不同冻存复苏条件影响K562细胞的生物学特性

目的:观察不同冻存复苏条件对白血病K562细胞株生物学特性的影响,并优化培养条件与方法。方法:实验于2006-02/2006-04在吉林医药学院临床检验实验室进行。①将欲冷冻保存的细胞调整到良好的生长状态,即对数生长期。将细胞分成密度相同的4个组。离心收集后分别加入冻存保护液二甲基亚砜,其终浓度依次为5%、10%、15%、20%分装于冻存管。冻存15d后,每组取出1支复苏并接种于细胞培养板培养。培养12h后吸取少量实验细胞,加入等体积的0.1%台盼蓝染液,5min后在血球计数板上计数,被染成深蓝色的细胞为死细胞;染色很淡、边缘光滑且胞体透明的细胞为活细胞。每个标本计数500个细胞,计数2次取平均值,计算细胞的复苏率。②选择冻存条件和冻存细胞密度相同的2支冻存细胞,采用2种不同的方法进行复苏。第1组:立即将冻存管置37℃水浴中,待融化后1000r/min离心5min,吸去上清液,加入含10%小牛血清的RPMI-1640培养基,混匀后接种于细胞培养板继续培养。第2组:将冻存细胞于40℃水浴中迅速溶解后转入37℃水浴箱,融化后离心、加培养基等操作同第1组。复苏细胞培养12h后采用台盼蓝染色计算细胞的平均存活率。③用无血清RPMI-1640培养基制备3×104/mL的K562细胞悬液接种于细胞培养板中,每孔1mL,然后分别加入5%、10%、12%、15%、20%的灭活小牛血清,每种血清浓度设置4个试验孔并于培养12,24,36,48,60,72,84,96h后每种浓度各取1孔计数细胞量,绘制细胞生长曲线。结果:①5%、15%、20%二甲基亚砜组冻存K562细胞复苏率分别与10%二甲基亚砜组比较,差异显著(86.70%,82.03%,63.09%,88.13%,P均<0.01)。②传统37℃水浴方法复苏后的细胞平均存活率,与40℃溶解后37℃恒温方法比较,差异非常显著[(69.13±1.01)%,(87.50±2.24)%,P<0.01]。③在5%血清含量培养基中,K562细胞基本不生长,且有逐渐死亡的趋势;在10%血清含量培养基中K562细胞生长趋势明显,但生长速度相对较慢;在12%、15%、20%血清含量培养基中K562细胞生长迅速,但3种血清浓度之间细胞生长趋势无明显差异。结论:以10%二甲基亚砜作为K562细胞冻存保护剂并采用改良复苏方法可使细胞保持最佳生物学特性,12%血清为K562细胞常规培养的最适浓度。     

不同冻存复苏条件影响K562细胞的生物学特性

目的：观察不同冻存复苏条件对白血病K562细胞株生物学特性的影响，并优化培养条件与方法。 方法：实验于2006-02／2006—04在吉林医药学院临床检验实验室进行。①将欲冷冻保存的细胞调整到良好的生长状态，即对数生长期。将细胞分成密度相同的4个组。离心收集后分别加入冻存保护液二甲基亚砜，其终浓度依次为5％、10％、15％、20％分装于冻存管。冻存15d后，每组取出1支复苏并接种于细胞培养板培养。培养12h后吸取少量实验细胞，加入等体积的0．1％台盼蓝染液，5min后在血球计数板上计数，被染成深蓝色的细胞为死细胞；染色很淡、边缘光滑且胞体透明的细胞为活细胞。每个标本计数500个细胞，计数2次取平均值，计算细胞的复苏率。②选择冻存条件和冻存细胞密度相同的2支冻存细胞，采用2种不同的方法进行复苏。第1组：立即将冻存管置37℃水浴中，待融化后1000r／min离心5min，吸去上清液，加入含10％小牛血清的RPMI～1640培养基，混匀后接种于细胞培养板继续培养。第2组：将冻存细胞于40℃水浴中迅速溶解后转入37℃水浴箱，融化后离心、加培养基等操作同第1组。复苏细胞培养12h后采用台盼蓝染色计算细胞的平均存活率。③用无血清RPMI-1640培养基制备3×10^4／mL的K562细胞悬液接种于细胞培养板中，每孔1mL，然后分别加入5％、10％、12％、15％、20％的灭活小牛血清，每种血清浓度设置4个试验孔并于培养12，24，36，48，60，72，84，96h后每种浓度各取1孔计数细胞量，绘制细胞生长曲线。 结果：①5％、15％、20％二甲基亚砜组冻存K562细胞复苏率分别与10％二甲基亚砜组比较，差异显著（86．70％，82．03％，63．09％，88．13％，P均〈0．01）。②传统37℃水浴方法复苏后的细胞平均存活率。与40屯溶解后37℃恒温方法比较，差异非常显?     

传统及改良纱布包裹冻存法对人血管内皮细胞保护的比较

背景:传统的细胞冻存多采用4,-20℃放置的阶梯式降温方法,程序复杂且浪费时间。目的:比较传统法与改良冻存法对血管内皮细胞的保护效果。方法:将常规培养的人血管内皮细胞用胰酶消化后,用配置好的冻存液(10%二甲基亚砜、体积分数60%胎牛血清、30%DMEM无血清培养基)调整浓度,将细胞悬液吸入冻存管,分组干预:实验组以纱布包裹,并直接投入-80℃冰箱;对照组按常规冻存法,4℃冰箱和-20℃冰箱分别预冷30min和1h后放入-80℃冰箱。1个月后快速复苏冻存细胞。结果与结论:复苏后实验组细胞存活率及生长曲线与对照组比较差异无显著性意义;复苏后实验组细胞贴壁率、形态学变化及增殖能力明显优于对照组。说明改良的纱布包裹法优于传统的细胞冻存法,且更加方便快捷。     

传统及改良纱布包裹冻存法对人血管内皮细胞保护的比较

背景：传统的细胞冻存多采用4,-20℃放置的阶梯式降温方法,程序复杂且浪费时间。目的：比较传统法与改良冻存法对血管内皮细胞的保护效果。方法：将常规培养的人血管内皮细胞用胰酶消化后,用配置好的冻存液（10%二甲基亚砜、体积分数60%胎牛血清、30%DMEM无血清培养基）调整浓度,将细胞悬液吸入冻存管,分组干预：实验组以纱布包裹,并直接投入-80℃冰箱;对照组按常规冻存法,4℃冰箱和-20℃冰箱分别预冷30min和1h后放入-80℃冰箱。1个月后快速复苏冻存细胞。结果与结论：复苏后实验组细胞存活率及生长曲线与对照组比较差异无显著性意义;复苏后实验组细胞贴壁率、形态学变化及增殖能力明显优于对照组。说明改良的纱布包裹法优于传统的细胞冻存法,且更加方便快捷。     

分离培养方法及冻存技术对犬骨髓间充质干细胞生长和增殖的影响

背景：骨髓间充质干细胞在体外长期培养易发生自发分化，而失去多分化潜能，因此必须对培养的细胞及时冻存，需要时再进行复苏。目的：建立犬骨髓间充质干细胞体外分离、培养、增殖、冻存的方法。设计、时间及地点：对照观察细胞学实验，于2005-06／2008—06在浙江中医药大学附属第一医院骨伤研究所完成。材料：健康成年雄性Beagle犬用于骨髓间充质干细胞的提取。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化骨髓间充质干细胞，并进行传代扩增培养。将第2代骨髓间充质干细胞与12．5％DMSO混匀置于冻存管中，采用慢冻快融法进行冻存和复苏：将冻存管置于-4℃冰箱2h，然后移入-30℃冰箱2h，再置于厚壁塑料泡沫盒中，扎紧密封，置-80℃冰箱过夜后，取出冻存管直接放入液氮中保存，或放入-80℃冰箱保存。复苏时将冻存管从液氮或80℃冰箱中取出，立即置37℃水浴并轻轻摇动，1-2min内迅速解冻。主要观察指标：复苏前后细胞成生长活性及形态变化。结果：分离的骨髓间充质干细胞为以均一的梭形的成纤维细胞样贴壁生长，贴壁及增殖能力强，传代细胞贴壁较快。经过液氮长期冻存后，将复苏后的骨髓间充质干细胞再培养，细胞形态及生长状态与冻存前无差异，均呈长梭形均匀分布生长，细胞生长增殖旺盛。结论：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法町获得犬骨髓间充质干细胞，应用慢冻快融技术进行冻存和复苏，较好的保持了冻存细胞的活力和功能。     

不同冻存时间与温度对兔骨髓基质干细胞存活率的影响

目的:以二甲基亚砜作为保护剂,采用慢冻快融法观察不同温度及不同时间冻存的兔骨髓基质干细胞复苏后存活率的变化。方法:实验于2003-09/2005-06在浙江省医学科学院生物工程所完成。①选取清洁级3月龄新西兰大白兔5只,抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液,密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化出兔骨髓基质干细胞,并进行增殖。②取第3代骨髓基质干细胞,经消化后离心重悬,用完全培养液调整细胞浓度为6×109L-1。将质量浓度为250g/L的二甲基亚砜缓慢滴入同体积含骨髓基质干细胞的上述培养液中,混匀,二甲基亚砜的终浓度为125g/L,骨髓基质干细胞的终密度为3×109L-1,1mL/安瓿冻存。③4℃冻存直接将安瓿置4℃冰箱中;-20℃及-60℃冻存,则将安瓿置于有脱脂棉的聚丙烯泡沫盒中,壁厚1.5cm,扎紧密封,各置-20℃及-60℃冰箱过夜,取出后分别直接放于-20℃及-60℃冰箱保存;-196℃液氮冻存,则将置有安瓿的泡沫盒于-60℃冰箱过夜后,取出冻存安瓿直接放于液氮中保存。骨髓基质干细胞分别于4℃、-20℃、-60℃、-196℃条件下进行3d,10d,1,3,8个月以及1年的冻存。④经不同温度及不同时间冻存后,给予复苏。复苏时将冻存安瓿从液氮或冰箱中取出,立即置37℃水浴并轻轻摇动,约1min迅速解冻。含骨髓基质干细胞的冻存液经5倍于冻存液量的完全培养液稀释后,离心重悬,进行骨髓基质干细胞存活率测定。复苏后的骨髓基质干细胞以1×104/cm2用完全培养液再培养,观察骨髓基质干细胞的形态变化及生长活性情况。结果:实验选取3月龄新西兰大白兔5只,全部进入结果分析。①兔骨髓基质干细胞原代培养情况:培养3d时,骨髓基质干细胞数量较少,散在分布,呈短梭形形态。培养1周时细胞形成大量的小集落,细胞变长。此后集落细胞迅速增多,逐渐汇合成片,形态为均一的长梭形,呈旋涡状排列,2周时细胞长成单层。②兔骨髓基质干细胞传代培养情况:刚传代的骨髓基质干细胞呈圆形,数小时后迅速贴壁,重新成为梭形。之后细胞呈长梭形均匀分布生长,形态比原代培养更均一,细胞生长旺盛、增殖迅速。连续传代22代无明显变化。但随传代次数增多,细胞形态出现多样性,逐渐呈老化现象。③不同温度不同冻存时间下复苏后的兔骨髓基质干细胞存活率的比较:兔骨髓基质干细胞液氮保存1年,存活率为79%;-60℃保存1,3,8个月的存活率分别为67%,38%和0%;不宜于4℃及-20℃保存。④复苏后的骨髓基质干细胞再培养情况:复苏后的骨髓基质干细胞细胞形态及生长状况与冻存前无明显差异,呈长梭形生长,增殖旺盛。结论:分离纯化的兔骨髓基质干细胞生长增殖能力强,短期保存可用-60℃冻存,长期需液氮保存,为择期进行骨髓基质干细胞实验和应用提供实验依据。     

胰酶消化后新生鼠成肌细胞生长方式与规律以及模拟转基因电穿刺激对冻存和复苏细胞的损害

目的:采用原代培养技术进行大鼠原代细胞的培养与增殖,并模拟基因转染中的电穿刺激,探讨大鼠成肌细胞在基因转染技术中可能的应用前景。方法:实验于2000-04/10在四川大学华西医院病理实验室完成。①选取SD新生鼠10只,消毒后切开皮肤,分离大腿肌肉,高浓度磷酸盐缓冲液浸泡,5min后剪碎组织块至1mm3以下,加入胰酶使用液,37℃水浴消化,胎牛血清终止消化过程,弃上清。再加入生长培养基重悬细胞,置于CO2孵箱中进行接种。②弃去培养基,重新加入等量生长培养基,3～5d更换1次。显微镜下细胞若出现间隙或变圆即中止消化。细胞计数后按所需密度接种于培养瓶,1∶2或1∶3传代。③细胞的冻存与复苏:冻存液的配制比为二甲基亚砜:胎牛血清:Dulbecco改良的Eagle培养基=1∶4∶5。消化细胞后离心去上清,将沉淀细胞移至冻存管内,加入冻存液,-80℃过夜,第2天取出后先行液氮保存,后迅速投入37℃水浴中振荡,使其1min内完全溶解。收获进入对数生长期的细胞,1.5×106个/次,加入一次性电转杯内。电压0.3KV,电场强度0.5KV/cm,电容950μF,电阻250Ω条件下电击24ms。结果:①胰酶消化后新生鼠成肌细胞的生长方式:成肌细胞呈圆形,悬浮于培养液中,大约两三天开始贴壁生长,五六天后细胞几乎全部贴壁。②新生鼠成肌细胞的生长规律:胰酶消化五六天后,成肌细胞进入对数生长期,增殖明显加快,细胞间隙变窄,呈极性生长现象,数量可达1×106个/mL。传代培养可至20代以上,生长速度明显减缓。③模拟转基因电穿孔条件下对冻存和复苏细胞的损害:电穿孔后出现大量细胞碎片,约有一半左右细胞在一两天内死亡,10～14d后残留细胞开始增殖,贴壁生长。结论:以原代培养技术培养、冻存成肌细胞并模拟电穿孔刺激,大鼠成肌细胞的培养效率高、细胞胞膜稳定且存活周期长,提示成肌细胞是一种较理想的基因转染包装细胞。     

用于包装复制缺陷性腺病毒的低代次293细胞的培养

目的:建立体外培养低代次293细胞的方法.方法:细胞复苏,将冻存的低代次293细胞于37℃水浴中快速融解,移入75 cm2细胞培养瓶中,加入10 mL低代次293细胞培养基,6～8 h细胞贴壁后更换培养基.细胞传代,吸出培养基,用1×柠檬酸盐细胞消化液洗2遍,留取0.5 mL 37℃消化5～10 min,待细胞脱壁后加入3 mL培养基,轻轻吹匀以1:2比率传代培养.细胞冻存,以1×柠檬酸盐细胞消化液消化5～10 min,细胞脱壁后加入5 mL细胞培养基中和消化液,离心收集细胞,以1 mL的细胞冻存液(90% FBS+10% DMSO)重悬、冻存.结果:细胞传代后8h细胞完全贴壁;以腺病毒感染质粒感染293细胞14 d后可观察到腺病毒空斑形成.结论:该方法操作简便,对细胞损伤小且保持细胞生物学特性不变.     

不同冻存液改善人胎肝细胞冻存质量比较

目的：通过对不同冻存液冻存人胎肝细胞进行比较,探索一种效果较好的冻存液以改善冻存肝细胞质量.方法：实验于2004-08/11在南方医科大学珠江医院中心实验室完成.采用二步灌注法分离人胎肝细胞,将分离后的胎肝细胞分别以3组不同冻存液（HAMF-12,RPMI-1640,DMEM）在液氮中冷冻保存4周.4周后快速复苏胎肝细胞,进行存活率、形态学及尿素、白蛋白、谷草转氨酶分泌量检测.结果：①HAMF-12组生存率为（86.0&;#177;2.4）%,明显优于RPMI-1640组（81.9&;#177;6.5）%和DMEM组（82.1&;#177;4.6）%.②HAMF-12组肝细胞极性恢复快,肝细胞生长旺盛,细胞膜完整,胞浆内有丰富颗粒,核仁清楚,少数细胞内出现空泡,与对照组肝细胞形态相似.③用HAMF-12组液冻存人胎肝细胞复苏后,尿素、白蛋白、谷草转氨酶分泌量优于RPMI-1640组和DMEM组.结论：①在其他冻存条件相同下,HAMF-12冻存液显著提高了人胎肝细胞冻存质量,优于RPMI-1640液、DMEM液.②复苏后HAMF-12组肝细胞形态学光镜下观察与刚分离的肝细胞无明显差异,进行原代培养后肝细胞极性恢复较好.     

不同冻存时间与温度对兔骨髓基质干细胞存活率的影响

目的：以二甲基亚砜作为保护剂，采用慢冻快融法观察不同温度及不同时间冻存的免骨髓基质干细胞复苏后存活率的变化。 方法：实验于2003-09／2005—06在浙江省医学科学院生物工程所完成。①选取清洁级3月龄新西兰大白兔5只，抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液，密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化出兔骨髓基质干细胞，并进行增殖。②取第3代骨髓基质干细胞，经消化后离心重悬，用完全培养液调整细胞浓度为6&;#215;10^9L^-1。将质量浓度为250g／L的二甲基亚砜缓慢滴入同体积含骨髓基质干细胞的上述培养液中，混匀，二甲基亚砜的终浓度为125g／L，骨髓基质干细胞的终密度为3&;#215;10^9 L^-1，1mL／安瓿冻存。③4℃冻存直接将安瓿置4℃冰箱中；-20℃及-60℃冻存，则将安瓿置于有脱脂棉的聚丙烯泡沫盒中，壁厚1．5cm，扎紧密封，各置-20℃及-60℃冰箱过夜，取出后分别直接放于-20℃及—60℃冰箱保存；-196℃液氮冻存，则将置有安瓿的泡沫盒于-60℃冰箱过夜后，取出冻存安瓿直接放于液氮中保存。骨髓基质干细胞分别于4℃、-20℃、-60℃、-196℃条件下进行3d，10d，1，3，8个月以及1年的冻存。④经不同温度及不同时间冻存后，给予复苏。复苏时将冻存安瓿从液氮或冰箱中取出，立即置37℃水浴并轻轻摇动，约1min迅速解冻。含骨髓基质干细胞的冻存液经5倍于冻存液量的完全培养液稀释后，离心重悬，进行骨髓基质干细胞存活率测定。复苏后的骨髓基质干细胞以1&;#215;10^4／cm^2用完全培养液再培养，观察骨髓基质干细胞的形态变化及生长活性情况。结果：实验选取3月龄新西兰大白兔5只，全部进入结果分析。①兔骨髓基质干细胞原代培养情况：培养3d时，骨髓基质干细胞数量较少，散在分布，呈短梭形形态。培养1周时细胞形成大量的小集落，细胞变长。此后集落细胞迅速增多，逐渐汇合成片，形态为均一的长梭形，呈旋涡状排列，2周时细胞长成单层。②兔骨髓基质干细胞传代培养情况：刚传代的骨髓基质干细胞呈圆形，数小时后迅速贴壁，重新成为梭形。之后细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养更均一，细胞生长旺盛、增殖迅速。连续传代22代无明显变化。但随传代次数增多，细胞形态出现多样性，逐渐呈老化现象。③不同温度不同冻存时间下复苏后的兔骨髓基质干细胞存活率的比较：兔骨髓基质干细胞液氮保存1年，存活率为79％；-60℃保存1，3，8个月的存活率分别为67％，38％和0％；不宜于4℃及-20℃保存。（少复苏后的骨髓基质干细胞再培养情况：复苏后的骨髓基质干细胞细胞形态及生长状况与冻存前无明显差异，呈长梭形生长，增殖旺盛。 结论：分离纯化的兔骨髓基质干细胞生长增殖能力强，短期保存可用-60℃冻存，长期需液氮保存，为择期进行骨髓基质干细胞实验和应用提供实验依据。