补体因子Ⅰ缺乏患儿1例分子与临床特征研究

目的探讨1例补体因子Ⅰ(complement factorⅠ,CFⅠ)缺乏患儿CFⅠ基因突变、蛋白表达水平、免疫表型及临床特征。方法对1例临床表现为反复头痛伴发热,脑电图及脑脊液检查异常的疑似无菌性脑膜脑炎患儿行免疫学筛查,免疫相关基因新一代测序及ELISA检测CFⅠ蛋白表达。结果该患儿补体C3水平明显降低,抗体水平及外周血精细免疫分型正常,经基因分析发现CFⅠ基因第5号内含子拼接位点发生纯合772+1G>T突变,患儿父母均为该突变的携带者。ELISA检测示患儿CFⅠ蛋白表达量与正常对照相比明显降低。结论通过临床、免疫学筛查、基因分析及蛋白检测,确诊1例发生CFⅠ基因突变的补体缺乏患儿,为此前未见报道的新发突变。对反复发热伴头痛,脑膜脑炎诊断不明确及C3降低的患儿应考虑补体缺乏并进行补体相关基因分析以最终确诊。     

1例ITGB2基因突变致白细胞黏附分子缺陷病Ⅰ型患儿临床分子特征分析

目的探讨1例白细胞黏附分子缺陷病Ⅰ型(LADⅠ)患儿的临床特征、免疫表型及基因突变特征。方法总结2020年3月在重庆医科大学附属儿童医院就诊的1例LADⅠ型患儿临床资料。提取患儿外周血标本,采用流式细胞术进行T、B细胞亚群检测,流式细胞术检测白细胞表面CD18分子,全外显子二代测序及ITGB2基因测序。结果本例患儿新生儿期起病,主要表现为反复呼吸道、皮肤感染、腹泻及白细胞异常升高。T、B细胞亚群分析提示多个T细胞亚群比值及绝对值较正常值上限升高,绝对值升高明显;但B细胞比值较正常值下限有降低,绝对值在正常范围内;中性粒细胞表面CD18分子表达仅0.35%,较正常对照明显降低;ITGB2基因测序检测到2号及7号外显子分别存在重复突变c.49dupC(p.Leu17Profs*40)和错义突变c.850GA(p.Gly284Ser),前者为新发突变。结论通过临床、免疫学及基因检测分析,确诊1例白细胞黏附分子缺陷病I型综合征患儿,并发现1个ITGB2基因新发突变。综合免疫学指标结果提示可能存在适应性免疫缺陷。     

1例CIITA新发突变致MHC-Ⅱ类分子缺陷病的临床与分子特征

目的探讨1例CIITA基因突变所致MHCⅡ类分子(major histocompatibility complex classⅡ,MHCⅡ)缺陷病患儿临床与分子特征。方法分析1例在重庆医科大学附属儿童医院就诊的MHCⅡ类分子缺陷病患儿的临床资料、实验室检查,Sanger测序分析患儿CIITA基因序列、PCR法检测T细胞受体长度多样性,流式细胞术检测HLA-DR蛋白表达。结果患儿,男,2岁2月,3月起病,表现为反复腹泻、呼吸道感染、持续CMV感染、卡介苗病、重度营养不良,IgG、IgA下降、IgM升高,CD4~+T细胞比例下降但数量正常、CD4/CD8比例倒置。CIITA基因复合杂合突变,c.3223CT来源于父亲;c.1240delC来源于母亲,为未报道新发突变。患儿B细胞和单核细胞表面的HLA-DR表达明显降低,T细胞功能轻度受损。确诊后患儿行单倍体造血干细胞移植,因发生严重的移植物抗宿主病死亡。结论经临床、免疫学筛查、基因及流式细胞术检测,确诊MHCⅡ类分子缺陷患儿1例,其母源突变c.1240delC既往未见报道。反复多病原感染伴有CD4+细胞比例和(或)数量下降需警惕该病可能,综合临床与实验室检查行MHC-Ⅱ蛋白表达及基因测序可确诊该病,造血干细胞移植是目前根治的唯一办法,但成功率较其他联合免疫缺陷病低。     

散发型Ⅰ型神经纤维瘤的基因突变鉴定与家系分析

目的对一例先证者为Ⅰ型神经纤维瘤病的患儿进行基因突变鉴定与家系研究。方法采用高通量测序技术对NF1基因进行点突变和基因拷贝数检测,应用MLPA技术对患者NF1、NF2基因进行大片段变异研究,采用STR连锁分析对先证者及其父母进行亲缘关系鉴定,对其父母进行体格检查和表型分析,采用Sanger测序方法对高通量测序点突变进行先证者和家系验证。结果高通量测序检出患者NF1基因致病变异c.1013AG,该突变为已报道的Ⅰ型神经纤维瘤致病突变,其生物学父母未见神经纤维瘤表型且无上述突变。结论该神经纤维瘤患儿是由NF1新发突变所致,高通量测序技术对检测致病基因含较多外显子的遗传性疾病具有显著优势。     

X-连锁无汗性外胚层发育不良一家系EDA新发突变

目的检测一X连锁无汗性外胚层发育不良家系EDA基因突变。方法提取先证者、其姐和父母外周血基因组DNA,PCR扩增EDA基因编码区的8个外显子,PCR产物测序,明确突变位点。结果先证者EDA基因6号外显子第781位胞嘧啶C突变成胸腺嘌呤T,使其编码的蛋白第261位谷氨酰胺密码子CAA变成终止密码子UAA,蛋白表达提前终止;患者的姐姐和母亲在该位点均为C/T杂合子,患者父亲在该位点为C纯合子。结论本家系中c.781C>T突变为国内外首报,是导致X连锁无汗性外胚层发育不良临床表型的原因。     

中国X连锁无丙种球蛋白血症40例基因型表型相关性分析

目的通过中国X连锁无丙种球蛋白血症（XLA）患儿临床表现、免疫功能评价、Bruton＇s酪氨酸激酶（BTK）的表达及BTK基因突变分析,分析基因型和表型间可能存在的关系。方法选取拟诊为XLA患儿,使用抗BTK单克隆抗体通过流式细胞技术分析单核细胞BTK蛋白表达。采用RT-PCR获得患儿cDNA,使用8对不同引物分2步扩增BTKcDNA,PCR产物测序。突变结果通过对DNA外显子相应部位扩增、测序证实。并对确诊XLA患儿的母亲及家族中部分亲属进行BTK蛋白表达和BTK基因分析。结果①40/50例原发性低丙种球蛋白血症患儿经BTK基因突变分析确诊为XLA,以错义突变（16例,40.0%）和无义突变（13例,32.5%）为主。②突变类型为错义突变的患儿平均起病年龄为（1.4±1.1）岁,其他突变类型患儿为（1.4±0.7）岁,差异无统计学意义（P=0.45）。错义突变的发生率随年龄的增长呈上升趋势,无义突变的发生率呈下降趋势。③34/40例（85.0%）B细胞〈0.1%;4例（10.0%）B细胞在1%～2%,其中错义突变2例,无义突变1例,剪接突变1例;2例（5.0%）B细胞为2%,均为错义突变。④血清IgG〈3g·L-1患儿BTK基因突变类型以错义突变和无义突变为主。⑤错义突变患儿BTK蛋白表达水平与其他突变类型无显著差异。⑥6/21例（28.6%）2031C/T多态性患儿伴有严重的关节炎,3/19例（15.8%）无多态性患儿有关节炎表现。⑦28/32例（87.5%）XLA患儿母亲为BTK基因杂合型。结论错义突变可能与确诊年龄较大有关,且某些位点的错义突变可能与较高的外周血B细胞数量和血清IgG水平及正常的BTK蛋白表达水平有关。BTK基因多态性（2031C/T）可能增加关节炎的风险。     

有汗型外胚层发育不良家系基因突变分析及孕早期产前诊断

目的 对1个中国汉族有汗型外胚层发育不良家系进行了基因突变分析,并在此基础上对该家系中已孕11周的胎儿进行了产前诊断,为遗传咨询提供依据.方法 应用PCR扩增和直接双向测序对1个有汗型外胚层发育不良家系2例患者及6名正常成员的GJB6基因(Cx30基因)的全编码区序列进行突变分析.在确定突变后,取胎盘绒毛活检样本进一步行产前诊断.结果 在该家系的2例患者中检测出GJB6基因c.31G＞A的点突变,该突变导致了GJB6蛋白N-末端区域第11位甘氨酸被精氨酸替代(p.G11R),6名正常家系成员均未检测到该突变.产前诊断结果显示胎儿也携带有GJB6基因c.31G＞A突变.在终止妊娠后,流产物突变分析的结果与产前诊断结果一致.结论 GJB6基因c.31G＞A(p.G11R)错义突变是该有汗型外胚层发育不良家系的致病原因,通过基因诊断和产前诊断可以有效阻止致病基因的传递.     

一个眼牙指发育不良家系的基因突变分析

目的 旨在报道一个罕见的中国汉族眼牙指发育不良家系,并对该家系进行基因突变分析.方法 采用PCR及测序方法检测该家系先证者GJA1基因编码区及其侧翼序列的突变,然后在家系成员中验证,并通过Weblogo软件对可疑变异位点进行保守性分析;同时利用PCR、电泳及测序分析方法,检测HOXD13基因突变,排除患者由HOXD13基因突变致病的可能.结果 该家系内患者均携带GJA1基因的杂合突变c.605 C>T,正常个体均无此突变;该突变导致Cx43蛋白第202位氨基酸由精氨酸变成组氨酸(p.R202H);HOXD13基因未见异常.结论GJA1基因c.605 C>T(p.R202H)突变是该中国汉族眼牙指发育不良家系的致病突变,该突变为中国人群中首次报道.     

多重扩增子高通量测序对高苯丙氨酸血症基因变异实验室检测效率的研究

目的 对高苯丙氨酸血症(hyperphenylalaninemia,HPA)干血片DNA样本进行多重扩增子高通量测序检测,研究该方法对HPA潜在病因的实验室诊断价值.方法 选取既往70例生化筛查为HPA的患儿干血片,提取DNA后使用覆盖126种遗传病130个基因的扩增子建库试剂盒建库,进行高通量测序和数据分析,获得样本基因变异信息.经一代测序验证位点准确性后,分析对样本具有诊断价值的变异位点信息进行疑似病因判定,评价高通量测序的检测和诊断效能.结果 高通量测序结果和既往部分样品的一代测序结果完全吻合.70例样本中,5例为PAH和PTPS纯合突变,53例检测出PAH或PTPS单个基因2～3个杂合突变位点,还有2例检出HPA信号通路相关的SPR基因或GCH 1基因各1个突变.检测结果中c.158G>A、c.728G>A、c.1068C>A、c.1238G>C、c.611A>G位点为PAH基因频率最高的5个突变.结论 通过高通量测序技术,可准确检测基因突变,提供病因解释,为后续召回和临床诊断提供重要参考.     

1例新发TYK2基因突变患儿临床分子特征及免疫学表型研究

目的报道1例新发TYK2基因突变患儿的临床特征、诊治经过及免疫学表型,同时总结文献已报道的9例TYK2缺陷患者资料,期望促进对本病的早期识别及规范治疗。方法总结临床资料,采用Sanger测序验证本例患儿二代测序报告所示突变位点,预测错义突变对TYK2蛋白结构及功能的影响;利用蛋白印迹法检测TYK2蛋白表达,流式细胞术检测淋巴细胞各亚群分布以及NK细胞表达CD107a水平。结果此前报道的TYK2缺陷患者临床表现多变,以卡介苗病、反复感染、湿疹为主,部分可伴有血清IgE水平升高或嗜酸性粒细胞增多。因此是否将本病归为高IgE综合征存在很大争议。本例患儿TYK2基因发生复合杂合突变(c.3041TC,c.1253CA),TYK2蛋白表达缺失,血清IgE水平正常,但外周血嗜酸性粒细胞比例增高;外周血CD4~+T细胞、初始CD4~+T细胞比例减少,过渡型B细胞、中心记忆CD4~+T细胞及效应记忆CD4~+T细胞比例升高;Tfh细胞比例稍增高,Tfh1比例增高,Tfh2与Tfh17比例稍降低;同时,患儿NK细胞表达CD107a水平下降。结论本研究报道了TYK2基因新发突变1例,对于卡介苗接种后出现异常反应(特别是严重的卡介苗病)、有反复胞内菌及病毒感染、湿疹史的患儿应疑诊此病,二代测序有助于快速明确诊断。此例患儿外周血CD4~+T细胞比例下降,且各亚群分布异常,NK细胞表达CD107a水平下降,具体机制需进一步明确。     

典型遗传性非息肉病性结直肠癌家系临床病理及分子遗传学分析

目的 了解国人遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC）的临床病理及分子遗传学特征。方法 用微解剖、微卫星不稳定性分析、免疫组织化学及直接DNA测序方法,检测4例HNPCC患者的肿瘤组织微卫星不稳定性状态、错配修复基因hMSH2及hMLH1蛋白水平的表达变化以及生殖细胞突变。结果 4例先证者5个肿瘤组织均表现为高度微卫星不稳定性,3例表现为hMSH2蛋白表达异常,1例表现为hMLH1蛋白表达异常。检测出3个生殖细胞病理性突变。结论 中国人典型HNPCC病例中错配修复基因突变率较高。高度微卫星不稳定性、错配修复基因hMSH2及hMLH1蛋白表达异常与错配修复基因生殖细胞突变密切相关。微卫星不稳定性和错配修复基因蛋白分析可作为DNA测序前的筛选手段。     

一个枫糖尿病新发突变家系的遗传学分析及产前诊断应用

目的对1例枫糖尿症(maplesyrupurinedisease,MSUD)患者家系的基因突变,明确其遗传学病因,并应用于产前诊断。方法选取2017年在深圳市妇幼保健院新生儿科诊断的一例枫糖尿症患儿,女孩,发病年龄为出生后6天,采用二代高通量测序方法对患儿及父母进行BCKDHA基因、BCKDHB基因、DBT基因、DLD基因4个基因外显子编码区进行序列的捕获及测序,确定可疑的突变位点。用Sanger测序进行验证。应用生物信息学软件预测突变位点的氨基酸进化保守性和蛋白质结构及功能变化,并在患儿母亲再次妊娠时抽取胎儿绒毛组织,提取DNA,对相应的基因突变进行检测,用于产前诊断。结果高通量测序发现患儿BCKDHB基因双重杂合突变,为第7外显子c.818CT,第9外显子c.988GA两个基因错义突变,其中c.818CT遗传自于患儿母亲,c.988GA遗传自于患儿父亲。c.818CT为未报道过的新突变。两个突变位点均位于高度保守区域,突变导致相应氨基酸和蛋白质的结构及功能变化,从而影响支链氨基酸脱氢酶复合体的活性。患儿母亲再次妊娠未检测到BCKDHB基因相关突变。结论通过二代测序技术对枫糖尿症患儿家系相关基因序列的捕获及测序,了解MSUD的患儿的突变情况,且发现一个未报道过的新突变。并成功用于产前诊断。     

子宫内膜癌与K-ras基因突变的研究

目的:分析子宫内膜癌组织中K-ras基因突变状况及其与Ras蛋白表达的相关性,从基因水平探讨K-ras基因在子宫内膜癌发病中的作用机制.方法:诊断明确的子宫内膜癌手术切除标本108例及同期因其他病因行刮宫术的正常子宫内膜.应用免疫组织化学染色法检测K-ras的表达,PCR扩增-直接测序法检测K-ras基因第2外显子12、13密码子突变,分析K-ras基因突变对Ras蛋白表达的影响及临床意义.结果:K-ras蛋白阳性表达率在子宫内膜癌明显高于正常子宫内膜;子宫内膜癌中K-ras基因突变率为33.3%;其中第12位密码子突变占75.0%,突变位点均位于K-ras基因第12位密码子第2位碱基上;第13位密码子突变率为25%,突变位点位于K-ras基因第13位密码子第1、2位碱基上.K-ras基因突变与Ras蛋白表达成正相关.结论:K-ras蛋白的阳性表达率可能是预示子宫内膜癌预后的一个因素,K-ras基因12密码子G→T和G→A突变是主要的突变方式.12密码子的突变可能为Ras蛋白增多的原因.     

结节性硬化症TSC1/TSC2基因突变的高通量测序快速诊断

目的建立结节性硬化症TSC1/TSC2基因高通量测序技术以快速准确检测结节性硬化的TSC基因突变。方法对10例结节性硬化症患者及10例正常对照进行研究,利用长链PCR方法扩增TSC1及TSC2基因所有外显子区域,运用Ion PGMTM平台进行二代测序并运用常规测序验证。结果设计引物对TSC1及TSC2基因特异性扩增出7个长片段产物,产物长度介于13 kb~15 kb间;运用二代测序技术快速鉴定出10个致病突变,其中,7个突变位于TSC2基因,3个突变位于TSC1基因;所有突变经常规Sanger测序验证,结果一致。结论高通量二代测序技术可快速可靠诊断结节性硬化症TSC1、TSC2基因突变。     

遗传性球形红细胞增多症ANK1基因新发突变——2例病例报道及文献复习

目的:提高对遗传性球形红细胞增多症(HS)ANK1基因突变的认识。方法:回顾性分析2例存在ANK1基因新发突变的HS患儿的临床资料,并文献复习。结果:两例患儿均因贫血就诊。查体巩膜黄染,脾脏肿大。血常规呈正细胞正色素贫血,网织红细胞升高。胆红素升高,以间接胆红素升高为主。例1红细胞形态、脆性检查正常。基因测序分析,ANK1基因剪切突变(NM_001142446;exon 9)c.1008+1_1008+2insG(splicing)。例2外周血涂片球形红细胞增多,红细胞脆性增加。基因测序分析,ANK1基因一无义突变(NM_001142446;exon9)c.940CT(p.R314X)。两例Sanger测序患儿父母均未发现ANK1的突变。目前国内外至少报道了ANK1基因与HS有关的111个重要突变,本文病例临床表现符合HS,ANK1基因突变均未被HGMD数据库收录,无文献报道。结论:本例患儿符合HS的临床特点,新发现的ANK1基因突变可能是致病原因,基因检测可协助诊断HS。     

一例COMP基因杂合突变致假性软骨发育不全病例

目的 对假性软骨发育不全（PSACH）确诊患儿及其家系成员进行软骨寡聚基质蛋白（COMP）基因检测,并进行分析。方法 采集患儿及父母清晨空腹外周静脉血各5 mL,抽取基因组DNA,进行PCR扩增,采用高通量测序方式读出原始测序数据;同时,对于致病突变基因所在片段上下游设计引物,进行PCR扩增,对产物行Sanger测序。结果 患儿存在杂合突变c.1048＿1116del(exon 10,NM＿000095),导致氨基酸发生整码突变（p.N350＿D372del）。患儿父母均未检测出COMP基因突变位点。结论 COMP基因第10外显子杂合突变c.1048＿1116del(exon 10,NM＿000095)为PSACH的致病突变,在国内外PSACH患者中属于首次发现。患儿父母外周血基因正常,提示其父母可能与该突变的生殖腺嵌合体有关。     

干扰素-γ受体1部分缺陷病临床及分子特征分析

目的本研究纳入1例8月龄时发生播散性卡介苗病的女性患儿,旨在探讨IFNGR1缺陷病的临床及分子特征。方法总结1例常染色体显性遗传IFNGR1部分缺陷病患儿临床资料,Q-RT-PCR检测IL-12-IFN-γ轴功能,流式细胞术检测PHA刺激的T细胞表面IFNGR1蛋白表达,Sanger测序法分析IFNGR1基因。结果患儿常规免疫功能无异常。患儿抗凝血经BCG+rhIFN-γ同时刺激后IL-12B的表达水平比单独使用BCG刺激略有增加(P0.05),但较健康对照显著降低(P0.05);IFNGR1蛋白表达高于健康对照。基因测序发现患儿IFNGR1第6外显子存在c.819_822del4(p.N274Hfs*2)杂合突变,父母均无此突变。结论常染色体显性遗传IFNGR1基因部分缺陷病极为罕见,易发生播散性分枝杆菌感染,应尽早检测IL-12-IFN-γ轴功能、相关蛋白表达并行基因分析确诊。     

一例火棉胶样儿TGM1基因的突变分析CSCD

目的对1例维吾尔族火棉胶样患儿的TGM1基因进行突变分析,寻找其病因。方法对患儿及其父母进行常规染色体G显带核型分析,应用芯片高通量测序方法对患儿进行鱼鳞病及鱼鳞病样皮肤病25个相关基因的检测。 结果染色体G显带核型分析结果显示患儿及父母核型均正常;芯片捕获高通量测序检测出患儿TGM1基因的c.919C〉T（p.Arg307Trp）和c.856C〉T（p.Arg286Trp）复合杂合突变;前者为已知致病突变,后者为临床意义未明突变。Sanger测序验证,患儿父亲携带TGM1基因c.856C〉T（p.Arg286Trp）杂合突变,未检出患儿母亲TGM1基因c.919C〉T、c.856C〉T的位点突变。结论TGM1基因c.919C〉T和c.856C〉T复合杂合突变可能是患儿的致病原因。     

罕见G6PD缺乏症合并21-三体综合征的分子遗传学研究

目的对1例疑似G6PD缺乏症合并21-三体综合征患儿进行遗传学诊断并进行家系分析。方法 （1）外周血核型分析;（2）SNP-array检测;（3）目标区域捕获后高通量测序检测G6PD基因突变;（4）PCR＋Sanger测序进行家系共分离分析。结果 （1）患儿外周血染色体核型分析的结果：46,XY,＋21。SNP-array检测的结果：arr 21q11.2q22.3（15,006,457-48,097,372）x3;（2）患儿G6PD基因存在c.1466G〉T（p.Arg489Leu）纯合突变;（3）患儿母亲为G6PD基因c.1466G〉T（p.Arg489Leu）杂合突变携带者。结论某些染色体病可能合并单基因遗传病,故应注重遗传病诊断的全面性;基因突变的检出可为产前诊断或植入前遗传学诊断提供依据。     

青岛地区先天性心脏病患儿GATA-4基因突变的研究

目的研究山东省青岛地区先天性心脏病患儿GATA4基因突变情况。方法采用PCR直接测序技术对70例先天性心脏病患儿GATA-4基因的全部外显子进行基因突变筛查。结果在1例先天性心脏病室间隔缺损患儿中发现GA-TA4基因的杂合性突变,为第4外显子cDNA的886位点发生G〉A的杂合突变（c.886G〉A）,结果导致其编码蛋白的第296密码子由甘氨酸突变为丝氨酸（p.G296S）,为错义突变。结论在山东省青岛地区先天性心脏病患儿中发现了GATA-4基因的p.G296S突变,该突变可能导致先天性心脏病。