MC3T3E1细胞分化过程中Cbfα1及相关基因的表达

目的 研究在小鼠前成骨细胞MC3T3E1诱导成骨过程中，总Cbfα1、Cbfα1两种亚型Cbfα1／P56、Cbfα1／P57及碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素、骨涎蛋白和骨桥素在前成骨细胞成熟过程中的变化。明确Cbfα1、Cbfα1亚型及相关基因表达与成骨细胞分化的关系，探求与成骨细胞成熟更密切相关的Cbfα1亚型，为进一步的Cbfα1亚型研究提供基础。方法 MC3T3E1细胞在含β-甘油磷酸钠，抗坏血酸的培养基中培养22d，在细胞培养的不同时间（0，4，10，14，18，22d），用α-磷酸奈酚法测定碱性磷酸酶（ALP）活性；VanGieSon苦味酸酸性复红染色法染色细胞Ⅰ型胶原；茜素红染色观察矿化结节形成；半定量RT-PCR检测总Cbfα1mRNA及Cbfα1／P56、Cbfα1／P57mRNA和Ⅰ型胶原、骨钙素、骨涎蛋白、骨桥索mRNA的表达；用Western-blot检测Cbfα1蛋白的表达。结果 MC3T3E1细胞在β-甘油磷酸钠存在的情况下，培养第18d开始出现矿化，第22dⅠ型胶原染色及茜素红染色均观察到明显矿化结节形成。随MC3T3E1细胞的分化，Cbfα1mRNA的表达量逐渐增高，Cbfα1／P57mRNA在第18和22d的表达量明显增高，Cbfα1／P56mRNA无变化。Cbfα1蛋白随MC3T3E1细胞的分化，表达量逐渐增高。同样，随MC3T3E1细胞分化，Ⅰ型胶原、骨钙素、骨桥素和骨涎蛋白mRNA的表达量逐渐增高。ALP活性0～10d逐渐增高，10d后逐渐下降。结论 在MC3T3E1细胞的分化过程中Ⅰ型胶原、骨钙素、骨涎蛋白、骨桥素mRNA随MC3T3E1细胞的分化表达逐渐增高。Cbfα1 mRNA及Cbfα1蛋白的表达随细胞的分化逐渐增高，与其他成骨特异性基因的变化趋势一致，并以Cbfα1／P57mRNA亚型为主。Cbfα1／P57亚型的表达与成骨分化的关系更密切，在进一步的与成骨细胞分化有关的Cbfα1亚型研究应以Cbfα1／P57亚型为主。     

高镁对高磷诱导血管钙化的影响及其机制

目的 探讨高镁对高磷诱导血管钙化的影响及其可能的机制.方法 体外原代培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs),用β甘油磷酸盐(β-GP)诱导钙化.VSMCs细胞被分为4组:对照组、高磷组(10 mmol/L β-GP)、镁干预组(10 mmol/L β-GP+3 mmol/LMgSO4)、镁通道抑制剂(2-APB)干预组(10 mmol/L β-GP+3 mmol/L MgSO4+10-4 mol/L 2-APB).采用茜素红染色及邻甲酚酞络合酮比色法检测细胞钙化情况;酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞碱性磷酸酶(ALP)活性;RT-PCR法和Western印迹法检测细胞核心结合因子α-1(Cbfα-1)的表达.24只雄性SD大鼠被随机分为3组:对照组(甲基纤维素灌胃+高磷饮食)、血管钙化组(硫酸腺嘌呤灌胃+高磷饮食)、高镁干预组(硫酸腺嘌呤灌胃+高磷高镁饮食).造模成功后测定大鼠主动脉脉搏波速率(PWV);采用yon Kossa染色及邻甲酚酞络合酮比色法检测胸主动脉钙化情况;免疫组织化学方法检测胸主动脉Cbfα-1表达.结果 细胞培养14 d后,与高磷组相比,镁干预组VSMCs钙盐沉积明显减少,ALP活性降低(P＜0.05),Cbfα-1表达下调;2-APB可抑制高镁对VSMCs的保护性作用.Cbfα-1的动态观察结果显示,镁干预组第3天Cbfα-1的表达下调(P＜0.05),其抑制效应随时间延长呈增强趋势.体内实验中,大鼠慢性肾衰竭血管钙化模型制备成功.和体外实验一致,与血管钙化组相比,高镁干预组大鼠血浆镁离子水平明显升高,胸主动脉PWV明显降低(P＜0.05),血管钙盐沉积程度亦明显减轻.免疫组织化学结果显示高镁可明显降低高磷诱导的Cbfα-1表达(P＜0.05).结论 高镁可抑制血管钙化,其机制可能与其抑制VSMCs骨源性分化相关.     

核心结合因子α1促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的观察核心结合因子α1(core binding factor α1,Cbfα1)对兔骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)的促成骨效应.方法体外分离培养日本大白兔MSCs,按培养方法的不同分为3组.对照组:常规培养;单纯诱导组:以条件培养液(低糖DMEM 10%胎牛血清 10 mmol/L地塞米松 50 mg/L维生素C 10 mmol/L β-甘油磷酸钠)培养;实验组:以AdEasy1/Cbfα1转染MSCs,加入条件培养液培养.在诱导3 d,1、2、3和4周时,行组织学观察和免疫组织化学等方法检测成骨标志碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和骨钙素的表达.结果体外培养兔MSCs生长良好,实验组AdEasy1/Cbfα1转染后90%以上MSCs表达绿色荧光蛋白.实验组及单纯诱导组ALP染色呈棕黑色阳性,随培养时间延长逐渐加深,对照组仅少量散在细胞ALP呈弱阳性;第1、2、3和4周实验组ALP浓度与单纯诱导组及对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).实验组及单纯诱导组从2周开始有红色的阳性染色矿化结节出现,对照组为阴性,结节数目随时间推移而增多.实验组及单纯诱导组1周时有少量骨钙素染色阳性,2、3及4周时大量出现,对照组为阴性.结论应用Cbfα1可促进兔MSCs向成骨细胞分化,其分子机制仍需进一步深入研究.     

核心结合因子α1过表达促进脂肪组织来源干细胞向成骨细胞分化

目的 检测核心结合因子α1(Cbfα1)的特异性成骨作用以及脂肪组织来源干细胞的成骨分化潜能.方法 采用Cbfα1重组的腺病毒载体感染脂肪来源干细胞,通过间接免疫荧光的方法检测脂肪来源干细胞中Cbfα1的表达.Cbfα1转染脂肪组织来源干细胞后1、3、7 d利用RT-PCR检测成骨特异性基因和成脂特异性基因的表达变化.同时通过检测Cbfα1转染后7、10 d脂肪来源干细胞碱性磷酸酶活性的变化,观察Cbfα1过表达后诱导脂肪组织来源干细胞向成骨细胞分化.结果 转染后脂肪组织来源干细胞细胞数目增长一倍.在特定诱导条件下,可向成脂细胞、成骨细胞分化.Cbfα1重组的腺病毒载体对脂肪组织来源干细胞的转染效率为82.4%.转染后第1、3、7天脂肪组织来源干细胞中骨钙素、骨桥素、Ⅰ型胶原的表达增强;脂蛋白脂酶的表达逐渐下降.转染Cbfα1后,脂肪组织来源干细胞中碱性磷酸酶活性显著增加.结论 核心结合因子过表达促进脂肪组织来源干细胞向成骨细胞分化、抑制成脂分化.     

糖皮质激素诱导骨细胞脂肪化与股骨头坏死的病理机制研究

目的 探讨糖皮质激素(glucocorticoids,GCs)诱导股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)的发病机制.方法 收集激素性ONFH及骨关节炎患者股骨头离体标本,采用免疫组化染色观察两组成骨转录分化因子Runx2和成脂转录分化因子PPAR-γ表达.大鼠颅骨源性成骨细胞在地塞米松作用下培养,茜素红矿化结节染色,油红“O”染色,RT-PCR检测Runx2 、PPAR-γ、OCN 、Col Ⅰ基因转录水平表达,免疫组织化学染色Runx2和PPAR-γ表达.激素法建立大鼠ONFH模型并确认建模成功,油红“O”染色脂肪细胞,免疫组化染色观察两组Runx2和PPAR-γ表达.结果 与骨关节炎比较,ONFH患者股骨头骨小梁间隙大量脂肪细胞聚集,并且脂肪细胞体积增大,Runx2表达显著下调,PPAR-γ表达上调.大剂量GCs作用下成骨细胞分化过程中未见茜素红矿化结节,油红“O”染色脂肪细胞,RT-PCR检测基因Runx2、OCN 、Col Ⅰ表达下调,PPAR-γ基因表达上调.大鼠ONFH模型股骨头骨小梁间隙脂肪细胞积聚、增大,Runx2表达下调,PPAR-γ表达上调.结论 大剂量GCs作用下,PPAR-γ表达上调、Runx2表达下调,调控骨髓基质细胞向脂肪细胞分化并促进成骨细胞、骨细胞转分化为脂肪细胞,同时抑制成骨细胞的分化、成熟及活性表达,可能是GCs诱发ONFH的主要病理生理机制之一.     

塞来昔布抑制骨髓间充质干细胞的增殖和成骨诱导分化

目的 探讨非甾体类抗炎药塞来昔布对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)增殖和分化成骨的影响.方法 骨髓取自1名健康男性,采用Ficoll-Paque密度梯度离心分离hBMSCs,并进行体外扩增.在细胞增殖和诱导过程中加入不同浓度(12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L)的塞来昔布,采用细胞计数试剂盒(CCK8)方法测定塞来昔布对hBMSCs增殖的影响.使用地塞米松、维生素C等试剂诱导hBMSCs分化成骨,在hBMSCs成骨过程中加入100 μmol/L塞来昔布,通过碱性磷酸酶(ALP)活性分析、钙定量分析等方法测定塞来昔布对hBMSCs成骨的影响,通过Western blot方法检测塞来昔布对hBMSCs分化成骨关键转录因子Runx2表达的影响.结果 塞来昔布的作用呈现剂量依赖性.12.5～100.0 μmol/L塞来昔布对hBMSCs细胞增殖均有抑制作用,该作用随着药物浓度的增加而增强.大剂量的塞来昔布抑制hBMSCs分化成骨中的碱性磷酸酶和钙沉积,并抑制转录因子Runx2的表达.结论 塞来昔布抑制hBMSCs增殖和成骨分化,并与剂量成正相关.长时间使用,尤其是大剂量使用塞来昔布的患者应考虑到其对成骨分化的抑制作用.     

唑来膦酸对小鼠胚胎成骨细胞增殖和分化的影响

目的研究唑来膦酸对小鼠胚胎成骨细胞体外增殖和成骨分化的影响。方法将小鼠胚胎成骨细胞体外传代培养,使用含不同浓度（1.0、0.1μmol/L）唑来膦酸的成骨诱导培养基干预细胞,不含唑来膦酸的培养基作对照,培养1、3、5 d采用CCK-8试剂盒检测唑来膦酸对成骨细胞增殖的影响;培养14 d行碱性磷酸酶（ALP）染色;培养21 d行茜素红染色;培养7 d,实时定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测转录因子Runx2、成骨标志物Ⅰ型胶原（Collagen TypeⅠ）、ALP、骨钙素（OCN）基因的表达,免疫印迹法（Western Blotting）检测转录因子Runx2蛋白的表达。结果不同浓度的唑来膦酸干预细胞后,CCK-8实验检测吸光度值随天数增加而升高,各组之间差异无统计学意义（P〉0.05）。随着唑来膦酸浓度的升高,ALP染色和茜素红染色逐渐变浅,Runx2、Collagen TypeⅠ、ALP、OCN基因的表达量降低,Runx2蛋白的表达量降低,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论唑来膦酸在选定浓度（1.0、0.1μmol/L）下不影响成骨细胞的增殖,但对其分化功能的抑制作用随着浓度的增加而增强。     

高铁培养环境对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化的影响

目的 观察高铁培养环境下小鼠前成骨样细胞MC3T3-E1增殖、分化指标的变化趋势,探讨铁离子对 成骨细胞增殖、分化的影响。方法 小鼠前成骨样细胞MC3T3-E1在37℃条件下体外培养,在10mmol/Lβ-甘 油磷酸和50μg /mL抗坏血酸的诱导分化的作用下,分化为成骨细胞,同时用不同浓度(50、100、 200μmol/L)枸橼酸铁铵(FAC)干预,用MTT法检测细胞的增殖活性,RT-PCR法检测成骨细胞分化基因成骨 相关转录因子(Runx2) 、锌指结构转录因子(Osterix) 、骨唾液酸蛋白(BSP)和骨钙素(OC)的表达,碱性 磷酸酶(ALP)活性试剂盒检测细胞碱性磷酸酶活性。结果 MC3T3-E1细胞的增殖活性、成骨分化相关基因的 表达以及ALP水平随FAC干预浓度的增加呈剂量依赖性降低(P<0.05)。结论 高铁培养环境可明显抑制小鼠 前成骨样细胞MC3T3-E1的增殖和分化。     

小剂量阿司匹林对去势大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

[目的]检测不同浓度低剂量阿司匹林对去势后(OVX)大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响.[方法]建立SD大鼠去势模型,全骨髓贴壁法培养骨髓基质干细胞(BMSCs),传代4次后进行成骨诱导,建立对照组和不同浓度阿司匹林组(0.25、0.5、1、2及5mmol/L).于不同的培养时间点,倒置显微镜观察并进行MTT检测细胞增殖生长情况;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测培养细胞上清ALP活性;于诱导7d和21d时分别行细胞碱性磷酸酶染色和茜素红钙化结节染色.[结果]阿司匹林无明显促进BMSCs增殖作用,而大剂量阿司匹林(5 mmol/L)具有抑制BMSCs增殖作用.实验组(0.25、0.5、1、2 mmol/L阿司匹林组)细胞培养上清中ALP浓度较对照组显著增强(P＜0.05);碱性磷酸酶染色(1、2 mmol/L组)阳性表达增强;茜素红染色显示,实验组(0.5、1、2mmol/L组)钙结节数量、钙化面积均高于对照组(P＜0.05).[结论]阿司匹林不能直接促进去势大鼠BMSC增殖活性,但小剂量阿司匹林可显著提高体外培养BMSC成骨活性,增强钙盐沉积,促进钙结节形成.     

水蛭素通过上调VEGF/Notch1信号通路促进人骨髓间充质干细胞成骨分化

摘要：目的 观察水蛭素对人骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）成骨分化的影响。方法 BMSCs细胞分为正常培养的对照组、成骨诱导的诱导组以及加入不同浓度（1、10、20 ATU/mL）处理的水蛭素组。MTT检测细胞增值并筛选水蛭素最适作用浓度。流式细胞仪检测细胞凋亡。RT-PCR和Western blot分别检测成骨基因Runx2、Osterix、COL1A1的mRNA和蛋白表达。BCIP/NBT染色法检测细胞中的碱性磷酸酶水平。茜素红染色检测矿化结节。检测VEGF、Notch1、Jagged1和CBF1的mRNA和蛋白表达。结果 骨髓间充质干细胞经成骨诱导细胞增殖显著增加,中高浓度的水蛭素可以不同程度促进成骨诱导的BMSCs细胞增殖（P＜0.05）,并筛选出20 ATU/mL作为水蛭素的使用浓度。水蛭素抑制成骨诱导的BMSCs细胞凋亡,上调Runx2、Osterix、COL1A1的mRNA和蛋白表达,增加碱性磷酸酶水平,促进细胞中矿化结节的生成,并提升BMSCs细胞中VEGF、Notch1、Jagged1和CBF1的表达（P＜0.05）。结论 水蛭素可能通过上调VEGF/Notch1信号通路促进人骨髓间充质干细胞成骨分化。     

瘦素对hBMSCs成骨分化的作用及机制研究

目的 探讨瘦素(leptin,LEP)对hBMSCs成骨分化的作用及机制. 方法 采用全骨髓法培养hBMSCs,取第3代hBMSCs分为A、B、C、D、E、F组,待细胞贴壁后各组分别加入400、200、100、50 ng/mL LEP、100 ng/mL BMP和普通培养基2 mL进行培养.于培养后7 d行ALP染色、21 d行矿化结节染色,倒置相差显微镜观察染色结果 ;并于培养后7、14、21 d,检测各组ALP活性、骨钙素(osteocalcin,OCN)水平,筛选LEP的最佳诱导浓度;B、E、F组细胞培养7 d后,采用RT-PCR检测成骨相关基因:核心结合因子(core-binding factor α1,Cbfα1)、ALP、Col Ⅰ、OCN mRNA的表达. 结果 诱导培养7 d,ALP染色结果 显示,A、B、C、D、E组细胞胞浆均呈蓝色阳性着色,F组呈弱阳性;诱导培养21 d,矿化结节染色结果 显示,A、B、C、D、E组细胞染色呈阳性,F组呈阴性.B组培养后7、14、21 d,ALP、OCN活性低于E组,但显著高于其余各组,差异均有统计学意义(P<0.05),200 ng/mL LEP为最佳浓度.B、E、F组细胞培养7d,F组Cbfα1、ALP、Col Ⅰ、OCNmRNA均不表达;B、E组各产物mRNA均有表达,但B组低于E组. 结论 LEP可促进hBMSCs成骨分化,其机制可能为LEP促进了成骨相关基因的表达.     

吡格列酮对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的体外观察葡萄糖与吡格列酮（PIO）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）向成骨细胞（OB）分化的影响,探讨二者对骨代谢的作用机制。方法从大鼠长骨骨髓分离获取间充质干细胞,在不同糖浓度（5.6、25、50mmol.L-1）与PIO（0.1μg.mL-1）干预下向成骨细胞诱导分化培养21d;茜素红染色、光镜计数矿化率;realtime PCR测定OB的标记物碱性磷酸酶（ALP）,骨钙素（BGP）及转录因子Runx2 mRNA表达,进行不同糖浓度组间及PIO干预后的变化比较。结果随糖浓度升高,矿化率显著降低,与对照组（5.6mmol.L-1）相比,25mmol.L-1糖浓度组降低了21%,50mmol.L-1糖浓度组降低了55%,差异均有显著性（P〈0.01）;ALP、BGP、Runx2 mRNA表达也均降低,与对照组（5.6mmol.L-1）相比,25mmol.L-1组的ALP、BGP、Runx2 mRNA表达分别降低了21%、12%、15%,差异均有显著性（P〈0.05）;50mmol.L-1组的ALP、BGP及Runx2 mRNA表达下降也具有显著性（P〈0.05）。在3种糖浓度下,与相应组未加PIO相比,PIO干预组,矿化率明显降低,分别降低了20%、25%、25%,差异均有显著性（P〈0.05）;ALP,BGP及Runx2 mRNA表达水平也显著降低（P〈0.01）。结论高糖抑制BMSCs向OB分化,可能为糖尿病性骨质疏松形成的重要机制之一;在高糖条件下,PIO干预可加强抑制BMSCs向OB分化,这也可能是PIO致骨质疏松的重要机制。     

秦皮乙素促进成骨细胞分化延缓增龄性骨质疏松的研究

目的探讨秦皮乙素对成骨细胞分化的调控及对增龄性骨质疏松症的治疗作用。方法取7月龄C57BL/6小鼠随机分为对照组、秦皮乙素200 mg/kg组与秦皮乙素400 mg/kg组,分别灌胃给予生理盐水与秦皮乙素。给药3个月后取材,X射线检测小鼠胫骨骨密度,q PCR检测成骨细胞分化标记基因表达,成骨诱导液诱导28 d后茜素红染色检测成骨细胞矿化结节形成能力,胫骨组织HE染色观察骨组织形态。结果 10月龄时灌胃给予200 mg/kg秦皮乙素的小鼠胫骨骨密度略高于对照组,而灌胃给予400 mg/kg秦皮乙素的小鼠胫骨骨密度明显高于对照组。HE染色结果同样显示400 mg/kg组小鼠骨小梁显著多于对照组。成骨诱导分化与茜素红染色结果显示,秦皮乙素400 mg/kg组骨髓来源间充质干细胞矿化结节形成能力增强。q PCR结果表明秦皮乙素剂量依赖地促进成骨细胞分化标记基因碱性磷酸酶、骨涎蛋白、Col1与Runx2的表达,同时发现经典Wnt信号关键基因Dkk1与Lef1表达也明显升高。结论秦皮乙素促进成骨细胞分化能力,进一步延缓增龄性骨质疏松症,其可能与调控经典Wnt信号相关。     

高镁离子浓度对人骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的影响

背景:许多研究对镁合金浸提液的生物学作用进行了体外研究,但浸提液中pH值升高、钙离子浓度下降等变化会在体内体液缓冲系统作用下被减弱。目的:探讨不同浓度的高镁离子环境对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)增殖与成骨分化的影响。方法:按照ISO-10993标准制作镁及几种常用镁合金浸提液,应用电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)测定浸提液中镁离子含量。根据浸提液镁离子含量,配置镁离子最终浓度为2、4、6、8、10 mmol/L的完全培养基及成骨分化诱导培养基,未添加镁离子培养基作为对照组,使用以上培养基对hBMSCs进行培养。细胞在完全培养基组中培养1、3、6、12 d后,利用CCK-8实验评价细胞增殖率。成骨分化诱导培养基组培养细胞7、14 d后测定碱性磷酸酶活性,同时进行碱性磷酸酶染色,在培养第21天进行茜素红染色,并在溶解后进行半定量分析。上述细胞实验每组设置6个复孔。结果:镁及几种常用镁合金浸提液镁离子浓度在3~6 mmol/L之间。高镁离子环境培养1天后,2、4、6、8、10 mmol/L组hBMSCs相对增殖率均显著下降(77.5%±11.7%、78.2%±12.3%、71.5%±12.3%、73.8%±7.3%、81.6%±8.4%,P<0.05)。但培养第12天时,2、4、6 mmol/L组出现了对hBMSCs细胞增殖的促进效果(195.6%±36.5%、292.6%±52.6%、296.3%±52.1%,P<0.01)。培养过程中仅在第6天,8 mmol/L组(81.2%±20.8%,P=0.576)和10 mmol/L组(91.1%±17.5%,P=0.968)细胞增殖率出现下降,但差异无统计学意义。培养第7天时,2、4、10 mmol/L组碱性磷酸酶活性较对照组均显著提高(P<0.05)。培养至第14天时,2、4、6、8、10 mmol/L组碱性磷酸酶活性是对照组3倍以上(P<0.01)。茜素红染色及溶解后半定量分析提示2~10 mmol/L的细胞外高镁离子环境阻挡了细胞外基质矿化(P<0.01)。结论:2~10 mmol/L浓度的镁离子环境未对hBMSCs体现出显著细胞毒性,且适当的高镁离子浓度有利于hBMSCs增殖及成骨分化,但细胞外高镁离子浓度不利于细胞外基质矿化。     

成骨细胞特异性钙黏蛋白基因转染对人骨髓基质干细胞成骨分化影响的研究

目的 观测成骨细胞特异性钙黏蛋白(Cad-Ⅱ)基因转染对人骨髓基质干细胞(hBMSCs)成骨分化的影响. 方法把脂质体介导的Cad-Ⅱ cDNA转染体外分离培养的hBMSCs,检测Cad-Ⅱ蛋白表达变化,并对比观测转染组和单纯成骨诱导组在培养3,7、14、21 d时,hBMSCs碱性磷酸酶(ALP)和骨钙索的表达变化. 结果 转染组和成骨诱导组3 d后开始有ALP的阳性染色,呈棕黑色,7 d开始有骨钙索的阳性染色并随培养时间延长逐渐增多,但各时间点转染组ALP浓度(P=0.008)和骨钙素染色阳性数(P=0.023)均显著高于单纯成骨诱导组.转染组和成骨诱导组从14 d后开始有红色的刚件染色矿化结节出现,结节数目随时间推移而增多. 结论 Cad-Ⅱ基因转染可促进hBMSCs向成骨细胞的分化.     

膝关节滑膜间质干细胞分离、培养及其多向分化潜能特性的研究

目的 探讨晚期骨关节炎患者膝关节滑膜间质干细胞(synovium-derived mesenchymalstem cells,SMSCs)体外分离、培养的可行性及其在体外向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞定向分化的特性.方法 取膝关节滑膜组织,胶原酶消化获得有核细胞.挑选单细胞克隆,筛选获得SMSCs.流式细胞技术检测细胞表面特异性抗原标志.培养至第三代,分别向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞诱导分化.油红O染色鉴定向脂肪细胞分化;碱性磷酸酶染色、茜素红染色鉴定向成骨细胞分化;甲苯胺蓝染色鉴定向软骨细胞分化.RT-PCR检测脂肪细胞、成骨细胞标志基因.Ⅱ型胶原免疫组化染色检测软骨细胞Ⅱ型胶原的表达.结果 原代SMSCs体外培养呈葵花样细胞集落,传代后可见圆形巨噬样细胞和纺锤形成纤维样细胞,融合后呈成纤维细胞样生长.CD44、CD90呈阳性,CD34、CD71和CD45呈阴性.向脂肪细胞诱导21d,油红O染色阳性;RT-PCR检测有脂蛋白酶、乙二腈及PPARγ2表达;向成骨细胞诱导7、28 d,ALP,茜素红染色阳性,有ALP、Osteopontin及Osteocalcin表达;向软骨细胞诱导21d,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性.结论 晚期骨关节炎患者膝关节滑膜组织可以分离、培养获得SMSCs. SMSCs具有向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞发生定向分化的潜能.     

辛伐他汀促进大鼠骨髓基质细胞的成骨分化

目的观察辛伐他汀体内给药对去卵巢大鼠骨髓基质细胞(BMSC)增殖和分化的影响,探讨辛伐他汀的成骨作用机制.方法24只12周龄雌性SD大鼠随机分成4组,每组6只假手术组(G1)和去卵巢组(G2)每天蒸馏水灌胃;去卵巢大鼠10mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃(G3);去卵巢大鼠20mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃(G4).实验持续4周,第29天处死所有大鼠取骨髓细胞培养.用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测成骨细胞的增殖能力;细胞培养第14天用半定量RT-PCR和western blot检测Runx2/Cbfal mRNA和蛋白的表达、第16天检测碱性磷酸酶活性(ALP)和第21天检测茜素红染色.结果辛伐他汀不能促进去卵巢大鼠成骨细胞增殖.G3组和G4组的Runx 2/Cbfa1 mRNA表达水平和ALP活性都显著高于G2组,给药两组之间无显著差别.G4组的Runx 2/Cbfal蛋白表达水平比G2组和G3组显著增加,G2组与G3组无明显差别.茜素红染色表明辛伐他汀能促进成骨细胞的矿化能力,两种剂量组之间无明显差别.结论辛伐他汀体内给药能够促进去卵巢大鼠BMSC向成骨细胞分化,但是不能促进细胞增殖.     

去卵巢对大鼠颌骨成骨细胞增殖与成骨分化能力的影响

目的探讨去卵巢对大鼠颌骨成骨细胞增殖与成骨分化能力的影响。方法建立去卵巢大鼠骨质疏松模型,分离培养假手术组和去卵巢组颌骨成骨细胞并进行形态学观察。采用CCK-8法检测假手术组和去卵巢组大鼠颌骨成骨细胞的增殖能力差异。通过碱性磷酸酶染色与活性测定、矿化结节茜素红染色与定量、成骨相关基因及蛋白表达检测,探讨去卵巢对大鼠颌骨成骨细胞增殖及成骨分化能力的影响。结果假手术组和去卵巢组大鼠均可成功分离培养颌骨成骨细胞,两组细胞均可贴壁生长,细胞形态未见显著差异。与假手术组相比,去卵巢大鼠颌骨成骨细胞的增殖能力,碱性磷酸酶染色与活性均显著增高;但去卵巢大鼠颌骨成骨细胞的Runx2和OC在mRNA与蛋白水平的表达上及体外矿化结节形成能力方面皆显著低于假手术组。结论去卵巢可影响大鼠颌骨成骨细胞的增殖与成骨分化能力,研究结果将为探讨颌面部骨组织骨质疏松的发病机制与防治提供实验依据。     

健骨颗粒含药血清调控miR-141对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的观察健骨颗粒含药血清对去卵巢模型小鼠BMSCs成骨分化的影响,并研究其调控miR-141影响BMSCs分化的可能机制。方法流式细胞计数法鉴定BMSCs;含药血清和空白血清分别干预体外培养的BMSCs;显微镜下观察细胞形态结构,碱性磷酸酶染色、定量检测,茜素红染色;RT-PCR检测miR-141及DLx5、Msx2、Runx2的基因表达情况;Western blot检测DLx5、Msx2及Runx2的蛋白表达情况。结果流式细胞计数法鉴定提取细胞符合实验要求;镜下观察发现两组细胞有差异,含药血清组细胞群落间结晶更为密集;ALP染色及定量、茜素红染色结果含药血清组均优于空白血清组;RT-PCR检测Dlx5、Msx2、Runx2及miR-141的基因表达结果:含药血清组miR-141和Msx2基因表达较空白血清组显著降低(P<0.01),而Dlx5、Runx2的基因表达显著升高(P<0.01);Western blot检测DLx5、Msx2、Runx2的蛋白表达结果:含药血清组较空白血清组相比,Msx2的蛋白表达略微下降(P<0.05),而Dlx5、Runx2的蛋白表达相对升高(P<0.01)。结论健骨颗粒可以调低miR-141的表达,进而调高Dlx5的表达,削弱Dlx5的同源异形基因Msx2对Runx2抑制作用,通过miR-141调控Dlx5/Msx2/Runx2信号通路促进BMSCs成骨分化达到预防和治疗绝经后骨质疏松的目的。     

体外冲击波对早中期股骨头坏死患者骨髓间质干细胞生物学特性的影响

目的 观察体外冲击波(extracorporeal shock wave,ESW)对早中期股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)患者骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨及成脂相关基因表达的影响.方法 取ONFH患者自愿捐赠的骨髓.体外分离并传代培养MSCs.将P_3代MSCs分为A组(干预组)和B组(对照组);细胞计数试剂盒检测P_3代MSCs不同时间点增殖差异;酶细胞化学和茜素红染色检测P_3代MSCs碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)含量和P_7代MSCs胞外基质矿化程度的差异;RT-PCR检测不同时间点骨钙素(osteocalcin,OC)、核心结合因子α1(core-binding factor alpha 1,Cbfα1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)表达量的差异.结果 A组各时间点(不含第1天)细胞增殖速度均明显强于B组;ALP含量(不含第3天)A组总体水平明显高于B组;茜素红染色示A组矿化结节数为(6.0±1.0)个/视野,B组始终为阴性;Cbfα1在成骨分化的整个过程中均持续表达,A组在各时间点(不含第3天)均明显强于B组;A组OC在各时间点(不舍第3、6天)均明显强于B组;PPARγ在成骨分化的整个过程中均持续表达.A组在各时间点(不含第3天)均明显弱于B组.结论 适当强度的ESW能够促进MSCs增殖,诱导MSCs向成骨细胞方向分化并抑制MSCs向成脂细胞方向分化是其治疗ONFH的有效机制.