体外培养人正常椎间盘髓核细胞与退变髓核细胞的生物学性状比较:可以为干预退变髓核细胞提供最佳时机吗?

背景:人体椎间盘是一个承受载荷却又缺乏血管的结构,因而容易发生退行性变,但椎间盘退变的机制尚不明确。目的:通过体外培养人正常椎间盘髓核细胞与退变髓核细胞生物学性状比较,认识退变髓核细胞的细胞学退变时机。方法:分离、培养人正常及退变椎间盘髓核细胞,对两种细胞采用光镜、电镜等形态学方法进行大体形态和超微结构观察,采用生长曲线和XTT实验研究两种细胞的生长动力学差异,测定髓核细胞的活力和细胞Ⅱ型胶原及糖胺多糖的mRNA表达。结果与结论:退变椎间盘细胞至少要比正常椎间盘细胞提前2代出现形态学老化表现。退变髓核细胞表现为G1期阻滞,使细胞不能进入S期,细胞有丝分裂受到抑制。退变髓核细胞总体来说,生长要比正常髓核细胞快,但老化也较快。退变髓核细胞自第1代开始,Ⅱ型胶原和糖胺多糖的mRNA表达比同期正常髓核细胞低得多。说明在体外培养条件下,退变髓核细胞持续增殖能力低,更容易衰老、凋亡。提示退变髓核细胞体外培养衰老较快,进行干预试验逆转椎间盘退变的最佳时机为传2代之前的细胞。     

bFGF对人退变椎间盘髓核细胞影响的临床研究

目的:探讨bFGF对人退变髓核细胞合成细胞外基质的影响,观察退变髓核细胞基因表达量高于正常髓核细胞的生长刺激因子对退变髓核细胞的影响。方法:分离、培养人退变椎间盘髓核细胞,取第2代髓核细胞,随机将退变椎间盘髓核细胞分为5组。A组:加入100μg/L bFGF;B组:加入200μg/L bFGF;C组:500μg/L bFGF;D组:1 000μg/LbFGF,E组:对照组,不加干扰因素。通过对试验组和对照组髓核细胞测定细胞II型胶原和糖胺多糖的mRNA表达;检测细胞外基质II型胶原和糖胺多糖表达水平。结果:bFGF刺激退变髓核细胞,II型胶原、糖胺多糖mRNA,细胞外液Ⅱ型胶原和糖胺多糖含量在第7天较对照组增加明显(P<0.05)。14 d、21 d II型胶原、糖胺多糖mRNA明显低于对照组(P<0.05)。但细胞外液Ⅱ型胶原和糖胺多糖含量在14 d、21 d两个时间点仍高于正常组(P<0.05)。结论:根据本研究结果结合文献调研,bFGF在椎间盘髓核细胞中存在着双重效应(促进或改善椎间盘退变)。     

不同代次兔髓核细胞的形态学特征和生物学性状

背景：椎间盘退变是个慢性、复杂的过程,然而椎间盘退变其发生机制尚未完全阐明,很难自行修复。近年来研究细胞移植治疗椎间盘退行性变尚处在实验室阶段。研究髓核细胞的生物学性状可为研究椎间盘退变机制、组织工程构建椎间盘、基因治疗等提供理论依据。 目的：研究兔不同代次髓核细胞的生物学特性,旨在找出合适的种子细胞去治疗椎间盘退变性疾病。 方法：从新西兰大耳白兔椎间盘髓核组织中,分离并培养髓核细胞同时进行培养传代,对原代及第3,4代髓核细胞进行苏木精-伊红染色观察细胞形态学变化;甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法检测髓核细胞内聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达;反转录PCR法测定Ⅱ型胶原和聚合蛋白聚糖mRNA的表达水平,观察各代髓核细胞生物学特性的变化。 结果与结论：兔椎间盘髓核细胞可以在体外培养并进行传代,原代髓核细胞一般需7 d左右贴壁,形状呈类圆形或多角形,原代和第3代髓核细胞都呈圆形或多角形,活力较强,苏木精-伊红染色后细胞核被染成均一蓝黑色,胞浆呈现淡粉色;髓核细胞经过甲苯胺蓝染色后,胞浆内呈现天蓝色,通过Ⅱ型胶原免疫组织化学染色后,胞浆内表现为黄褐色沉淀。到第4代细胞出现退变,Ⅱ型胶原和聚合蛋白聚糖mRNA的表达水平较前几代细胞显著下降。前3代的髓核细胞代谢旺盛,表型一致,聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原表达正常,传第4代后髓核细胞开始出现衰老、退变。     

过氧化物酶Ⅱ对体外培养人退变腰椎间盘髓核细胞的抑制作用

背景:椎间盘退变可导致髓核细胞数量的减少,过氧化物酶Ⅱ可参与细胞的抗氧化损伤、细胞分裂、分化、信号转导和凋亡等过程的调控。过氧化物酶Ⅱ对椎间盘退变有促进作用,但其机制仍不清楚。目的:观察过氧化物酶Ⅱ对体外培养的人退变腰椎间盘髓核细胞的活性和Ⅱ型胶原合成的影响。方法:体外培养人退变腰椎间盘髓核细胞,设置对照组及过氧化物酶Ⅱ10,100和1000ng/L组。对照组不含氧化物酶Ⅱ,其他3组加入相应剂量的氧化物酶Ⅱ。应用免疫组化法鉴定髓核细胞,并采用cck-8试剂盒检测细胞增殖情况,于加过氧化物酶Ⅱ后第3和7天分别取对照组及各组细胞上清液,采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验测定Ⅱ型胶原表达情况。结果与结论:在体外培养的人退变腰椎间盘髓核细胞,随加入的过氧化物酶Ⅱ质量浓度的增加,椎间盘髓核细胞数量和Ⅱ型胶原合成逐渐减少(P0.01)。提示过氧化物酶Ⅱ对椎间盘髓核细胞的数量和Ⅱ型胶原合成有明显的抑制作用,并呈剂量依赖关系。以此推测过氧化物酶Ⅱ对髓核细胞的抑制作用可能是导致椎间盘退变的一种促发因素。     

多次胶原酶消化法培养小鼠椎间盘髓核细胞

背景：椎间盘为无血运组织,椎间盘髓核细胞为分化终末细胞,细胞增殖能力较差,体外培养难度较大。 目的：探索小鼠椎间盘髓核细胞体外分离培养的方法。 方法：取小鼠椎间盘髓核组织,使用多次胶原酶消化的方法,分离培养髓核组织细胞,接种,传代,取第2代细胞,分别采用免疫细胞化学和RT-PCR方法检测椎间盘髓核细胞特征性分泌物Ⅱ型胶原和聚合蛋白的分泌量及mRNA的表达,并与软骨细胞,成骨细胞及成纤维细胞进行比较。 结果与结论：椎间盘髓核细胞贴壁后呈现软骨细胞的形态;Ⅱ型胶原和聚合蛋白染色均为阳性;Ⅱ型胶原和聚合蛋白mRNA表达与软骨细胞相同,与成纤维细胞和成骨细胞存在明显差别。说明多次胶原酶消化的方法可以获得大量纯净的椎间盘髓核细胞,性状稳定。     

髓核细胞移植抑制椎间盘退变

背景：近年来,椎间盘细胞移植和椎间盘移植修复椎间盘退变研究取得较大的进展。目的：探讨髓核细胞的体外培养方法以及髓核细胞移植在抑制椎间盘退变研究中的作用。方法：通过数据库检索的方式探讨髓核细胞移植抑制椎间盘退变的研究。髓核细胞的主要功能是产生胶原和蛋白聚糖,改进髓核细胞的培养方法,使培养后的髓核细胞数量增多,合成和分泌细胞外基质增加,通过髓核细胞移植来修复退变的椎间盘。结果与结论：通过三维小球聚集培养、微载体旋转立体培养等方法可以使髓核细胞数量增多,肝细胞生长因子对髓核细胞增殖产生促进作用。髓核细胞移植可以恢复退变椎间盘高度,促进退变椎间盘内蛋白多糖和Ⅱ型胶原的生物合成和分泌。随着对椎间盘退变研究的不断深入,髓核细胞移植对退变椎间盘可能是一种重要的治疗手段。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植;肝移植;移植;心脏移植;组织移植;皮肤移植;皮瓣移植;血管移植;器官移植;组织工程全文链接：     

尼古丁在人椎间盘髓核细胞退变中的作用

目的探讨不同浓度及时间的尼古丁在人椎间盘髓核细胞退变中的作用。方法随机选择5例腰椎骨折患者的椎间盘髓核组织进行体外细胞培养,种于12孔板中,按照0、1、33.3、100、200、500ng/m L的尼古丁浓度以及1、2、3、7、10天加入来培养,每组细胞用Trizol法提取总RNA,用荧光定量PCR测定AQP1,AQP3和II型胶原(Collagen)以及蛋白多糖(Aggrecan)的m RNA表达。用SPSS19.0进行统计分析。结果随着尼古丁浓度升高及培养时间的延长,髓核细胞形态变化明显,贴壁能力减弱,胞质减少,胞核萎缩,空泡形成,凋亡增加。且细胞AQP1及AQP3的m RNA水平随着尼古丁浓度及时间的增加而降低,II型胶原及蛋白聚糖m RNA水平也降低,细胞发生退变。结论尼古丁会降低人椎间盘髓核细胞AQP1和AQP3的表达,进而降低髓核细胞II型胶原和蛋白聚糖的表达,促进椎间盘退变,且作用时间越长,浓度越高,细胞退变越严重。     

胰岛素样生长因子1及血小板源性生长因子对人退变髓核细胞生物学活性的影响

背景：有研究表明胰岛素样生长因子1和血小板源性生长因子可抑制人椎间盘细胞凋亡。 目的：观察在体外培养条件下胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子对人退变髓核细胞生物学活性的影响。 方法：体外单层培养人退变髓核细胞,通过免疫组织化学鉴定细胞。对传3代人退变髓核细胞采用分别不同生长因子干预,实验分4组：胰岛素样生长因子1组,血小板源性生长因子组,胰岛素样生长因子1+血小板源性生长因子组及对照组。 结果与结论：胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子均可促进细胞增殖,促进细胞合成Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖,其中胰岛素样生长因子1促Ⅱ型胶原合成作用强于血小板源性生长因子(P < 0.05),血小板源性生长因子促蛋白聚糖合成作用强于胰岛素样生长因子1(P < 0.05)。胰岛素样生长因子1促进细胞合成Ⅰ型胶原,血小板源性生长因子抑制细胞合成Ⅰ型胶原。结果证实,胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子均可通过促进细胞增殖、促进细胞合成Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖,从而提高人退变髓核细胞的生物学活性。     

骨形态发生蛋白2对退变椎间盘组织学和Ⅰ，Ⅱ型胶原的影响

背景：研究表明,退变椎间盘细胞外基质的主要变化是Ⅱ型胶原和蛋白多糖含量的减少和Ⅰ型胶原含量的增加。 目的：观察腺相关病毒介导的骨形态发生蛋白2基因(AAV-BMP-2)对兔退变腰椎间盘内髓核Ⅰ,Ⅱ型胶原的影响。 方法：将12只新西兰大白兔L2-3,L3-4,L4-5,L5-6椎间盘针刺制造退变模型后随机分为3组,每组4只。其中AAV-BMP-2组兔椎间盘注射AAV-BMP-2,AAV组兔椎间盘注射不携带目的基因的空载体,生理盐水组兔椎间盘注射生理盐水,注射后第8周处死动物取其相应的椎间盘常规石蜡包埋,组织切片,以苏木精-伊红染色观察其髓核组织学变化,免疫组织化学法检测髓核组织Ⅰ型、Ⅱ型胶原表达并进行半定量分析。 结果与结论：普通苏木精-伊红染色结果显示AAV-BMP-2组椎间盘内髓核细胞数目较多,呈单个或者簇状分布,髓核结构清晰,无纤维样组织填充。而AAV组和生理盐水组的组织结构相似,髓核内细胞数目少,髓核皱缩干瘪,细胞间为纤维样组织填充且排列紊乱。免疫组织化学染色显示：AAV-BMP-2组椎间盘髓核内Ⅱ型胶原的表达均高于AAV组和生理盐水组(P < 0.05);AAV-BMP-2组椎间盘髓核内Ⅰ型胶原的表达均低于AAV组和生理盐水组(P < 0.05)。结果说明,体内转染AAV-BMP-2能抑制椎间盘髓核细胞表达Ⅰ型胶原,促进椎间盘髓核细胞表达合成Ⅱ型胶原,提示维持椎间盘内胶原的含量、种类,可维持椎间盘内组织学的结构和形态,稳定髓核细胞生长环境,延缓椎间盘的退变。     

体外培养条件下兔脊柱运动节段髓核组织的变化

背景：椎间盘器官体外培养模型作为体内试验和细胞培养的联系,能够在原生基质中维持细胞活性,从而保留了重要的细胞与细胞及细胞与基质的相互作用。 目的：观察体外培养兔脊柱运动节段模型髓核组织的变化。 方法：将13只新西兰白兔处死后在无菌条件下取出脊柱运动节段50个,在高渗培养基中进行整体培养  (410 mOsm/kg),于培养前及培养后第3,7,14,21天,各取10个椎间盘分别进行苏木精-伊红染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学、蛋白多糖含量和髓核细胞活力测定。 结果与结论：培养14 d苏木精-伊红显示椎间盘组织结构基本保持完整,21 d椎间盘组织形态学破坏;Ⅱ型胶原免疫组织化学染色强度14 d无显著差异(P > 0.05),21 d染色变浅,与之前各时间点相比有显著差异(P <   0.05);蛋白多糖PAS/AB染色7 d内强度无降低,14 d强度有所减弱,21 d染色强度进一步减弱;髓核细胞荧光检测21 d髓核细胞荧光强度减弱,细胞活性降低,与之前各时间点比较差异明显(P < 0.05)。结果表明,培养14 d兔脊柱运动节段椎间盘髓核组织退变不显著,培养21 d模型髓核退变明显,脊柱运动节段目前在14 d内可作为研究生物力学对椎间盘影响的体外实验模型。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程      

椎间盘微环境下椎间盘源性干细胞和髓核间充质干细胞的活性

文题释义：椎间盘微环境：在正常情况下,髓核组织缺乏血液供应,其营养代谢主要依赖渗透。由于代谢产物等影响,椎间盘组织内部的pH值为6.9-7.2,被认为是人体内最恶劣的环境之一,在这种条件下细胞正常代谢能力受到很大抑制,即使是特化的髓核细胞其代谢率也仅为正常的32%。当椎间盘退变后,葡萄糖及氧浓度进一步下降,乳酸堆积,pH值降低和代谢产物进行性增加。 髓核间充质干细胞：经过前期实验发现髓核间充质干细胞经自体移植于椎间盘局部,可以分化为纤维环细胞和髓核细胞,或者通过旁分泌细胞因子来促进组织细胞的再生,但髓核间充质干细胞在椎间盘微环境中存活量级并不清楚。椎间盘源性干细胞和髓核间充质干细胞在椎间盘微环境下的生存变化差异性也还是未知。 背景：椎间盘微环境对干细胞生物学行为具有重要作用,拟通过微环境调节作用来实现不依赖种子细胞的椎间盘组织修复。 目的：探讨椎间盘微环境下椎间盘源性干细胞和髓核间充质干细胞活性的差异。 方法：健康雄性SD大鼠10只,按照解剖区分离椎间盘骨组织,用Ⅱ型胶原酶消化后进行体外培养椎间盘源性干细胞;分离髓核组织,采用酶消化法体外培养髓核间充质干细胞。将获得的椎间盘源性干细胞和髓核间充质干细胞在体外进行正常条件、椎间盘微环境条件下培养扩增,培养第1-6天采用MTT法测定细胞增殖情况,培养第1,3,6天采用流式细胞技术检测CD29阳性表达水平。 结果与结论：①在不同环境的培养条件下,椎间盘源性干细胞和髓核间充质干细胞增殖情况呈相反趋势。在正常培养条件下,椎间盘源性干细胞和髓核间充质干细胞呈增殖状态,第4-6天为对数增殖期,两者差异无显著性意义(P > 0.05);在椎间盘微环境条件下,髓核间充质干细胞的增殖活性明显低于椎间盘源性干细胞,差异有显著性意义(P < 0.05);②在椎间盘微环境条件下培养第3,6天,椎间盘源性干细胞表面CD29阳性抗原表达水平明显高于髓核间充质干细胞,差异有显著性意义(P < 0.05);③结果表明,在椎间盘微环境条件下,髓核间充质干细胞和椎间盘源性干细胞活性受到一定程度的抑制,但椎间盘源性干细胞较髓核间充质干细胞保留更多的细胞活性。 ORCID: 0000-0002-3582-5630(胡炜) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

地塞米松可影响兔髓核细胞增殖及Ⅱ型胶原的表达

背景：地塞米松是细胞增殖的一种常用药物,但能否促进髓核细胞增殖呢？ 目的：观察地塞米松对兔椎间盘髓核细胞增殖的影响,以及对髓核细胞分泌Ⅱ型胶原的影响。 方法：无菌条件下取兔椎间盘,常规分离消化髓核细胞进行培养;传代培养第2代髓核细胞7 d,加入塞米松浓度分别为1,10,100,1 000,10 000 nmol/L,培养1~5 d每日MTT常规测一组490 nm处的吸光值并制定生长曲线。另选取最佳作用浓度100 nmol/L地塞米松加入髓核细胞进行培养,以不加于地塞米松为对照。 结果与结论：MTT检测结果表明地塞米松对兔髓核细胞增殖有促进作用,最佳作用浓度为100 nmol/L,最佳作用时间为    48 h;RT-PCR检测结果表明经地塞米松处理的髓核细胞其Ⅱ型胶原表达明显较对照组高(P < 0.05)。提示地塞米松可以促进兔椎间盘髓核细胞的增殖,并可使兔髓核细胞内Ⅱ型胶原表达增高。     

颈椎不稳对邻近节段椎间盘蛋白多糖及Ⅱ型胶原的影响

背景：颈椎行减压融合内固定术后邻近节段椎间盘加速退变,单个节段不稳是否也会加速邻近节段椎间盘退变还不清楚。 目的：研究颈椎不稳动物模型邻近节段椎间盘形态学、蛋白多糖及Ⅱ型胶原的变化。 方法：16只新西兰大白兔,随机分为实验组及对照组,每组8只。实验组通过颈椎前路穿刺破坏纤维环及抽吸C5/6髓核组织建立兔颈椎不稳动物模型,12周X射线证实退变后处死动物取材,切取C4/5椎间盘组织,从矢状面切开,取其髓核组织10 mg,间苯三酚法测定髓核中蛋白多糖的量,另取椎间盘组织制作石蜡切片后进行苏木精-伊红染色和SABC免疫组化染色观察。 结果与结论：实验组C4/5椎间盘髓核脊索细胞减少,被成纤维细胞样细胞取代,偶见圆形的软骨细胞,且椎间盘纤维环变得粗糙,排列紊乱,玻璃样变性及色素沉着,可见纤维软骨细胞,内外层纤维环之间形成裂隙。髓核中蛋白多糖的含量降低,与对照组相比差异有显著性意义。退变椎间盘髓核及纤维环中Ⅱ型胶原也较对照组明显减少。结果表明颈椎不稳可诱发邻近节段颈椎退变,表现为椎间盘发生形态学变化,蛋白多糖、Ⅱ型胶原含量下降。     

六味地黄丸含药血清对椎间盘Ⅰ型和Ⅱ型胶原表达的影响

背景：胶原纤维是维持椎间盘正常结构与功能的重要物质,椎间盘中胶原的类型及含量的变化,影响整个椎间盘的生理和病理状态,Ⅰ型及Ⅱ型胶原是椎间盘胶原的主要组分。 目的：观察六味地黄丸含药血清对肿瘤坏死因子α致伤兔椎间盘Ⅰ型、Ⅱ型胶原蛋白和基因表达的影响。 方法：将15只新西兰白兔带终板的45个L2-L5椎间盘随机分为空白第1天组、空白第14天组、肿瘤坏死因子α组、中药血清组、肿瘤坏死因子α+中药血清组。后两种培养液中分别含5 μg/L肿瘤坏死因子α和体积分数10%六味地黄丸血清,培养14 d后收集髓核和纤维环观察。 结果与结论：RT-PCR和Western Blot检测结果表明,随着培养时间的延长,纤维环中Ⅰ型胶原及髓核中Ⅱ型胶原蛋白和基因表达明显降低;加入肿瘤坏死因子α可加速这种变化,而含药血清可延缓Ⅰ,Ⅱ型胶原蛋白和基因表达变化。提示六味地黄丸可通过稳定Ⅰ,Ⅱ型胶原蛋白和基因表达,对椎间盘细胞外基质具有保护作用。     

Effects of hypoxias and scaffold architecture on rabbit mesenchymal stem cell differentiation towards a nucleus pulposus-like phenotype

Nucleus pulposus grafts are needed for patients requiring replacement of their degenerated intervertebral discs. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) are a potential autologous stem cell source for the nucleus pulposus regeneration. One of the key issues of constructing functional nucleus pulposus using MSCs, however, is to differentiate MSCs into nucleus pulposus phenotype in?vitro and to maintain their phenotypic stability in?vivo. In this study, three-dimensional (3D) nanofibrous poly(l-lactide) (PLLA) scaffolds were seeded with multi-potent rabbit MSCs and the constructs were induced along nucleus pulposus development routes in a hypoxia chamber (2% O(2)) in the presence of TGF-β1. It was found that nanofibrous scaffold could support the differentiation of rabbit MSCs towards a nucleus pulposus-like phenotype in?vitro, as evidenced by upregulated expression of a few important nucleus pulposus-associated genes (aggrecan, type II collagen and Sox-9), abundant deposition of extracellular matrix (glycosaminoglycan (GAG) and type II collagen), and the continuous expression of the nucleus pulposus-specific marker, hypoxia-inducible factor (HIF)-1α. The subcutaneous implantation results confirmed that hypoxic induction before implantation could help the constructs to retain their phenotype and resist calcification in?vivo. Therefore, the above data showed the promise of using 3D nanofibrous scaffolds in combination with TGF-β1 and hypoxic induction to regenerate functional nucleus pulposus grafts for intervertebral disc replacement.