人血小板衍生生长因子B链基因酵母表达载体的构建

目的 构建带信号肽和不带信号肽的人血小板衍生生长因子B(PDGF-B)链基因酵母表达载体,探讨该基因在酵母中的表达效率和活性。方法 利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从人血管内皮细胞总RNA中扩增出PDGF-B的cDNA,克隆入pGEM-T载体,进行序列测定。进而克隆至酵母表达质粒pMETB和pMETαA并进行重组子双酶切鉴定。结果 扩增获得了含信号肽(578 bp)和不含信号肽(340 bp)的编码PDGF-B链基因;构建了PDGF-B的酵母表达载体pMETB-PDGFB₁,pMETαA-PDGFB₂。测序结果显示,重组载体中目的基因序列与GENE BANK公布的序列一致。结论 人血小板衍生生长因子B链基因酵母表达载体构建成功,为进一步在酵母中的高效表达奠定基础。     

细粒棘球蚴Eg95全长基因的克隆与在甲醇酵母中的表达

目的 了解我国新疆细粒棘球绦虫表膜蛋白Eg95的全长基因结构及尝试其在甲醇酵母中表达。方法 PCR从细粒棘球蚴头节DNA中扩增含有全长编码区序列(cds)的基因，克隆到T载体中测序。再亚克隆到pMETαA中，构建不带6个组氨酸标签的重组质粒，转化甲醇酵母，分析Eg95全长基因的表达。结果 成功扩增了细粒棘球蚴绦虫1262bp的Eg95全长基因，含有两个内含子，外显子核苷酸序列与Genbank中细粒棘球绦虫Eg95 cds完全—致，但扩增的基因与已知的其他Eg95全长基因存在差别。1μg重组质粒的表达盒转化甲酵酵母PMD16，获得了Eg95基因重组工程酵母10个，其中非同源重组子3个。甲酵诱导非同源重组酵母特异表达出了分子量约为17kDa与Eg95cds编码蛋白接近的蛋白。酵母培养上清SDS-PAGE未见该蛋白条带出现，表达的蛋白可能主要位于酵母表面。结论 克隆到Eg95属于—个基因家族的成员之—，其基因编码区高度保守，含有内含子的全长基因同样可在酵母中进行表达。     

卡介苗穿梭质粒pMSIFN-α2a的构建与鉴定

目的 构建分泌性表达IFN-α2a的卡介苗重组质粒。方法 分别以卡介苗（BCG）和IFN-α2a cDNA为模板，通过PCR扩增得到约117bp的BCG-Ag85B信号肽序列和495bp的IFN-α2a基因序列。将BCG-Ag85B信号肽序列与大肠杆菌．卡介苗穿梭表达载体pMV261重组，得到重组质粒pMS。再将IFN-α2a基因序列克隆至pMS中，得到重组质粒pMSIFN-α2a。结果 质粒pMSIFN-α2a用双酶切和PCR扩增及测序鉴定证实，克隆基因BCG-Ag85B和IFN-α2a正确插入载体pMV261。结论 重组质粒pMSIFN-α2a可望在BCG中分泌性表达细胞因子IFN-α2a，从而促进IFN-γ的释放，该质粒的构建成功为改造卡介苗、发展新型抗膀胱肿瘤疫苗奠定了基础。     

带信号肽人血管内皮生长因子基因VEGF121及VEGF165载体的克隆

目的 克隆及构建带信号肽人血管内皮生长因子基因VEGF121及VEGF165表达载体。方法 对正常引产胎儿肺组织的总RNA进行逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR），克隆入T载体，测定扩增片段序列，进而克隆入表达质粒pcDNA3.1^-,酶切鉴定重组子。结果 用一对引物（5′引物为-21-7bp,3′引物为554-576bp)可扩增出两个条带，短条带为VEGF121（487bp)，长条带经筛选可得到两个片段，一为正常的VEGF165（619bp)，另一个为新的VEGFmRNA“异常”剪切片段。测序结果显示，此“异常”剪切片段扩增长度为639bp，同样为VEGF165全长核苷酸席子邓列，但在VEGF165的第3种和4外显子之间插入了长度为20bp的片段，经序列检索发现20bp的插入序殓为滞留的第3内含子终末序列，含内含子剪切信号。结论 克隆出带信号肽人血管内皮生长因子基因VEGF121及VEGF165表达载体。同时在正常引产胎儿的肺组织中可能发现了一种新的VEGFmRNA可变剪切形式。     

带信号肽人血管内皮生长因子基因 VEGF121及VEGF165载体的克隆

目的克隆及构建带信号肽人血管内皮生长因子基因VEGF121及VEGF165表达载体.方法对正常引产胎儿肺组织的总RNA进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),克隆入T载体,测定扩增片段序列,进而克隆入表达质粒pcDNA3 1-,酶切鉴定重组子.结果用一对引物(5'引物为-21～7 bp,3'引物为554～576 bp)可扩增出两个条带,短条带为VEGF121(487 bp),长条带经筛选可得到两个片段,一为正常的VEGF165(619 bp),另一个为新的VEGF mRNA"异常"剪切片段测序结果显示,此"异常"剪切片段扩增长度为639 bp,同样为VEGF165全长核苷酸序列,但在VEGF165的第3和第4外显子之间插入了长度为20 bp的片段.经序列检索发现20 bp的插入序列为滞留的第3内含子终末序列,含内含子剪切信号.结论克隆出带信号肽人血管内皮生长因子基因VEGF121及VEGF165表达载体,同时在正常引产胎儿的肺组织中可能发现了一种新的VEGFmRNA可变剪切形式.     

卡介苗穿梭表达质粒pMSIL-2的构建及鉴定

目的 构建分泌性表达白介素(IL)-2的重组卡介苗(BCG)。方法 分别以BCG和IL-2cDNA为模板，通过PCR扩增得到约117bp的BCG抗原85B(BCG-Ag85B)信号肽序列和399bp的IL-2基因序列。将BCG-Ag85B信号肽序列克隆至大肠杆菌-BCG穿梭质粒pMV261，得到重组质粒pMS。再将IL-2基因克隆至pMS中，得到重组质粒pMSIL-2。结果 质粒pMSIL-2经双酶切和PCR扩增及测序鉴定证实，克隆基因BCG-Ag85B信号肽和IL-2正确插入载体pMV261。结论 重组质粒pMSIL-2可望在BCG中分泌性表达细胞因子IL-2，该质粒的构建成功为改造BCG、发展新型抗膀胱肿瘤疫苗奠定了基础。     

结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT—6基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的：构建分泌性表达结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT－6的重组卡介苗，方法：分别以卡介苗（BCG）和结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板。通过PCR扩增得到的117bp的BCGα抗原（α－Ag)信号肽序列和285bp的结核杆菌esat-6基因序列，将esat-6基因与大肠杆菌－卡介苗穿梭质粒载体pMV261重组，得到重组质粒pME,再将BCGα－Ag信号肽序列克隆至pME中，得到重组质粒pSME。结果：质粒pSME用双酶切和PCR扩增鉴定证实，克隆基因α-Ag信号肽序列和esat-6正确插入载体pMV261，结论：重组质粒pSME可望在BCG中分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白ESAT－6，该质粒的构建成功为改造卡介苗，发展新型结核病疫苗奠定了基础。     

结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT-6基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的　构建分泌性表达结核分枝杆菌抗原蛋白 ESAT- 6的重组卡介苗。方法　分别以卡介苗(BCG)和结核分枝杆菌 H37Rv株基因组 DNA为模板 ,通过 PCR扩增得到约 117bp的 BCGα抗原 (α- Ag)信号肽序列和 2 85 bp的结核杆菌 esat- 6基因序列。将 esat- 6基因与大肠杆菌 -卡介苗穿梭质粒载体 p MV2 6 1重组 ,得到重组质粒 p ME。再将 BCGα- Ag信号肽序列克隆至 p ME中 ,得到重组质粒 p SME。结果　质粒 p SME用双酶切和 PCR扩增鉴定证实 ,克隆基因 α- Ag信号肽序列和 esat- 6正确插入载体 p MV2 6 1。结论　重组质粒 p SME可望在 BCG中分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白 ESAT- 6 ,该质粒的构建成功为改造卡介苗、发展新型结核病疫苗奠定了基础     

啤酒酵母鲨烯合酶基因的克隆及其基因表达载体的构建

[目的] 克隆啤酒酵母鲨烯合酶基因及构建其基因表达载体,为在微生物体内重建青蒿素合成途径打下基础.[方法]采用聚合酶链反应(PCR)扩增、扩增片段与T-载体连接和克隆片段的序列分析;酶切并回收目的基因,反向插入酵母表达载体pGAPZαA,双酶切鉴定重组子.[结果] 通过PCR扩增获得1 335 bp片段,克隆后经PCR和酶切反应进行了鉴定.初步测序结果与GenBank上已登录的酵母鲨烯合酶基因序列基本吻合,相差仅数个碱基对;将此片段反向插入酵母表达载体pGAPZαA,构建了反义酵母表达载体,并通过双酶切加以鉴定.[结论] 成功克隆了啤酒酵母鲨烯合酶基因并进行了测序,同时构建了反义酵母表达载体.     

登革2型病毒全长NS1基因真核表达载体的构建及序列分析

目的克隆登革2型病毒(DEN2)全长NS1基因，构建NS1基因的真核表达重组质粒。方法用RT—PCR技术扩增DEN2(NGC株)全长的NSl基因序列，并定向克隆入pPICZαB的KpnⅠ／XbalⅠ位点，构建真核表达载体pPICZαB—NS1，转化E.coli DH5a菌。阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。结果阳性质粒经PCR及KpnⅠ／XbaⅠ双酶切获得了一个核苷酸长度为1134bp的基因；序列测定证实该基因与DEN2(NGC株AF038403)NS1基因序列有99％同源。结论成功构建了含有DEN2全长NS1基因的真核表达载体DPICZαB—NS1，为NS1的进一步酵母表达奠定了良好的基础。     

人重组血清白蛋白基因T载体和pET28a表达载体的构建及鉴定

目的构建重组人血清白蛋白(rHSA)表达基因的克隆载体及表达载体,为下一步的蛋白表达和构建rHSA融合基因打下基础。方法从人胎盘中提取总RNA,利用RT-PCR方法构建cDNA-mRNA杂交链,然后用人血清白蛋白表达基因的特异引物进行PCR,PCR产物回收后与T载体连接,经过转化、质粒酶切、测序等一系列手段对插入情况和序列是否正确进行鉴定。用另一组带有酶切位点的引物和pfu酶进行PCR,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切PCR回收片段及pET28a表达载体,二者经过连接、转化、质粒酶切、测序等手段重新鉴定序列是否正确。结果插入到T载体和pET28a载体中的序列为1 830 bp的带有24个氨基酸信号肽的基因片段,此序列和GenBank中公布的rHSA序列相一致,并显示在485、750、1 685等位点可能有等位基因多态性。结论从胎盘中提取mRNA后,利用RT-PCR构建的人血清白蛋白基因序列完全正确,为下一步的工作提供了基础。     

表达载体sHLA-A2-IgG1-Fc的构建与鉴定

目的构建表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2-IgGl-Fc,为进一步真核表达可溶性HLA-A2-IgG1-Fc蛋白奠定基础。方法从T2细胞中提取总RNA,借助RT-PCR技术扩增包括信号肽的可溶性HLA-A2的cDNA序列并把其插入真核表达载体pcDNA3.0,然后经酶切和测序法鉴定;用PCR的方法从含IgG1-Fc基因的PIG质粒中扩增目的基因IgG1-Fc段,然后经酶切后插入前面构建好的表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2中,最后经酶切和测序法鉴定。结果经酶切鉴定及测序分析,证实已将目的基因HLA-A2和IgG1-Fc片段插入载体pcDNA3.0。结论本研究成功构建表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2-IgG1-Fc。     

使用人粘附分子—2启动子的衰变加速因子重组基因表达载体的构建及意义

目的：构建含人粘附分子-2（ICAM-2）启动子的人衰变因子（DAF）重组基因的真核细胞表达载体,运用于转基因动物克服异种器官排斥的研究。方法：双酶切本室巳构建质粒pGEM-7Zf-DAF,得到含人ICAM-2启动子及DAFcDNA序列的插入片段（3.7Kb）;双酶切pcDNA3真核表达载体,得到不含病毒启动子、含筛选基因Neo的一段DNA作为载体序列（4.4Kb）;两段DNA进行连接反应后转化细菌;阳性转化菌落质粒抽提及酶切鉴定。根据人的ICAM-2启动子、DAFcDNA序列,设计引物行PCR特异扩增检验。结果：特异性3组酶切重组表达载体,产生符合设计的相应条带;PCR扩增出特异的318bp及1.7Kb的DNA片段,符合设计要求。结论：含人ICAM-2启动子的DAF重组基因表达载体获得成功。     

人端粒酶逆转录酶基因启动子区的克隆及其真核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶基因启动子区的真核表达载体。方法：用核酸内切酶NotⅠ和KpnⅠ酶切报告基因GFP,插入pcDNA3．1( )载体,得到pcDNA3．1( )-GFP(PG)载体;用PCR方法扩增hTERT基因ATG上游的启动子序列,测序后用核酸内切酶BglⅡ和KpnⅠ酶切插入PG载体,得到pcDNA3．1( )-GFP—hTERT(PGT)载体。将PGT载体转染人食管癌EC9706细胞系,经G418筛选,荧光显微镜下观察。结果：克隆得到的启动子序列与文献相符,重组载体经酶切鉴定方向正确,含有人端粒酶逆转录酶基因启动子序列。经转染人食管癌EC9706细胞系,在荧光显微镜下观察到绿色的阳性克隆。结论：克隆的人端粒酶逆转录酶基因启动子序列在真核细胞中具有启动子活性。     

人酸性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人酸性成纤维细胞生长因子真核表达载体pEGFP-N1-haFGF。方法 PCR扩增人酸性成纤维细胞生长因子（haFGF）基因,BglⅡ和HindⅢ双酶切后克隆入真核表达载体pEGFP-N1,构建haFGF真核表达载体pEGFP-N1-haFGF,并经限制性酶谱分析和DNA测序对重组表达载体的正确性进行鉴定。结果重组真核基因表达载体pEGFP-N1-haFGF经限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ酶切,DNA电泳显示465 bp的haFGF目的片段和4 700 bp的pEGFP-N1载体片段,重组载体经DNA测序显示所克隆的haFGF基因核苷酸顺序与Genbank中记载的haFGF序列一致。结论本实验成功构建人酸性成纤维细胞生长因子真核表达载体,为进一步研究haFGF的功能奠定基础。     

hTERT片段真核表达质粒的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的真核表达质粒,方法：从肿瘤组织中提取总RNA．采用RT—PCR法扩增hTERT基因并克隆人PGEM—T Easy载体中,然后再亚克隆于pcDNA3．1真核表达载体,用PCR扩增及限制性酶切法筛选重组真核表达质粒,并以DNA测序鉴定。结果：PCR扩增及限制性酶切法证实重组真核表达质粒的构建成功。测序表明,hTERT基因片段与GenBank公布的相应基因同源性比较,核苷酸序列的同源性为98．73％,氨基酸序列的同源性为99．68％。结论：成功构建了hTERT真核表达质粒,为进一步研究与hTERT相关的抗肿瘤免疫治疗奠定了基础。