IFN-α通过IFI16抑制人脑血管外膜成纤维细胞增殖并促进细胞凋亡

目的:探讨干扰素-α(IFN-α)是否通过诱导干扰素诱导蛋白16(IFI16)表达抑制人脑血管外膜成纤维细胞(HBVAFs)增殖与促进细胞凋亡。方法:应用转染针对IFI16基因的小干扰RNA(siRNA)和/或IFN-α瞬时干预体外培养的HBVAFs。通过蛋白免疫印迹(Western blot)法和Real-time PCR法测定细胞中IFI16、P53、P21蛋白和mRNA表达水平的变化。用MTT法检测细胞活力,流式细胞术测定细胞周期及凋亡。结果:与未干预组比较,IFN-α(2 000~5 000 kU/L)干预HBVAFs后,IFI16蛋白表达水平明显上调,但不同浓度IFN-α组之间无统计学差异。使用2 000 kU/L IFN-α可诱导HBVAFs中P53及P21蛋白和mRNA表达水平上调,同时抑制细胞增殖与促进细胞凋亡。但在转染了IFI16 siRNA的HBVAFs中IFN-α的上述作用受到了抑制。结论:IFN-α抑制HBVAFs增殖与促进其凋亡的作用可能部分与其诱导IFI16表达有关。     

干扰素诱导蛋白p204表达变化对大鼠血管平滑肌细胞增殖及p21表达的影响

目的: 观察干扰素诱导蛋白p204对鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖及p21表达的影响,探讨p204在VSMCs增殖调控中的作用及可能机制。方法: 应用干扰素 α(IFN-α)处理和p204基因( Ifi204 )的小干扰RNA(siRNA)瞬时干预体外培养的VSMCs,用MTT法测定细胞活力反映细胞增殖,流式细胞仪分析细胞周期,用半定量RT-PCR 法和Western blotting 分别检测p204和p21的mRNA和蛋白表达。结果: IFN-α可诱导鼠VSMCs p204 mRNA和蛋白表达上调,降低VSMCs细胞活力和细胞周期G₁/S转换,伴p21 mRNA和蛋白表达上调。转染 Ifi204 siRNA可抑制p204和p21表达,提高VSMCs细胞活力和促进细胞周期G₁/S转换。结论: p204表达可抑制鼠VSMCs的增殖,该效应可能与激活p21表达有关。     

干扰素诱导蛋白p204对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及其机制

目的: 研究干扰素诱导蛋白p204对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响并探讨其可能的机制。方法: 应用干扰素α(IFN-α)和p204基因(Ifi204)的小干扰RNA(siRNA)瞬时干预体外培养的VSMCs,用MTT法测定细胞活力反映细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期,用实时 qRT-PCR法和Western blotting 分别检测mRNA和蛋白表达。结果: IFN-α可诱导大鼠VSMCs p204 mRNA和蛋白表达上调,抑制VSMCs细胞活力和细胞周期G₁/S转换,伴Ras蛋白表达减少,Raf和ERK磷酸化水平下降。转染Ifi204 siRNA可抑制p204表达,提高VSMCs细胞活力和促进细胞周期G₁/S转换,伴Ras蛋白表达增多,Raf和ERK磷酸化水平升高。结论: p204表达可抑制鼠VSMCs的增殖,该效应可能与p204抑制Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的激活有关。     

干扰素α通过P204和P21诱导大鼠原代血管平滑肌细胞凋亡

目的 探讨干扰素-α(IFN-α)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡的影响.方法 应用转染IFI204 siRNA和/或IFN-α瞬时干预体外培养的大鼠VSMCs,以非特异性siRNA转染组为对照组,RT-PCR法检测P204及P21mRNA表达,Western blot检测P204及P21蛋白表达,流式细胞仪Annexin-V FITC/PI法检测细胞凋亡.结果 与对照组比较,IFN-α组P204 mRNA和蛋白表达上调(P＜0.01),细胞凋亡增多(P＜0.01),伴P21 mRNA和蛋白表达增多(P＜0.01);IFI204 siRNA转染组P204 mRNA和蛋白表达下调(P＜0.01),细胞凋亡减少(P＜0.01),P21mRNA和蛋白表达减少(P＜0.01);转染IFI204 siRNA后再加IFN-α干预,P204 mRNA及蛋白表达下调(P＜0.01),但P21 mRNA及蛋白表达增多(P＜0.01),促进细胞凋亡(P＜0.01).结论 P204及P21参与IFN-α诱导大鼠VSMCs凋亡过程的调控.     

下调HIF-2α基因对低氧诱导的肝癌细胞体外生物学行为的影响

目的:探讨下调缺氧诱导因子2α(Hypoxia-inducible factor 2α,HIF-2α)基因对人肝癌细胞株HepG2 低氧状态下增殖、凋亡、细胞周期分布和迁移侵袭力的影响。方法:选取氯化钴(CoCl2 )诱导的人肝癌细胞株HepG2 作为研究对象,构建HIF-2αsiRNA 特异性载体,转染低氧环境下的HepG2 细胞,Real-time PCR 和Western blot 方法分别检测转染前后细胞中HIF-2αmRNA 和蛋白表达,MTT 方法检测转染前后HepG2 细胞增殖,流式细胞术检测转染前后HepG2 细胞凋亡和细胞周期分布,Transwell 试验检测转染前后HepG2 细胞侵袭迁移能力。结果:低氧诱导下,肝癌HepG2 细胞HIF-2α表达显著增多;特异性转染HIF-2αsiRNA 于低氧环境下的HepG2 细胞后,HIF-2αmRNA 和蛋白表达水平均受到明显抑制、细胞增殖能力降低,凋亡率升高,分布于G0/ G1 期细胞比率升高,合成期(S)及合成后期(G2/ M)细胞比率降低,细胞体外侵袭迁移能力受到明显抑制(P<0.05)。结论:低氧环境下肝癌HepG2 细胞表达HIF-2α增多,特异性siRNA 可通过下调低氧环境下HepG2 细胞中HIF-2α基因表达,抑制HepG2 细胞增殖、侵袭迁移,改变细胞周期分布并诱导其凋亡。     

FHL1在香烟烟雾刺激的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖与迁移中的作用

 目的：研究FHL1 (four-and-a-half LIM domain 1)在香烟烟雾提取物（CSE）刺激的大鼠远端肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖及迁移中的作用。方法：原代培养PASMCs,分别予CSE及FHL1 siRNA转染干预,分为6组：空白组、阴性转染组、FHL1 siRNA转染组、CSE组、CSE+阴性转染组和CSE+FHL1 siRNA转染组。Real-time PCR法检测FHL1 mRNA的表达,Western blotting法检测FHL1 蛋白,CCK-8法检测细胞增殖,Transwell 法测定细胞迁移。结果：CSE刺激导致PASMCs增殖、迁移及FHL1蛋白表达增加 (P<0.01) ,但FHL1 mRNA的表达无明显改变（P＞0.05）。FHL1 siRNA转染PASMCs,可降低CSE所致的PASMCs增殖及迁移(P<0.01)。结论：CSE可促进PASMCs增殖与迁移以及FHL1蛋白的表达, 抑制FHL1蛋白的表达可减弱CSE对PASMCs增殖和迁移的作用。这些结果表明CSE促进PASMCs增殖和迁移与FHL1蛋白有关。     

siRNA沉默P21表达对细胞周期解偶联和细胞凋亡的影响

目的： 利用RNAi技术探讨P21蛋白表达对HeLa 细胞周期解耦联和细胞凋亡的影响。方法： 丝裂霉素刺激HeLa细胞后可诱导P21蛋白高表达，采用脂质体转染技术将p21 siRNA 载体转染至HeLa细胞48 h后给予MMC刺激，利用流式细胞术检测HeLa细胞的P21蛋白表达、 细胞倍体的形成和细胞凋亡的改变。结果： p21 siRNA 载体可有效干扰经MMC诱导的HeLa细胞中P21蛋白表达, MMC刺激后24 h和48 h细胞2倍体百分数明显少于对照组(P<0.01)，4倍体和8倍体细胞百分数明显多于对照组(P<0.01)。p21 siRNA沉默HeLa细胞p21后，凋亡细胞百分率明显高于空质粒对照组(P<0.01)。结论： p21 siRNA可有效沉默HeLa细胞P21蛋白表达，在P21蛋白低表达的情况下，HeLa细胞可通过p53非依赖途径诱导细胞死亡，可能与细胞周期解偶联和p53非依赖的细胞凋亡有关。     

siRNA抑制nm23-H1基因表达对鼻咽癌6-10B细胞生物学行为的影响

目的：采用RNA干扰技术下调nm23-H1基因在鼻咽癌6-10B细胞中的表达,探讨nm23-H1表达下调对6-10B细胞生物学行为的影响。方法：采用脂质体法将nm23-H1基因siRNA(nm23-H1 siRNA)瞬间转染6-10B细胞,Western 印迹检测转染细胞中nm23-H1蛋白的表达水平,然后利用MTT法、流式细胞术和Transwell小室实验分别检测转染6-10B细胞的增殖、细胞周期和体外迁移侵袭等生物学行为的变化;测序检测6-10B细胞nm23-H1基因有无S120G 点突变。结果： nm23-H1 siRNA有效地下调nm23-H1基因的表达, nm23-H1 siRNA转染6-10B细胞的增殖能力增强,S期细胞增多,体外迁移和侵袭能力增强（P<0.05）。6-10B细胞nm23-H1 基因无S120G 点突变。结论：nm23-H1基因具有抑制人鼻咽癌细胞6-10B增殖和体外迁移侵袭的作用。     

组蛋白去甲基化酶含Jumonji结构域蛋白3(JMJD3)抑制人脐静脉内皮细胞增殖及侵袭和迁移

目的分析组蛋白特异性去甲基化酶含Jumonji结构域蛋白3(JMJD3)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞周期、凋亡和迁移的影响。方法合成JMJD3的小干扰RNA(siRNA)、构建JMJD3过表达载体;阴性对照siRNA、si JMJD3或质粒p MSCV-PIG、p MSCV-JMJD3转染HUVEC 48 h后,通过荧光实时定量PCR检测JMJD3 mRNA的水平;流式细胞术检测各转染组HUVEC的细胞周期与凋亡的变化;TranswellTM实验和划痕实验检测转染后的HUVEC侵袭和迁移能力的变化。结果 HUVEC转染si JMJD3 48 h后JMJD3的表达水平下降,S期细胞增加、而G1期细胞明显减少。下调JMJD3后HUVEC的增殖能力增强,细胞凋亡减少,细胞侵袭、迁移能力增强。而在HUVEC转染JMJD3过表达质粒MSCV-JMJD3 48 h后,细胞内JMJD3水平增加,S期细胞显著减少,而G1期细胞则明显增加,同时HUVEC的增殖能力受到抑制,细胞凋亡增多,细胞侵袭和迁移能力减弱。结论 JMJD3具有抑制HUVEC增殖、侵袭和迁移,促进细胞凋亡的作用。     

TLR4通过NF-κB信号途径对宫颈癌细胞增殖的影响

目的:研究Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)小干扰RNA(siRNA)是否通过NF-κB信号途径下调Bcl-2而抑制宫颈癌细胞的增殖。方法:设计并合成针对TLR4基因的3条特异性siRNA)及阴性siRNA,并同时设立空白对照,然后用脂质体LipofectamineTM2000转染细胞。通过半定量RT-PCR和Western印迹法分别检测转染前后He La细胞中TLR4 mRNA和蛋白表达水平,Western印迹法检测p65及Bcl-2蛋白表达水平,MTT法和平板克隆检测细胞增殖率,Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞周期。结果:3条针对TLR4基因的siRNA均能抑制TLR4的mRNA和蛋白表达,其中TLR4-siRNA-003的沉默效率最高。转染TLR4-siRNA-003 48 h后细胞中TLR4的mRNA和蛋白表达水平分别下调62%和89%,p65及Bcl-2蛋白水平明显下调,同时细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡率显著升高,细胞周期被阻滞于G1期。结论:TLR4特异性siRNA能够有效沉默TLR4基因表达,并通过NF-κB信号通路下调Bcl-2而显著抑制宫颈癌He La细胞的增殖。TLR4可能成为治疗宫颈癌的一个新靶点。     

咪达唑仑通过下调p300抑制人咽鳞癌FaDu细胞增殖

 目的：探讨咪达唑仑（midazolam）抑制人咽鳞癌FaDu细胞增殖的机制。方法：咪达唑仑处理FaDu细胞后， MTT及BrdU掺入比色法检测细胞增殖情况，RT-PCR及Western blotting检测p300 mRNA及蛋白水平；沉默p300后，MTT比色法及BrdU掺入法检测细胞增殖情况，Western blotting 检测细胞周期相关蛋白的表达水平。结果：咪达唑仑抑制FaDu细胞增殖；咪达唑仑抑制p300表达； 沉默p300后p21及p27表达上调，p-Rb表达下调FaDu细胞增殖被抑制。结论: 咪达唑仑通过下调p300抑制人咽鳞癌FaDu细胞增殖。     

RNA干扰沉默增殖诱导配体基因对结肠癌细胞周期的影响

目的 探讨沉默增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)基因对人结肠癌SW480细胞增殖及细胞周期的影响.方法 将APRIL基因的小干扰RNA质粒载体(siRNA-APRIL)转染结肠癌SW480细胞株,以非特异性序列载体转染组(nontargeting control)及未转染组(nontransfected control)作为对照.Real-time PCR和Western blot评价APRIL沉默效率;CCK-8(cell counting kit-8)法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞周期变化;RT-PCR检测细胞周期调控基因p21及p27的表达.结果 与非特异性序列载体转染组及未转染组相比,siRNA-APRIL显著抑制APRIL mRNA及蛋白的表达(P＜0.05);siRNA-APRIL转染SW480细胞48 h、72 h和96 h后细胞增殖能力明显下降(P＜0.05);转染48 h,siRNA-APRIL组G0/G1期细胞比例增高,S期及G2/M期细胞比例减少,细胞凋亡的数量增加,同时p21及p27 mRNA的表达上调(P＜0.05);而上述指标两对照组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 siRNA-APRIL能特异性抑制结肠癌SW480细胞APRIL的表达,并抑制细胞增殖,使细胞周期出现G0/G1期阻滞,其机制可能与上调p21和p27的表达有关.     

沉默NANOG表达对人肝癌细胞HepG2中cyclin D1表达及细胞增殖的影响

 目的:探讨RNA干扰沉默NANOG表达后对肝癌细胞HepG2中细胞周期素D1(cyclin D1)表达及细胞增殖的影响。方法:将以NANOG基因为靶点的NANOG-siRNA瞬时转染肝癌细胞HepG2,real-time PCR和Western boltting检测NANOG、cyclin D1 mRNA和蛋白的表达,CCK-8和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期情况。结果:与mock组比较,转染NANOG-siRNA后,肝癌细胞HepG2中NANOG、cyclin D1 mRNA和蛋白水平均下调(P＜0.05),细胞增殖能力下降(P＜0.05),进入G 0/G 1期的细胞比例增多(P＜0.05)。结论:沉默NANOG表达可引起肝癌细胞HepG2中cyclin D1的表达下降,导致细胞增殖能力下降。     

慢病毒介导的RNA干扰沉默Slug基因对结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默Slug基因,观察对结肠癌HCT116细胞增殖和周期的影响。方法:构建Slug基因特异性siRNA慢病毒载体,感染结肠癌HCT116细胞,设立空白对照组、阴性对照组及SlugsiRNA三组,应用Real-time PCR和Western blot方法分别从基因和蛋白质水平检测各组干扰质粒对Slug基因的干扰效果,MTT法检测Slug基因在siRNA作用下的细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞凋亡周期变化情况。结果:转染Slug siRNA后,结肠癌HCT116细胞中Slug基因mRNA和蛋白表达明显受到抑制(P<0.05);MTT检测,干扰组细胞增殖水平明显低于阴性对照组;流式细胞仪检测细胞G1期细胞百分比(52.3±0.6)高于阴性对照组(45.1±0.3,P<0.05)。结论:Slug siRNA能明显下调靶基因Slug的表达,在体外可抑制结肠癌HCT116细胞的生长并促进其凋亡。     

靶向APRIL基因小干扰RNA对鼠肠癌细胞生长与迁移能力的影响

目的 制备并筛选靶向鼠结直肠癌细胞株CT-26增殖诱导配体(APRIL)基因小干扰RNA(siRNA),通过检测APRIL siRNA抑制肠癌细胞生长及迁移等指标,为体内递送APRIL siRNA靶向治疗小鼠结直肠癌原位模型奠定基础.方法 分别设计、合成4种不同位点的APRIL siRNA,同时以合成无序序列作为阴性对照,再用LipofectAMINE 2000转染高表达APRIL的鼠结直肠癌细胞株CT-26,荧光显微镜下计数评价6-FAM标记的APRIL siRNA转染效率与筛选转染浓度;FQ-RT-PCR检测APRIL mRNA水平,Western印迹分析APRIL蛋白表达,筛选沉默效率最高的APRIL siRNA片段;细胞损伤修复法检测APRIL siRNA抑制肠癌细胞迁移的能力;CCK-8(cell counting kit-8)法检测细胞增殖情况;RT-PCR检测基质金属蛋白酶MMP-2及TIMP-1 mRNA水平.结果 4种不同siRNA瞬时转染CT-26细胞后APRIL mRNA和蛋白表达有明显差别(P＜0.05).APRIL siRNA组与对照组相比,细胞生长与迁移能力明显减弱(P＜0.05),MMP-2及TIMP-1 mRNA水平均有显著性差别(P＜0.05).结论 成功筛选靶向鼠结肠癌细胞株CT-26增殖诱导配体APRIL siRNA,其中APsi737敲低效率可达到90%.靶向APRIL基因小干扰RNA可有效降低肠癌细胞的生长与转移能力,可能与MMP-2及TIMP-1的调节有关.可用于后续的靶向治疗结直肠癌研究.

Abstract：

Objective To construct and screen siRNA targeting a proliferation-inducing ligand (APRIL) gene in a mouse colorectal cancer celline, CT-26. To investigate the effects to the cell growth and migrant capacity of CT-26 after knockdown APRIL gene, lay the foundation for molecular targeted therapy to colorectal cancer. Methods Four pairs of APRIL siRNA were designed and chemically synthesized. And disorder sequences were synthesized as a negative control. These sequences were transfected with LipofectAMINE 2000 into CT-26 cells, which high-expressed APRIL gene. The transfection efficency rate of 6-FAM labelled control siRNA was detected by fluorescence microscope. The inhibition effectiveness of APRIL mRNA and protein was analyzed by FQ-RT-PCR and Western blot, respectively. Cell proliferation activity was analyzed by cell counting kit-8, cell migration capacity was detected by the repair of cell damage, and MMP-2 together with TIMP-1, two important regulatory genes in cell metastasis, were measured by RT-PCR.Results The different kinds of APRIL siRNA effectively suppressed the level of APRIL mRNA and the protein expression in CT-26 (P ＜ 0.05 ). Cell proliferation and metastasis ability were repressed after APRIL siRNA transfection( P ＜ 0.05 ), compared with random siRNA control and nontransfected control. The mRNA levels of MMP-2 and TIMP-1 genes wre significantly altered among APRIL siRNA groups and two control groups ( P ＜ 0.05). Conclusion We have constructed and screened a kind of siRNA (APsi737) targeting APRIL gene in a mouse colorectal cancer cell line, CT-26. APRIL siRNA can effectively inhibit the cell growth and migration capacity, maybe be regulated by MMP-2 and TIMP-1.     

靶向着丝粒蛋白A的小RNA干扰对肝癌细胞株HepG2细胞生物学行为的影响

目的 研究靶向着丝粒蛋白A(CENP-A)的siRNA对肝癌细胞株HepG2细胞生物学行为的影响.方法 设计并合成三对CENP-A编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,通过定向克隆至载体pSilencerTM 2.1-U6 neo,构建siRNA真核表达质粒,经稳定转染HepG2细胞后检测肝癌细胞中CENP-A基因mRNA及蛋白质表达的抑制情况;通过观察HepG2细胞生长、凋亡、细胞周期和平板克隆形成能力评价CENP-A基因干扰对细胞生物学行为的影响;通过检测bcl-2、Bax、p21waf1、mdm2、p53蛋白表达水平初步探讨CENP-A生物学作用的可能机制.结果 三对靶向CENP-A的siRNA干扰片段中有二对抑制效果明显.与未转染组及空载体组相比,转染CENP-A干扰片段的细胞生长减慢,平板克隆形成率下降.细胞周期检测显示,G1期阻滞(P＜0.01),S期细胞比例减少(P＜0.001).细胞凋亡比例增加(P=0.003),并伴随bcl-2蛋白表达明显下降(P=0.000),Bax蛋白表达明显增高(P=0.001).还可致p21waf1表达增高,mdm2表达下降,但对野生型p53表达未显示明显影响.结论 CENP-A通过参与细胞周期调控而密切相关于细胞恶性增殖和凋亡抑制,其机制可能涉及野生型p53非依赖性通路和凋亡相关基因bcl-2Bax的表达异常.     

特异siRNA下调卵巢癌H08910细胞NAC-1基因表达并抑制生长

 目的：研究小RNA干扰NAC-1 (Nucleus accumbens-1,Nac1 or NAC-1)基因表达对卵巢癌HO8910细胞增殖的影响。方法：设计、合成针对NAC-1基因的特异性小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）及阴性siRNA,并同时设立空白对照,然后用脂质体转染HO8910细胞。通过实时荧光定量RT-PCR 和Western印迹法分别检测转染前后HO8910细胞中NAC-1 mRNA和蛋白表达水平,MTT法和克隆形成实验检测细胞增殖率,FCM法检测细胞周期分布。结果：针对NAC-1基因的特异性siRNA均能抑制NAC-1 mRNA和蛋白的表达,其中NAC-1-siRNA-1的沉默效率最高。转染NAC-1-siRNA-1 48h后,HO8910细胞中NAC-1 mRNA和蛋白表达水平分别下调74%和81%,而且细胞增殖明显受到抑制,细胞周期被阻滞于G1期,与转染阴性siRNA 及未转染组比较,有显著性差异(P?0.05)。结论：NAC-1特异性siRNA能够有效沉默NAC-1基因表达,并显著抑制卵巢癌HO8910细胞增殖。