抗CD4单抗增强抗CD3单抗／IL—2活化的肿瘤特异性T细胞的抗瘤活性

目的探讨抗CD4mAb增强抗CD3mAb刺激的肿瘤特异性T细胞增殖和杀瘤活性的作用。方法将肿瘤细胞免疫的小鼠脾细胞,采用4种不同的方案培养1单独加2×104U/LrIL2IL2组2单独加抗CD3mAb抗CD3组3加抗CD3mAb48h后,再加入抗CD3mAb和2×104U/LrIL2抗CD3 IL2组4同时加抗CD3mAb和抗CD4mAb48h后,再加入抗CD3mAb、抗CD4mAb和2×104U/LrIL2抗CD3 IL2 抗CD4组。然后分别检测4组效应细胞的增殖水平、杀瘤活性及表型。结果抗CD3 IL2组细胞的3HTdR掺入量在第6,12和20d分别为:22045、13986和1931;抗CD3 IL2 抗CD4组细胞的3HTdR掺入量在第6、12和20d,分别为46193、31047和7443,后者明显高于前者P0.05。在培养12d时,抗CD3 IL2组的细胞对FBL3细胞株的最大杀伤率为83.6%;抗CD3 IL2 抗CD4组细胞的最大杀伤率为91.7%。细胞表型:FACS分析表明,抗CD3 IL2 抗CD4组培养12d的细胞,99%以上为Thy1.2 细胞,且CD4 、CD25 细胞的百分率均高于抗CD3 IL2组。结论抗CD4mAb对抗CD3mAb刺激、IL2诱导的肿瘤特异性T细胞的增殖和杀瘤活性具有增强作用。     

抗CD94单抗与NK细胞、γδ^＋T细胞及CTL功能的关联

目的：探讨抗CD94单抗与NK细胞、γδ^ T细胞及CTL的相关性。方法,采用荧光检测法,分别分析NK细胞、γδ^ 细胞和CTL上CD94分子的表达,采用^3H TdR掺入法和MTT释放法,分析抗94单抗对这3种细胞的杀伤活性和细胞增殖的影响。结果NK细胞和γδ^ T细胞上CD94分子的表达,明显高于PBL和CTL。抗CD94单抗能激活NK细胞、γδ^ T细胞和CTL的增殖,并能提高γδ^ T细胞和CTL的杀伤活性。结论CD94分子在NK细胞和γδ^ T细胞表面呈高表达。抗CD94单抗对NK细胞、γδ^ T细胞及CTL的增殖具有上调节作用,对它们的杀伤活性具有正向调节作用。     

抗CD4单抗-表阿霉素在体外和体内对T源性淋巴瘤的作用

目的：探讨抗CD4单克隆抗体免疫结合物对T源性淋巴瘤细胞的特异性杀伤效应。方法：采用低分子右旋糖苷（DextranTl0）作联接桥，将表阿霉素分子偶联到抗CD4单抗上，制备成抗CD4单抗免疫结合物，在体外和体内，经补体非依赖性细胞毒试验、免疫组化试验、CFU-GM集落形成试验．^125I-单抗结合物裸鼠体内示踪等方法测定抗CD4免疫结合物对T-源性淋巴瘤细胞的亲合力和特异性杀伤效应。结果：抗CD4-表阿霉素免疫结合物对T源性淋巴瘤细胞（CEM）有较强亲合力和特异性杀伤力（79％），ECT扫描发现^125I-抗CD4结合物主要富集在含CEM细胞的实体瘤内。结论：^125I-抗CD4单抗标志物和抗CD4-表阿霉素结合物可用于诊断和治疗T-源性淋巴瘤。     

FBL3细胞在小鼠体内外诱导CD4+CD25+调节性T细胞增殖的实验研究

目的：通过小鼠体内外实验观察肿瘤细胞是否可以诱导CD4^＋CD25^＋Treg的分化增殖。方法：将小鼠的红白血病瘤细胞系FBL3接种于C57BL/6小鼠腹壁皮下,流式细胞仪检测小鼠外周血、脾脏及瘤组织CD4^＋CD25^＋Treg细胞含量,RT-PCR检测小鼠脾脏及瘤组织Foxp3 mRNA的表达;体外实验检测FBL3细胞培养上清液对小鼠脾脏CD4^＋CD25^＋Treg细胞的作用。结果：荷瘤鼠外周血CD4^＋CD25^＋Treg比例与正常鼠比较无统计学差异（P〉0.05）,但荷瘤鼠脾脏CD4^＋CD25^＋Treg比例显著高于正常对照（P〈0.01）,荷瘤小鼠脾脏组织Foxp3 mRNA的表达量明显增加;体外实验表明FBL3培养上清液促使CD4^＋CD25^＋Treg细胞比例增高,并诱导Foxp3 mRNA表达增加。结论：FBL3细胞及其分泌的可溶性物质能诱导CD4^＋CD25^＋Treg细胞的增殖,说明是肿瘤的发生促进了CD4^＋CD25^＋Treg增高。     

人IL-4基因修饰增强瘤细胞特异性CTL杀伤活性机制初探

目的 探讨IL－4基因修饰瘤苗增强细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤活性的机制。方法 通过逆转录病毒载体pL-IL-4-SN将人IL－4基因导入肝癌细胞系HepG2细胞,以IL－4基因修饰瘤苗和野生型瘤细胞作刺激细胞诱导CTL反应,通过流式细胞仪检查肿瘤细胞表面分子表达。结果 IL－4基因修饰诱导瘤细胞表达MHCⅡ类抗原、B7－1及ICAM－1等细胞表面分子,对MHCⅠ类抗原表达无影响,其瘤苗诱导的CTL杀伤活性为罢生型瘤细胞的7倍（P＜0.01）,加入抗IL－4单克隆抗体（McAb）可完全阻断IL－4诱导的细胞表面分子表达,IL－4基因修饰瘤苗诱导CTL反应时培养上清可测及大量IL－2产生,抗IL－4或抗细胞表面分子的McAb可降低IL－2产生及抑制CTL反应。结论 IL－4基因修饰可能是通过诱导MHCⅡ类抗原等表达分子表达,促进IL－2产生而增强CTL杀伤活性。     

低免疫原性肿瘤可诱导调节性T细胞增生

目的以小鼠低免疫原性瘤细胞和高免疫原性瘤细胞与同系脾细胞混合培养为肿瘤免疫体外模型,研究培养后的脾细胞中CIM（＋）CD25（＋）调节性T细胞（TR）的分布,揭示肿瘤免疫逃逸的机制。方法3种不同高低免疫原性瘤细胞与同系脾细胞混合培养,建立模拟肿瘤免疫的体外模型,以放射性核素掺入法检测混合培养后的脾细胞的增殖,流式细胞术分析TR、CIM（＋）干扰素（IFN）γ（＋）以及CIM（＋）白细胞介素（IL）-10（＋）T细胞分布状况,ELISA法检测混合脾细胞和肿瘤细胞培养卜清液中IFN-1和IL-10水平。结果高免疫原性瘤细胞FBL3或H22刺激的同系脾细胞增殖指数较低免疫原性瘤细胞D5刺激的旧系脾细胞要高,分别高3倍（D5：FBL3=4．94：12．20）和10倍（D5：H22=4．94：44．60）,而3种瘤细胞刺激的同种脾细胞其增殖指数均较相应的肿瘤免疫组要高（D5 1．9倍,FBL3 2．1倍,H22 1．1倍）。在与低免疫原性瘤细胞D,混合培养的同系脾细胞中,与高免疫原性瘤细胞FBL3或H22相比,含更多的TR（D5：H22P〈0．05）和CD4^＋IL-10^＋细胞（D5：FBL3P〈0．01,D5：H22P〈0．01）,上清液中含更高水平的IL-10（P〈0．01,P〈0．01）,而IFN-γ水平很低（P〈0．01,P〈0．01）。结论低免疫原性肿瘤可诱导TR细胞的增生,TR细胞在肿瘤免疫逃逸中有重要作用。     

CD4+CD25+T细胞在CD8+T细胞抗肿瘤免疫中的调节作用

实验旨在研究CD4^＋CD25^＋T细胞在CD8^＋T细胞抗肿瘤免疫中的调节作用。将小鼠脾脏中分离的单个核细胞分为两组．即去除CD4^＋CD25^＋T细胞组和未去除CD4^＋CD25^＋T细胞组,测定树突状细胞提呈的肿瘤抗原多肽刺激不同T细胞增殖活性、细胞因子IFN一1分泌,以及多肽特异性CD8^＋T细胞对同源性胃癌细胞株MFC的杀伤活性。结果显示预先去除未致敏T细胞中的CD4^＋CD25^＋T细胞,所诱导的特异性CD8^＋CTL对肿瘤细胞免疫应答增强,表现为反应性T细胞对树突状细胞提呈的肿瘤抗原多肽增殖反应增强,IFN-γ分泌量提高及CD8＋T细胞对MFC杀伤活性增强。这些结果表明。预先去除未致敏T细胞中的CD4^＋CD25^＋T细胞,肿瘤抗原多肽修饰的树突状细胞肿瘤疫苗效能可明显增加。CD4^＋CD25^＋T细胞在CD8^＋T细胞抗肿瘤免疫中起下调作用。     

抗CD28单抗和IL-15对CIK增殖和杀肿瘤作用的研究

CIK是肿瘤过继性细胞免疫治疗中的免疫效应细胞。为使CIK在实验室里能被更有效地诱导增殖并赋予其更强的杀肿瘤效应,我们在CIK常规培养环境中加入抗CD28单抗和IL-15,探讨抗CD28单抗和IL-15对CIK增殖和杀肿瘤效应。取人外周血单个核细胞(PBMC),预先以常规方法诱导CIK,然后加入抗CD28单抗和IL-15与CIK共培养。用全自动五分类血液分析仪计数CIK增殖率;用流式细胞术测定CIK中粒酶B、穿孔素和CD107a等分子的表达率;用ELISA方法检测CIK分泌IL-10、IL-12、INF-γ和TNF-α水平;用乳酸脱氢酶释放法测定CIK对人肺癌细胞株(A549)、乳腺腺癌细胞株(MFC-7)和人黑素瘤细胞株(HME1)的杀伤活性。PBMC经常规CIK诱导培养以后再加入抗CD28单抗和IL-15与对照组比较,前者细胞增殖率明显增强(P<0.05);在CIK培养体系中加入抗CD28单抗和IL-15可促进颗粒酶B、穿孔素和CD107a等分子的表达率进一步增强(P<0.05);加入抗CD28单抗和IL-15,培养8d后CIK对A549、MFC-7和HME1细胞杀伤活性分别为82.2%、59.3%和70.6%,与对照组(分别为60.9%、49.6%和48.4%)相比差异有统计学意义(P<0.05);在培养体系中加入抗CD28单抗和IL-15,培养8d后其细胞因子IFN-γ、TNF-α分泌水平显著高于对照组(P<0.05),组间IL-10和IL-12的分泌量未见显著差异(P>0.05)。实验说明在CIK培养体系中加入抗CD28单抗和IL-15可增加CIK增殖率并提高其抗肿瘤效应。     

CD3AK细胞的诱导及其抗肿瘤作用机制的初步探讨

采用两种状态的IgG2型小鼠抗人CD3单抗,辅以小剂量外源性IL-2刺激诱导CD3AK细胞,测定其对K562,Raji及P815细胞的杀伤作用。结果发现,0.1μg/ml浓度的游离状态抗CD3单抗和10μg/ml浓度的粘附状态抗CD3单抗刺激人PBMC增殖达最强效果,其中粘附状态抗CD3单抗诱导的PBMC增殖活性明显强于激离状态抗CD3单抗;外源性IL-2能协同增强抗CD3单抗诱导PBMC增殖,但当粘附状态抗CD3单抗处于最强激活浓度时,其协同作用并不明显。实验结果显示,CD3AK细胞对三种不同性质的肿瘤细胞均具有较强的杀伤作用,其杀伤活性既有效靶细胞直接接触杀伤,又有杀伤因子介导。     

酶联免疫斑点法检测抗原特异的CTL免疫应答试验条件的优化

目的：探讨酶联免疫斑点（ELISPOT）实验特异性及敏感性的因素，优化酶联免疫斑点法检测抗原特异的CTL免疫应答的实验条件。方法：HLA－A2阳性正常人的外周血单个核细胞在体外经流感病毒抗原肽诱导1周后，观察不同实验条件对酶联免疫斑点法检测抗原特异的CTL免疫应答的影响。结果：CTL诱导时，效应细胞先分离出CD8^＋T细胞组获得的Flu抗原特异的细胞频数要高于CTL诱导后再分离出CD8^＋T细胞组（P＜0．05），自体DC（树状细胞）作APC（抗原提呈细胞）比自体CD8^-PBMC作APC，CTL的诱导效率高且特异（P＜0．05）；使用细胞因子组合（IL－7＋IL－2＋IL－6）优于单纯使用IL－2。CTL行ELISPOT检测时，T2－2细胞较T2－1细胞具有更强抗原提呈功能，增加Flu抗原特异的CD8^＋T细胞频数（P＜0．05）。结论：优化了酶联免疫斑点法检测抗原特异的CTL免疫应答的试验条件，优化的方法在临床肿瘤疫苗的研究中具有应用价值。     

抗CD3/抗CD20双特异双链抗体的生物学活性研究

目的研究抗CD3/抗CD20双特异双链抗体的生物学活性.方法采用亲和层析法纯化本室构建的抗CD3/抗CD20双特异双链抗体可溶性表达产物,并用SDS-PAGE,Westernblot和分子排阻层析鉴定纯化产物;采用FACS法和玫瑰花环试验测定纯化产物与靶细胞的结合活性;采用3H-TdR掺入实验和51Cr释放试验测定该双特异双链抗体的生物学性质.结果纯化的抗CD3/抗CD20双特异双链抗体具有与Jurkat(CD3+)和Daudi细胞(CD20+)的结合活性,且能同时与Jurkat和Daudi细胞结合形成玫瑰花环,并能竞争性封闭亲代鼠源性抗体HIT3a和HI47与Jurkat和Daudi细胞的结合位点;该双特异双链抗体具有促有丝分裂原作用和介导激活的T细胞杀伤Daudi细胞的活性.结论抗CD3/抗CD20双特异双链抗体具有与亲代鼠源性抗体HIT3a和HI47相同的性质,且能介导激活的T细胞杀伤表达CD20抗原的肿瘤细胞,是一个有望用于B细胞恶性肿瘤临床治疗的双特异性抗体.     

胰岛素样生长因子1的免疫调节作用的体外实验研究

目的：探讨胰岛素样生长因子１（ＩＧＦ１） 的免疫调节作用。方法：随机抽取健康个体８２ 名和肿瘤个体１２６ 名,体外提取外周血淋巴细胞后将ＩＬ２ 和或ＩＧＦ１ 共同培养,用３ ＨＴｄＲ 掺入法、３ ＨＴｄＲ 释放法及流式细胞仪检测淋巴细胞增殖活性、杀伤活性和ＣＤ４＋ ＣＤ８＋ 比率。结果：适当浓度的ＩＧＦ１（５０ ｎｇｍｌ）在体外能协同ＩＬ２ 促进ＬＡＫ细胞的增殖,增强其杀伤Ｒａｊｉ细胞的活性,提高淋巴细胞亚群ＣＤ４＋ ＣＤ８＋ 的比率。结论：ＩＧＦ１ 在体外对人体外周血免疫细胞起正向调节作用。     

凋亡肿瘤细胞负载的树突状细胞对抗原特异性CTL的激活

为探讨凋亡Daudi细胞负载的树突状细胞 (DC )激发诱导肿瘤抗原特异性CTL及其生物学特性 ,采用常规方法从人外周血单个核细胞 (PBMC )诱导DC ,激发型CD40mAb联合 50Gyγ射线辐照诱导Daudi凋亡后负载DC ,然后与自体T细胞共育 ,并联合IL 2激发诱导肿瘤特异性CTL ;采用免疫荧光标记和流式细胞仪测定分析膜分子的表达 ;ELISA检测细胞因子的产生 ;Dextran FITC内吞实验分析DC的抗原摄取能力 ;3H掺入试验和51 Cr释放试验分别测定CTL的增殖和细胞毒效应。结果 :(1 )细胞因子序贯体外诱导 7d的DC ,对Dextran吞噬能力最强 ;(2 )CD40mAb诱导联合γ射线辐照 ,能有效介导Daudi细胞的凋亡 ;(3 )抗原负载联合CD40mAb激发可使DC上调表达CD1a、CD80、CD86和HLA DR ,并能促进IL 1 2的分泌 ;(4)凋亡Daudi负载后的DC在激发型CD40mAb作用下 ,能激发和扩增对Daudi细胞具有高效和特异杀伤作用的细胞毒性T细胞。因而认为凋亡肿瘤细胞负载联合CD40mAb刺激的DC可有效激活和扩增肿瘤特异性CTL。     

IL-2的真核表达载体对乙肝病毒基因疫苗的免疫佐剂效应

单以乙肝病毒S区基因疫苗 (pCR3 1 S)或联合IL 2真核表达载体 (pDOR IL 2 )注射BALB/c小鼠 (H 2 d)股四头肌 ,ELISA法检测小鼠血清抗HBs,4h51Cr释放法检测小鼠脾细胞CTL活性。免疫 8周后 ,单注射pCR3 1 S及共注射IL 2真核表达载体的小鼠血清 45 0nmA值分别为 1 2 4± 0 1及 1 98± 0 17。CTL细胞杀伤活性分别为 (5 0 5± 6 4) %、 (6 1 9± 7 1) % ,两组均有明显差异 (P <0 0 1)。脾细胞悬液经抗CD4+ 单克隆抗体处理后CTL细胞杀伤活性分别为 (4 8 3± 5 9) %、 (5 6 2±6 1) % ,抗CD8+ 单克隆抗体处理后分别为 (10 6± 1 4) %、 (13 6± 1 3) %。结果表明 ,IL 2的真核表达载体能够提高小鼠对DNA疫苗的免疫应答 ,CTL细胞杀伤活性主要由CD8+ 执行。基因疫苗可能用于预防及治疗HBV感染。     

抗CD28＋B7．1单抗共刺激T细胞诱导肝癌细胞凋亡的第二信使系统研究

目的：探讨T淋巴细胞活化、增殖、诱导肝癌细胞凋亡过程中第二信使系统的调控机制。方法：用CD28＋B7．1（CD80）单克隆抗体共刺激T淋巴细胞诱导肝癌细胞（BLE－7402）凋亡,测定不同诱导时间T细胞内cAMP,cGMP和Ca^2 的浓度改变及肝癌细胞凋亡情况。结果：活化的T淋巴细胞中,cAMP浓度在初期短暂升高,继而快速下降,作用于肝癌细胞后逐步回升至1－2倍,而细胞内cGMP的浓度急剧升高6－7倍,Ca^2 浓度也显著增加2－3倍,且均在第4天达最高值,与癌细胞的凋亡呈正相关,结论：T淋巴细胞内第二信使系统cAMP、cGMP和Ca^2 的水平与细胞的活化增殖、杀伤效应密切相关。     

IL‐27 enhances the survival of tumor antigen‐specific CD8+ T cells and programs them into IL‐10‐producing,memory precursor‐like effector cells

IL‐27 is a member of the IL‐12 family of cytokines that is comprised of an IL‐12 p40‐related protein subunit, EBV‐induced gene 3, and a p35‐related subunit, p28. IL‐27 functions through IL‐27R and has been shown to have potent antitumor activity via activation of a variety of cellular components, including antitumor CD8⁺ T‐cell responses. However, the exact mechanisms of how IL‐27 enhances antitumor CD8⁺ T‐cell responses remain unclear. Here we show that IL‐27 significantly enhances the survival of activated tumor antigen‐specific CD8⁺ T cells in vitro and in vivo, and programs tumor antigen‐specific CD8⁺ T cells into memory precursor‐like effector cells, characterized by upregulation of Bcl‐6, SOCS3, Sca‐1, and IL‐10. While STAT3 activation and the CTL survival‐enhancing effects can be independent of CTL IL‐10 production, we show here that IL‐27‐induced CTL IL‐10 production contributes to memory precursor cell phenotype induction, CTL memory, and tumor rejection. Thus, IL‐27 enhances antitumor CTL responses via programming tumor antigen‐specific CD8⁺ T cells into a unique memory precursor type of effector cells characterized by a greater survival advantage. Our results have important implications for designing immunotherapy against human cancer.     

可溶性肿瘤抗原和CD3单克隆抗体共同诱导的杀瘤细胞——T-AK细胞

用可溶性肿瘤抗原和CD3单克隆抗体共同刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生CD8~ T细胞为主的杀瘤细胞,称其为T-AK细胞。与LAK细胞和CD3-AK细胞比较,T-AK细胞扩增快、低依赖IL-2,培养14天细胞数扩增24倍,比CD3-AK细胞高8倍,比LAK细胞高15倍,并能持续生长21天。T-AK细胞中含CD3~ 86％、CD4~ 20％、CD8~ 95％、CD16~ 40％、CD25~ 53％,它们是CD8~ T细胞为主的异质性细胞群。T-AK细胞对刺激它的STA来源的靶细胞高亲和性杀伤,杀伤率>90％,对NK敏感和不敏感细胞也有杀伤,表现非MHC限制杀伤。     

雷公藤多甙与DC单抗对小鼠自身免疫性甲状腺炎作用的研究

在建立小鼠自免疫性甲状腺炎的基础上,研究雷公藤多甙和树突状细胞单克隆抗体对诱导小鼠ＡＩＴ的影响。结果表明,经雷公藤多甙,ＤＣ单抗单独及联合应用,与未用药组相比,血清中ＴｇＡｂ水平、Ｔｇ刺的淋巴细胞的增殖能力、脾淋巴细胞产生ＴＮＦ水平无显著降低,其中以联合应用组尤为明显,病理学检查亦之相符。     

CD44抗体诱导急性髓性白血病细胞增殖抑制作用的研究

目的　探讨抗CD4 4抗体对白血病细胞增殖的影响 ,以及对T淋巴细胞介导的白血病细胞的细胞毒作用的影响 ;阐明抗CD4 4抗体的抗肿瘤效应机制。方法　利用3 H TdR掺入法检测肿瘤细胞的DNA合成 ;利用PI染色 流式细胞仪法分析肿瘤细胞的细胞周期变化 ;利用PKH2 PI双染色 流式细胞仪法检测T淋巴细胞所介导的细胞毒作用。结果　抗CD4 4抗体可明显地抑制高表达CD4 4分子的急性髓性白血病MML 1细胞的增殖 ,并且利用抗GAM抗体交联抗CD4 4抗体后 ,可直接诱导Fas敏感的MML 1细胞的凋亡改变。另外 ,抗CD4 4抗体单独即可抑制IL 2激活的T淋巴细胞介导的细胞毒作用 ;协同抗CD2抗体后 ,其对IL 2激活的T淋巴细胞介导的细胞毒作用的抑制更加明显。结论　CD4 4分子的表达可能与肿瘤的发生发展有一定的关系。抗CD4 4抗体对MML 1细胞的增殖抑制作用 ,可能与启动了Fas系统所介导的凋亡信号有关。另外 ,抗CD4 4抗体对T淋巴细胞所介导的白血病细胞的细胞毒作用的抑制 ,可能与其部分地阻断了CD4 4分子的表达有关