人地中海贫血基因β654的克隆与序列分析

[目的]克隆人地中海贫血基因β654,并进行序列分析,为下游转基因小鼠模型的建立奠定工作基础。[方法]以PCR法扩增获得人β654基因,将其克隆入卸除了人β基因的质粒pBGT51中,酶切、反应点杂交及测 法鉴定重组质粒。[结果]所构建的重组质粒中含人β654基因,其引入方向正确,序列分析结果正确。[结论]构建所得的重组擀粒可用于下游的传基因工作。     

人β-NGF基因的体外扩增、克隆及其序列的分析

目的　对人β－ ＮＧＦ基因进行体外扩增和克隆及其序列分析,为其在真核细胞中的表达及其临床应用打下基础。方法　本实验设计并合成一对特异性引物,采用聚合酶链反应分别从人脑ｃＤＮＡ 和人睾丸ｃＤＮＡ 以及人脑基因组ＤＮＡ中扩增出β－ 神经生长因子（β－ ＮＧＦ）基因,并和Ｔ４ 载体相连接,经筛选得到人β－ ＮＧＦ克隆,并用Ｓａｎｇｅｒ 双脱氧末端终止法进行序列分析。结果　凝胶电泳显示在预期的位置出现阳性条带。结论　阳性克隆经序列分析证明克隆基因序列正确     

EBV—DNA酶全基因扩增克隆和鉴定

根据Ｂｅａｒ的ＥＢ病毒基因全序列，设计包括ＥＢＶ特生ＤＮＡ酶全基因的一对引物，在引物上设计有一相ＳａｌⅠ切点，以便于克隆，选用蛋白酶Ｋ裂解的Ｒａｊｉ细胞ＤＮＡ为模板，扩增出一１４６０ｂｐ的特异条带，纯化后经ＴａｑⅠ酶切形成１１９８ｂｐ和２６２ｂｐ的两个片段，证实该扩增片段即为ＥＢＶ特生ＤＮＡ酶的全基因片段。     

中国人神经生长因子基因（β—NGF）的扩增,克隆及序列分析

从正常人血白细胞中提取基因组ＤＮＡ，以此基因组ＤＮＡ为模板，应用ＰＣＲ方法扩增神经生长因子基因，把得到的基因片段重组到质粒ｐＵＣ１２上，经转化、筛选和鉴定得到含有中国人神经生长因子基因（β－ＮＧＦ）的克隆。用双链末端终止法测定其全部３５４ｂｐ核苷酸顺序。测出的核苷酸与文献报道的顺序有６处不同，据此推导出的氨基酸顺序有３处变化。推测中国人神经生长因子基因具有特殊性。     

HIV-1基因限制性显示片段的克隆与序列分析

目的　克隆并分析经限制性显示－聚合酶链反应（ＲＤ－ＰＣＲ）扩增的ＨＩＶ－１基因片段。方法　将所有ＨＩＶ－１基因片段 分成１０组并进行ＲＤ－ＰＣＲ扩增,纯化各组ＰＣＲ产物后将之克隆至Ｔ载体上并快速鉴定。从阳性克隆中提取质粒,扩 增靶片段并测序。结果　序列分析表明,所扩增的片段均属于ＨＩＶ基因。结论　改良了一种多片段的克隆及鉴定方法并 用于限制性显示扩增片段的克隆。     

特异基因的PCR扩增及其快速克隆

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，直接从微生物基因组中扩增卡介苗Ａｇ８５－Ｂ编码基因。虽然在引物５＇端设计了限制性内切酶识别顺序以及附加顺序，但因限制性内切酶不能切开这些顺序，使扩增基因产物不能克隆到质粒载体中。因此，我们构建了新的克隆载体即Ｔ载体，专门用于克隆未经任何修饰的ＰＣＲ产物；这种方法价廉，快速有效，值得推广应用。     

HIV—1基因限制性显示片段的克隆与序列分析

目的：克隆并分析经限制性显示－聚合酶链反应（RD－PCR）扩增的HIV－1基因片段。方法：将所有HIV－1基因片段分成10组并进行RD－RCR扩增,纯化各组PCR产物后将之克隆至T载体上并快速鉴定。从阳性克隆中提取质粒,扩增靶片段并测序。结果：序列分析表明,所扩增的片段均属于HIV基因。结论：改良了一种多片段的克隆及鉴定方法并用于限制性显示扩增片段的克隆。     

中国人神经生长因子基因（β－NGF）的扩增、克隆及序列分析

从正常人血白细胞中提取基因组ＤＮＡ，以此基因组ＤＮＡ为模板，应用ＰＣＲ方法扩增神经生长因子基因，把得到的基因片段重组到质粒ｐＵＣ１２上，经转化、筛选和鉴定得到含有中国人神经生长因子基因（β－ＮＧＦ）的克隆。用双链末端终止法测定其全部３５４ｂｐ核苷酸顺序。测出的核苷酸顺序与文献报道的顺序有６处不同，据此推导出的氨基酸顺序有３处变化。推测中国人神经生长因子基因具有特殊性。     

广西眼镜蛇神经生长因子的克隆及序列分析

目的:扩增广西眼镜蛇神经生长因子(NGF)的全长基因并进行序列分析.方法:应用聚合酶链反应技术,以广西眼镜蛇cDNA为模板,扩增出编码NGF的全长基因,并克隆至pMD18-T载体中进行基因测序.结果:所得序列与Genbank提供的序列(M61180)对比显示,广西眼镜蛇prepro-NGF与Naja kaouthia (monocled cobra)、Bungarus multicinctus、mouse、人的NGF同源性分别为99%、91%、66%、68%,将不同氨基酸相同的化学性质计算在内,同源性更高.结论:成功地获得了广西眼镜蛇NGF的全长基因,且序列与已知序列高度一致.     

中国株HGV部分基因的分子克隆与核苷酸序列分析

采用ＲＴ－ＰＣＲ对广东地区３３例肝炎病血清进行ＨＧＶＲＮＡ检测，结果２例（６．１％）阳性，对其中１株输血后ＨＧＶ（ＣＨ－Ｓ）基因组５端非翻译区（５′ＵＴＲ）进行分子克隆与测序，并分别与Ｌｉｎｎｅｎ等报道的２株ＨＧＶ（ＰＮＦ２１６１，Ｒ１０２９１）和Ｌｅａｒｙ等报道的ＧＢＶ－Ｃ相比较，其核苷酸序列的同源性分别为８９．２％，８８．７％，８７．１％，本研究首次证实我国华南地区存在ＨＧＶ感染，ＨＧＶ高度保     

单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D基因Sav株及野生株的克隆和序列分析

探讨我国单纯疱疹病毒Ⅱ型（ＨＳＶ－２）糖蛋白Ｄ（ｇＤ）基因结构和功能及与国外的病毒株之间的差异，为研制我国生殖器疱疹疫苗提供理论依据。方法利用聚合酶链反应从ＨＳＶ－２Ｓａｖ国际标准毒株及我国１例生殖器疱疹复发型野生株中扩增、克隆出糖蛋白Ｄ基因序列。结果将野生株和Ｓａｖ株ＤＮＡ序列及氨基酸序列同ＨＳＶ－２Ｇ株比较，发现其ＤＮＡ同源性为９９．２％，氨基酸同源性为９９．１％。结论我国ＨＳＶ－２野生株同国外的Ｓａｖ株及Ｇ株ｇＤ基因存在高度的同源性，同时也存在一定变异。     

金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的克隆和序列测定

根据已公布的金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的序列，设计并合成一对特异性的引物。以鼠金黄色葡萄球菌临床分离株SA.m0109的基因组DNA为模板，利用PCR技术对其耐热核酸酶nuc基因片段进行扩增，获得了预计大小的片段。将这一片段克隆到质粒载体pGEM-T中，对重组质粒pGEM-NUC进行限制内切酶分析，PCR鉴定和克隆片段的序列测定。证实了克隆片段的可靠性。     

泌尿生殖道解脲脲原体,人型支原体及生殖支原体的检测

了解不同人群泌尿生殖道解脲脲原体、人型支原体及生殖支原体的流行病学情况。方法采用聚和酶链反应，对北京市、武汉市和汕头市的３所医院的性传播疾病门诊患者共１８４例，及北京市不同妇女人群中泌尿生殖道中上述３种支原体进行了检测。结果解脲脲原体和人型支原体的检出率高于生殖支原体；在性混乱人群中３种支原体的检出率与性混乱程度呈正相关；解脲脲原体和人型支原体在非性混乱人群中亦有较高检出率，尤其是解脲脲原体在孕妇中的检出率很高。结论泌尿生殖道支原体寄居和感染的关系值得今后进一步深入研究。     

从母血细胞和血浆提取胎儿DNA效率的比较研究

目的:通过比较全血和血浆中提取的胎儿DNA对诊断结果的影响,寻找最适的非创伤性产前诊断的方法。方法:取28例13-40孕周的孕妇外周血4 ml,等量分装于2个不同的采血管内,分别从两种不同的途径制备模板DNA,采用改良的聚合酶链反应(PCR)技术,对胎儿DYZ-1基因进行产前检测。以出生后直接观察结果作为对照。结果:23例孕育男性胎儿孕妇,从全血和孕妇血浆中提取DNA的DYZ-1基因检出率分别为65%和96%,5例孕育女性胎儿孕妇,没有1例出现假阳性结果。结论:血浆游离DNA直接分析法的检出率相对高于外周血细胞DNA模板制备法,血浆中游离DNA是极为适合的材料来源。     

两种检测乙型肝炎病毒核酸的聚合酶链反应比较

目的 :评价普通聚合酶链式反应 (C PCR)和荧光定量聚合酶链式反应 (FQ PCR)检测乙型肝炎病毒核酸 (HBVDNA)的临床应用价值。方法 :用C PCR和FQ PCR分别检测 2 4 9例乙型肝炎患者和 5 1例健康体检者血清HBVDVA。乙型肝炎血清学标志物用ELISA测定。结果 :用C PCR和FQ PCR检测HBVDVA阳性率分别为 :HBeAg (+)组 80 5 0 %和 10 0 0 0 % (P <0 0 1) ;抗HBe (+)组 17 39%和 82 6 0 % (P<0 0 1) ;HBeAg ( )抗HBe ( )组 14 5 1%和 4 0 32 % (P <0 0 1)。健康体检者两法均为阴性。结论 :FQ PCR对乙型肝炎诊断、传染性的判断和抗病毒药物疗效评价方面比C PCR更具有临床应用价值。     

可溶性白细胞介素—6受体基因的扩增,克隆及序列分析

从Ｈｅｌａ细胞中提取总ＲＮＡ，以此总ＲＮＡ为模板，应用反转录ＰＣＲ方法扩增可溶性白细胞介素－６受体基因，把得到的基因片段重组到质粒ＰＵＣ１９上，经转化、筛选和鉴定得到含有可溶性白细胞介素－６受体基因的克隆。测定其全部９９９ｂｐ核苷酸顺序，测出的核苷酸顺序与文献报道的顺序有二处不同，据此推导出的氨基酸顺序有二处变化。     

赖型钩体内鞭毛基因的扩增、克隆、核苷酸序列测定及其在大肠杆菌中的表达

根据钩体内鞭毛蛋白（Ｅｎｄｏｆｌａｇｅｌｌｉｎ）ｆｌａＢ基因核苷酸序列自行设计一对引物，以赖型钩体ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ扩增到约８４０ｂｐ的片段。扩增片段经酶切（ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ）定向克隆入ｐＵＣ８。重组质粒ｐＬＦ１插入片段与哈勒焦型钩体ｆｌａβ基因相比，核苷酸序列和推测的氨基酸序列同源性很高。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明有一约３３ｋｄ的特异蛋白带，表达量占菌体蛋白１１％。免疫印迹试验表明此区带能被抗赖型钧体内鞭毛（轴丝）抗血清识别。首次以ＢＡＬＢ／ｃ小鼠钧体病模型为基础，用含重组质粒ｐＬＦ１的大肠杆菌作免疫原进行免疫保护试验，实验组存活率高子对照组，表现了一定程度的保护作用。本研究结果在所查国内外文献中尚属首次报道。     

人芳香二烷基磷酸酯酶基因多态性同步分析研究

目的 :建立一种对PON1 192和PON1 5 5位密码子等位基因同步分型的方法。方法 :在Multiplex PCR RELP基础上 ,通过引物设计错配 ,在一体系中同时扩增分别含密码子PON1 192和PON1 5 5的DNA片段 ,当等位基因为PON1 192R/PON1 5 5L时 ,其PCR扩增产物均被引入唯一的限制性内切酶HinfⅠ的识别位点G ANTC。PCR产物经酶消化 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳后 ,根据不同组合片段 ,确认为不同的基因型 ,从而同时对两个位点进行基因分型。结果 :在检测的 80例健康个体中PON1 192 :Q 4 6 .9% ,R 5 3.1% ;PON1 5 5 :L 95 .6 % ,M 4 .4 % .结论 :此方法同时可分析基因两个位点的多态性 ,省时省力 ,方法简便 ,便于两个位点以及与疾病之间的连锁分析 ,很有推广价值 .     

等位基因特异PCR技术检测结核分支杆菌rpoB基因突变研究

目的 建立并评价等位特异多聚酶链反应检测结核分支杆菌耐利福平基因rpoB突变的方法。方法 设计与rpoB基因突变后的碱基配对的引物用于扩增突变基因，建立AS－PCR检测rpoB基因突变的方法，并对58株结核菌进行了检测。结果 AS－PCR检测结核菌耐利福平相关基因rpoB的敏感性为77.3%，特异性达91.7%。AS－PCR检测rpoB基因，有1628A→T、1657C→T，G和1673C→T突变分别占耐利福平结核菌株的18.2%，22.7%和36.4%。检测rpoB突变与MIC测定RFP耐药率和PCR－SSCP检测的总符合率分别为86.2%和74.1%。检测试验可在3－4h内完成。结论 AS－PCR方法是检测结核菌耐利福平基因突变的敏感和快速方法，可在临床实验室使用并为临床医师提供治疗依据。     

抗人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)外膜蛋白gp120单链抗体基因的构建及测序鉴定

目的　构建抗HIV 1gp120单链抗体基因,为进一步用于HIV 1感染的诊断和治疗奠定基础。方法　利用 RT PCR法,从抗HIV 1gp120单克隆抗体杂交瘤细胞扩增得到抗体轻链和重链的可变区基因,经重叠延伸反应, 在体外随机合成单链抗体基因(ScFv),并克隆到pGEM Easy T载体中,经测序及Blast同源性分析。结果　该 ScFV基因全长为666bp,为VH Linker VL结构,VH基因为396bp,编码132个氨基酸;Linker为(Gly4Ser)3短 肽;VL基因为270bp,编码90个氨基酸。VH基因与小鼠IgG2a重链可变区的同源性达95%,VL基因与小鼠免 疫球蛋白κ轻链可变区的同源性达98%。结论　成功构建了抗HIV 1gp120单链抗体基因。