人参单体皂苷Rh2抑制缺氧条件下人视网膜血管内皮细胞增殖及整合素αvβ3表达的研究

目的探讨人参单体皂苷Rh2对缺氧条件下人视网膜血管内皮细胞生长及整合素（integrin）αvβ3表达的影响。方法建立人视网膜血管内皮细胞缺氧模型,并给予其不同浓度的人参单体皂苷Rh2,应用MTT法观察人参单体皂苷Rh2对人视网膜血管内皮细胞增殖的影响;应用流式细胞术检测人视网膜血管内皮细胞凋亡的情况;用RT-PCR检测对Integrinαv和β3基因的表达。结果MTT结果显示,缺氧对照组细胞增殖活性明显强于正常对照组（P〈0.05）;缺氧细胞加用Rh2后的增殖明显受到抑制,与缺氧对照组比差异具有显著性（P〈0.05）;流式细胞结果显示,加用Rh2后的细胞凋亡率与缺氧对照组比无显著性差异（P〉0.05）。RT-PCR结果表明,和正常对照组比,缺氧对照组的细胞Integrinαv和β3基因的表达明显增强,Rh2可显著下调Integrinαv和β3基因表达。结论人参单体皂苷Rh2在缺氧条件下能明显抑制人视网膜血管内皮细胞的生但无明显诱导凋亡的作用。     

人IFN-β重组慢病毒的制备及对肺癌细胞增殖的影响

人β干扰素;;慢病毒载体;;基因转染;;A549细胞 %X 目的构建人β干扰素（IFN-β）基因重组慢病毒,体外转染人肺癌A549细胞,观察IFN-β基因的表达及其对A549细胞的增殖抑制作用。方法通过聚合酶链反应（PCR）获得人IFN-β基因,克隆到慢病毒载体,通过转染293细胞包装制备慢病毒液,并体外感染A549细胞,采用RT-PCR及Western Blot检测IFN-β基因在A549细胞中的表达情况。应用MTS法检测转染后对A549细胞增殖的影响。结果 IFN-β基因重组质粒经酶切后电泳结果显示能得到与理论大小相符的片段,基因测序结果与GenBank序列完全一致,重组质粒经鉴定正确,转染293细胞获得病毒滴度为3×107PFU/ml,体外感染A549细胞后,RT-PCR、Western Blot检测IFN-β表达水平明显增高,并可明显抑制A549细胞增殖。结论本研究成功构建IFN-β基因重组慢病毒,体外感染后能够稳定表达并抑制A549细胞增殖,为应用IFN-β基因治疗肺癌奠定初步基础。     

小鼠半胱天冬酶-12特异性小干扰RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠半胱天冬氨酸蛋白酶-12（Caspase-12）基因特异性小干扰RNA（siRNA）表达载体并检测其表达。方法 参照siRNA模板设计原则，设计并合成3对针对caspase-12不同位点的siRNA，分别在脂质体介导下转染小鼠肝癌细胞株Hepal-6，24h收集细胞；RT-PCR分析不同位点siRNA对靶基因mRNA表达的抑制，筛选出抑制效率最高的位点；将此位点siRNA模板序列插入质粒pRNAT-H1．1Neo中，PCR分析及基因测序进行鉴定；构建成功的重组质粒转染Hepal-6细胞48h和72h后，实时荧光定量PCR分析caspase-12 mRNA表达；Western印迹检测Caspase-12的表达。数据行t检验。结果 RT-PCR分析表明，第-对siRNA（siRNA＊1）对caspase-12基因表达的抑制效率最高；重组质粒pRNAT-H1．1Neo-caspasel2（pRNAT-caspl2）经PCR分析及测序表明，siRNA＊1模板序列成功插入预计位点，且序列正确；pRNAT-caspl2转染Hepal-6细胞48h和72h后，与空质粒对照组相比，caspase-12 mRNA水平分别下降72．5％和59．5％（P〈0．05）；pRNAT-caspl2转染后，caspase-12酶原表达量在24、48和72h分别下调17．1％、37．3％和60．1％，48h和72h的抑制率比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 成功构建小鼠caspase-12特异性siRNA真核表达载体，它对小鼠肝癌细胞caspase-12基因的表达具有显著和特异的抑制作用。     

靶向胰腺癌PANC-1细胞整合素连接激酶基因RNA干扰质粒的构建及鉴定

目的:构建整合素连接激酶(integrin-linkedkinase,ILK)基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)重组质粒并检测其对胰腺癌PANC-1细胞ILK基因表达的干扰效率,为进一步研究胰腺癌中ILK基因功能奠定实验基础和理论依据.方法:设计并构建3条含有针对ILK基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列的重组质粒并进行DNA测序.通过阳离子脂质体Lipofectamine 2000将重组质粒转入人胰腺癌细胞株Panc-1细胞中,G418压力筛选至得到稳定转染细胞克隆,利用Real-Time PCR和Western blot检测ILK基因的表达抑制情况.筛选出干扰效率最高的重组质粒.结果:经DNA测序证实胰腺癌PANC-1细胞ILK基因的R NA干扰重组质粒构建成功;重组质粒稳定转染Panc-1细胞后(各组转染效率均>90%),各实验组ILK基因表达均被有效地抑制,其中重组质粒-2的干扰效率最高,其mRNA及ILK表达显著下调,其抑制率分别为93.01%和65.69%;ILK mRNA表达较阴性对照组、空质粒组表达量显著下降(0.090±0.009vs 1.147±0.110,1.005±0.121,P<0.01).结论:成功构建ILK基因RNA干扰重组质粒,重组质粒能有效抑制胰腺癌Panc-1细胞ILK基因表达.为进一步研究ILK在胰腺癌中的基因功能奠定基础.     

STAT3靶向短发夹RNA干扰重组载体对结肠癌SW480细胞的沉默作用

目的 探讨STAT3基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒对结肠癌SW480细胞STAT3基因的干扰作用.方法 根据siRNA设计原则,构建靶向STAT3基因的短发夹RNA干扰质粒(pGPU6/GFP/STAT3),使用脂质体法转染人结肠癌细胞系(SW480),通过RT-PCR和 Western 印迹检测结肠癌SW480细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平.结果 pGPU6/GFP/STAT3重组质粒经限制性内切酶酶切及测序证明基因插入正确.质粒成功转染SW480细胞后,该细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达明显下降(P<0.05).结论 成功构建靶向STAT3基因的shRNA表达载体,转染SW480细胞,能有效抑制细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达,为STAT3基因靶向治疗提供前期的实验依据.     

血管内皮细胞生长因子真核表达质粒的构建及其在心肌细胞中的表达

目的 :构建血管内皮细胞生长因子 （ VEGF1 65）真核表达质粒 pc DNA3 .1（ -） /h VEGF1 65,并通过转染心肌细胞来验证其生物活性。方法 :应用 DNA重组方法 ,将编码 h VEGF1 65全长 c DNA克隆于真核表达载体 pc DNA3 .1（ -）中 ,构建 pc DNA3 .1（ -） /h VEGF1 65真核表达质粒 ;应用阳性脂质体介导的基因转染技术 ,将真核表达质粒 pc D-NA3 .1（ -） /h VEGF1 65瞬时转染培养的大鼠心肌细胞中 ;采用 RT-PCR,ELISA,Western blot及免疫组化染色等方法检测 VEGF1 65基因在心肌细胞中的表达情况 ;应用 MTT法检测转染后细胞上清液中 VEGF1 65的生物活性。结果 :将构建好的真核表达质粒 pc DNA3 .1（ -） /h VEGF1 65转染心肌细胞后 ,VEGF m RNA及蛋白表达水平明显增高 ,转染后的心肌细胞培养上清液具有促使内皮细胞增殖的生物活性。结论 :成功构建了真核表达质粒 pc DNA3 .1（ -） /h VEGF1 65,其转染心肌细胞后可获得较高水平 VEGF蛋白的表达 ,所表达出 VEGF蛋白具有生物学活性     

真核表达载体pCMV-(Kozak)TFPI在搭桥模型移植静脉中的表达

目的构建真核表达载体pCMV-（Kozak）TFPI并检测其在移植静脉中的表达，为冠状动脉旁路移植术中转染大隐静脉内皮细胞抗凝治疗的临床试验奠定理论应用基础。方法用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的方法提取人组织因子途径抑制因子（TFPI）基因，并引入Kozak序列，将（Kozak）TFPI亚克隆入pCMV质粒中。在阳离子脂质体介导下，转染颈总动脉搭桥模型移植静脉内皮细胞。RT-PCR、蛋白印迹法（Western印迹）和免疫组化法检测移植静脉中外源TFPI基因mRNA和蛋白的表达。结果（Kozok）TFPI成功克隆入pCMV中。RT-PCR、Western印迹和免疫组化检测到移植静脉中外源TFPI基因mRNA和蛋白的表达。结论pCMV-（Kozak）TFPI真核表达载体构建成功，移植静脉中检测到其蛋白的表达。     

bFGF基因转染对血管内皮细胞迁移的影响及机制

目的研究碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）基因转染对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）迁移能力的影响,并探讨其可能机制。方法通过基因亚克隆构建真核表达载体pcDNA3．1-bFGF,利用脂质体介导将bFGF基因导入HUVECs内,通过RT-PCR和ELISA法检测基因的表达;bFGF基因转染后的HUVECs通过Transwell小室法检测其迁移能力的变化;Western blot法检测转染后的细胞Raf-1、细胞外调节蛋白激酶2（ERK2）和黏着斑激酶（FAK）蛋白表达变化。结果成功构建了表达载体pcDNA3．1-bFGF,该载体转染HUVECs后,bFGFmRNA和蛋白均显著增加。转染bFGF基因可使HUVECs的体外迁移能力增强,上调ERK2和FAK蛋白的表达,但对Raf-1蛋白表达无影响。结论bFGF基因转染能促进血管内皮细胞的迁移,其作用机制可能与上调ERK2和FAK蛋白表达有关。     

Ox-LDL对血管内皮细胞中ABCA1及单核细胞趋化因子的影响

目的研究在致动脉粥样硬化（AS）因子氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL）刺激下,人血管内皮细胞ECV304中腺苷三磷酸结合盒转运体A1（ABCA1）基因对炎性因子单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）的调节作用,从而阐明ABCA1基因在AS发生中的作用机制。方法培养人血管内皮细胞ECV304,加入Ox-LDL（30 ng/ml）刺激3、6、12、24 h,以荧光定量RT-PCR检测ABCA1、MCP-1 mRNA表达量,Western蛋白印迹法和ELISA法检测ABCA1、MCP-1及IL-1β蛋白表达量;ABCA1的反义寡核苷酸（100 nmol/L）转染人血管内皮细胞,给予上述的Ox-LDL,同样方法测定上述指标的改变。结果人血管内皮细胞ECV304在给予Ox-LDL刺激后,ABCA1、MCP-1的mRNA和蛋白质水平及IL-1β蛋白质水平均增高;给予反义寡核苷酸转染3、6 h后,ABCA1、MCP-1 mRNA的表达降低,12、24h后ABCA1、MCP-1及IL-1β蛋白质的表达水平降低。结论在Ox-LDL作用下,血管内皮细胞中的ABCA1可能通过增加IL-1β的表达,促进MCP-1释放,从而在AS的早期发生中发挥作用。     

RNA干扰技术选择性下调大鼠血管紧张素Ⅱ 1a型受体及其作用的实验研究

目的用RNA干扰技术选择性下调大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）上血管紧张素Ⅱ1a（AT1a）型受体的表达,并检验其对细胞活性及增殖的影响。方法构建携带U6启动子和AT1a特异短发夹RNA（shRNA）编码序列的质粒载体pAT1a-shRNA1,pAT1a-shRNA2,以含非特异性shRNA编码序列的质粒载体pGenesil-Con（pCon）为对照,转染原代培养的大鼠主动脉VSMCs,通过半定量RT-PCR和Western blot法检测AT1a、AT2受体的表达情况,以内参照β-肌动蛋白进行标化。用四甲基氮唑盐（MTY）比色法（测A490nm值）检验其对细胞活性及血管紧张素Ⅱ促增殖效应的影响。结果pAT1a-shRNA1使AT1a的mRNA和蛋白质表达分别降低82％和69％,pAT1a-shRNA2使之分别降低77％和56％,差异有统计学意义。转染对照质粒组与空白对照组AT1a受体表达差异无统计学意义;各组AT2受体表达差异无统计学意义。单纯转染质粒各组A490nm差异无统计学意义,给予血管紧张素Ⅱ刺激后,pAT1a-shRNA1、pAT1a-shRNA2组A490nm显著低于空白对照组和对照质粒组。结论RNA干扰技术能选择性下调原代培养的VSMCs AT1a受体的表达,并显著抑制血管紧张素Ⅱ促细胞增殖的效应,无明显细胞毒性。这可能为相关基因的功能研究提供新的方法,亦可能为心血管疾病基因治疗的探索开拓新的思路。     

血小板源性内皮细胞生长因子小干扰RNA质粒的构建和鉴定

目的构建针对血小板源性血管内皮生长因子（PDECGF）小干扰RNA（siRNA）表达质粒和阴性对照质粒pIASRC-PDECGF，并观察对PDECGF表达的影响。方法构建针对PDECGFsiRNA表达质粒pIASR-PDECGF和阴性对照质粒pIASRC—PDECGF，将沟建成功的质粒转染大肠癌细胞株GC7901，观察PDECGF蛋白表达的影响。结果成功构建针对PDECGF siRNA表达质粒pIASR-PDECGF。并发现它能够明显抑制PDECGF的表达。而阴性对照质粒则无此作用。结论血小板源性内皮细胞生长因子小干扰RNA能够特异性抑制PDECGF的表达。     

整合素αvβ3拮抗剂治疗大鼠脑胶质瘤的实验观察

目的观察整合素αvβ3拮抗剂IS201治疗大鼠脑胶质瘤的效果,并探讨其机制。方法建立SD大鼠C6脑胶质瘤模型,将荷瘤鼠随机分为对照组和实验组。实验组给予整合素αvβ3拮抗剂IS201,对照组给予PBS液,两组均行腹腔注射。观察治疗后大鼠的生存期,测量大鼠肿瘤体积,用免疫组化法检测肿瘤中微血管密度（MVD）和整合素αvβ3、增殖细胞核抗原（PCNA）的表达水平。结果实验组大鼠生存期显著长于对照组,C6脑胶质瘤体积明显小于对照组（P〈0．01）;实验组大鼠C6脑胶质瘤中MVD低于对照组,整合素αvβ3、PCNA的表达水平亦低于对照组（P〈0．01）。结论整合素αvβ3拮抗剂IS201能够降低大鼠C6脑胶质瘤的血管生成和肿瘤细胞增殖,对C6胶质瘤的生长有明显的抑制作用。     

沉默GRP78基因对人卵巢癌SKOV3细胞侵袭力的抑制作用

目的 探讨RNA干涉技术(RNAi)沉默葡萄糖调节蛋白78(GRP78)基因对人卵巢癌SKOV3细胞侵袭力的影响,阐明GRP78基因沉默对SKOV3细胞侵袭力抑制作用的生物学机制.方法 设计并构建pSilencerTM3.0-H1-GRP78 siRNA重组质粒,脂质体介导转染至SKOV3细胞.RT-PCR和Western印迹法检测GRP78基因表达;RT-PCR检测MMP-2、MMP-9 mRNA表达;Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭力;Transwell小室迁移实验检测细胞迁移率.结果 RT-PCR及Western印迹检测转染GRP78 siRNA重组质粒SKOV3细胞GRP78基因表达抑制;RT-PCR结果显示与对照组相比转染GRP78 siRNA重组质粒SKOV3细胞MMP-2、MMP-9 mRNA表达降低;Transwell小室侵袭实验和迁移实验结果显示转染GRP78 siRNA重组质粒SKOV3细胞穿透细胞数(P＜0.05)和迁移率均明显降低(P＜0.05).结论 ①转染GRP78 siRNA重组质粒有效抑制SKOV3细胞GRP78基因表达;②抑制GRP78基因表达能降低SKOV3细胞的侵袭力和迁移力,有望为抑制卵巢癌转移基因治疗提供新的靶点.     

慢病毒重组ACE2基因表达载体的构建及其感染人脐静脉内皮细胞的研究

目的构建携带血管紧张素转换酶2（ACE2）基因的慢病毒表达载体,观察其感染人脐静脉内皮细胞后ACE2基因的转录及表达水平。方法采用PCR技术从含有ACE2基因的质粒克隆模板pc—DNA3．1-hygro（＋）一mACE2上钓取ACE2基因,并将ACE2基因重组到慢病毒载体表达质粒pGC—FU中,构建重组慢病毒载体表达质粒pGC—FU—ACE2,通过酶切、测序验证ACE2基因后,将pGC—FU—ACE2质粒和包装质粒pHelper1．0、pHelper2．0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带ACE2基因的重组慢病毒Lentiviral—ACE2;然后感染人脐静脉内皮细胞,通过RT—PCR、Western—blot检测ACE2基因的转录和蛋白表达水平。结果成功构建携带ACE2基因的慢病毒表达载体Lentiviral—ACE2,并获得大量高纯度的慢病毒浓缩液。目的基因ACE2能被重组慢病毒高效地导入人脐静脉血管内皮细胞,并能高水平表达。结论慢病毒表达载体Lentiviral—ACE2成功构建并能高效率感染人脐静脉内皮细胞,为研究ACE2对血管内皮细胞的影响和更深入地探索ACE2基因的功能奠定了基础。     

HIF-1α基因RNA干扰质粒在胃癌细胞中的构建与鉴定

目的:构建转录因子HIF-1α表达的RNA干扰(RNA interference,RNAi)质粒,为研究HIF-1α参与的细胞信号通路及以HIF-1α为靶点的基因治疗提供稳定转染细胞的RNAi.方法:选取HIF-1α基因的19nt特异性序列,设计针对HIF-1α的shRNA序列,应用基因重组技术克隆到pSilencer1.0-U6表达载体中,利用EcoRⅠ和ApaⅠ双酶切和DNA测序鉴定重组克隆.低氧条件下,将包含HIF-1α基因RNAi序列的重组载体转染人胃癌细胞SGC-7901,转染48h后,收集细胞裂解液,Western blotting分析低氧条件下对照组与转染组HIF-1α蛋白的表达水平.结果:双酶切证实shRNA插入pSilencer1.0-U6质粒,DNA测序证实插入的序列正确;HIF-1α基因RNAi质粒转染胃癌细胞SGC-7901成功;Western blotting结果显示与空质粒对照组比转染组细胞HIF-1α表达下调.结论:成功构建人HIF-1α基因RNAi质粒,为研究HIF-1α参与的细胞信号通路提供了稳定转染细胞的干扰质粒.同时,阻断HIF-1α的信号通路将为肿瘤基因治疗提供一个较好的靶点,研究结果为以HIF-1α为靶向的基因治疗提供了有利工具.     

TGF-β1基因转染对大鼠树突状细胞生物学特性的影响

目的观察转化生长因子β1（TGF-β1）基因转染后对大鼠树突状细胞（DC）生物学特性的影响。方法将TGF-β1基因导入大鼠DC,G418筛选,检测转染细胞TGF-β1的表达及其生物学活性,并进行混合淋巴细胞反应（MLR）。结果TGF-β1基因转染的DC可以分泌TGF-β1,而且可特异性抑制血管内皮细胞,对T淋巴细胞的增殖有抑制作用。结论利用构建的TGF-β1表达质粒转染大鼠DC,转入的TGF-β1基因可以在DC内稳定表达,并且使DC的生物学特性发生相应的改变。     

ERβ重组质粒的构建及其在结肠癌细胞株Caco-2中的表达

目的:基因重组技术构建重组质粒pEGFP-C1ERβ并检测其在结肠癌细胞株Caco-2中的表达.方法:应用RT-PCR从人结肠癌手术患者正常切缘组织中分离、扩增目的基因片段,将所得cDNA定向克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,采用双酶切和测序分析鉴定插入基因的序列;脂质体介导重组质粒pEGFP-C1-ERβ瞬时转染Caco-2并上流式细胞仪分选,获得比较单一的转染细胞:分别采用RT-PCR、Western blot检测转染前后ERβ基因不同分子水平表达.结果:酶切鉴定和测序分析表明重组表达质粒pEGFP-C1-ERβ构建无误:RT-PCR和Western blot分析均表明,与转染空质粒pEGFP-C1组和空白对照组细胞相比,转染重组表达质粒pEGFP-C1-ERβ组细胞ERβ基因表达水平明显提高.结论:成功构建重组质粒pEGFP-C1-ERβ并在Caco-2细胞株中表达,为进一步研究ERβ如何通过雌激素受体通路调控下游靶基因表达和参与结肠癌表遗传学发生机制奠定了基础.     

应用RNA干扰技术体外抑制脂蛋白脂肪酶基因的表达

目的给探讨脂蛋白脂肪酶基因作为动脉粥样硬化基因治疗靶点提供实验基础.方法利用RNA干扰技术在细胞水平抑制脂蛋白脂肪酶基因的表达,根据人脂蛋白脂肪酶基因设计靶序列短发夹RNA,构建重组干扰质粒pSIREN-DNR-shRNA,将干扰质粒与人脂蛋白脂肪酶真核表达质粒pCDNA3-hLPL以脂质体方法共转染COS-7细胞,通过实时荧光定量聚合酶链反应、Western blot和活性检测等方法判断脂蛋白脂肪酶基因抑制的效果.结果转染干扰质粒的细胞中脂蛋白脂肪酶mRNA、蛋白表达以及酶活性均明显降低,抑制率可达70%以上.结论所选靶序列可以有效抑制细胞中脂蛋白脂肪酶基因的表达,为进一步的体内研究奠定了基础.     

VEGF-C基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建和表达

目的:利用质粒pSilencer3.1-H_1构建针对人血管内皮生长因子-C(VEGF-c)基因的表达载体,测序鉴定并观察在胃癌细胞中的表达.方法:根据质粒pSilencer3.1-H_1要求设计两对小干扰RNA靶序列,退火形成互补的双链,通过与线性化的pSilencer3.0-H_1相应位点连接、转化大肠杆菌,扩增、纯化得到所需质粒,酶切电泳及测序鉴定后转染胃癌细胞株SGC-7901,Western blot检测转染前后VEGF-C基因的蛋白表达.结果:经酶切和测序鉴定,针对VEGF-C基因的siRNA表达载体构建成功.转染胃癌细胞株SGC-7901后,Western blot检测显示VEGF-C基因蛋白表达明显降低,pSilencer3.1-VEGF-C1组抑制效果明显,其抑制率为81.2%,与阴性对照组相比差异具有显著性(P<0.05).结论:成功构建了针对人VEGF-C基因的siRNA表达载体和稳定转染的胃癌细胞株SGC-7901.     

STAT3靶向RNAi腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的 观察针对STAT3基因的RNAi腺病毒表达载体对大鼠神经胶质瘤细胞的干扰效果,为探索肿瘤基因治疗的新途径奠定基础.方法设计针对STAT3编码区的短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,克隆到PGEM-T中,构建重组体,再对重组质粒进行酶切鉴定,DNA测序分析后再克隆到穿梭质粒PDC316中,通过Lipofectamine2000的介导和腺病毒包装质粒PBHG共转染至人胚肾HEK293细胞株中,经同源重组后获得重组腺病毒rAD-STAT3,应用PCR鉴定重组腺病毒,空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒,以50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定病毒滴度.以阴性为对照,转染到大鼠神经胶质瘤(C6)细胞,Western印迹法检测STAT3蛋白质表达量的改变,RT-PCR法观察STAT3基因表达改变.结果酶切鉴定和测序分析均提示STAT3靶向RNAi病毒表达载体构建成功,阳性病毒载体转染后C6细胞STAT3基因表达及蛋白质表达均较阴性转染的对照组显著下降.结论 STAT3靶向RNAi腺病毒表达载体成功构建,并能有效抑制C6细胞中STAT3基因表达.