression vector pGPU6/GFP/Neo-shRNA-RhoA targeting the mRNA of RhoA and vector pGPU6/GFP/Neo-NC (as a control) were constructed, and then transfected into LoVo cells. The expression of Survivin was detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction and Western blot. The malignant phenotypes of transfected LoVo cells, including invasive activities and adhesive capabilities, were analyzed. Results: RhoA mRNA and protein level were decreased after the pshRNA-RhoA transfection. The cell adhesion rates significantly decreased in the cells transfected with pshRNA-RhoA. The migrating number of LoVo cells (26.5 ± 0.9) transfected with pshRNA-RhoA was also significantly decreased as compared with the control group (53.7 ± 1.4). Conclusions: The sequence specific shRNA against RhoA constructed in the study can block the expression of RhoA in LoVo cell effectively and specifically; Blocking the expression of RhoA in LoVo cells transfected with pshRNA-RhoA can reduce their invasive and adhesive capabilities.     

RNAi沉默NF-κB p65对小鼠巨噬细胞细胞因子表达的影响

目的: 探讨RNA干扰(RNAi)技术在抑制NF-κB p65表达、调控LPS活化后巨噬细胞细胞因子表达中的应用。方法: 利用阳离子脂质体将NF-κB p65小干扰RNA(siRNA)瞬时转染入Ana-1细胞,RT-PCR及Western blotting法检测其沉默效率,ELISA法检测LPS(1 mg/L)刺激下0 h、4 h、12 h和24 h Ana-1细胞培养上清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10浓度。结果: NF-κB p65 siRNA转染24 h后,NF-κB p65在基因水平及蛋白水平表达均被明显抑制(P<0.05)。RNA干扰组Ana-1细胞培养上清中细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达在相应时点内均较对照组明显降低(P<0.05),IL-10表达显著升高,在12 h和24 h差异显著(P<0.05)。结论: 体外实验初步证实RNAi技术能有效沉默小鼠巨噬细胞NF-κB p65 基因的表达,下调其下游调控的促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及上调抑炎症细胞因子IL-10的表达,从而抑制过度的炎症反应。