动员外周血CD34阳性细胞流式细胞术测定中的策略探讨

探索用流式细胞术测定动员外周血中CD34^ 细胞的简便有效的方法，以便在干细胞动员中进行有效的动态监测，及时收取干细胞，把握最佳移植效果，将经药物动员的移植供的外周血用CD34和CD45荧光抗体标记，用红细胞裂解液将红细胞裂解后经流式细胞仪检测，运用恰当的分析窗口，有效的设门分析结合干细胞的生物学特性，确定CD34^ 细胞在窗口中的确切位置，统计CD34^ 细胞在有核细胞中的比例，结果表明，通过本方法可有效地测定0.05%-0.1%的CD34^ 细胞的相对含量，在药物动员的第5或6天，多数患外周血中CD34^ 细胞达到峰值，某些患外周血中CD34^ 细胞可超过1%，结论：通过标记中的有效阻断和多参数分析，本方法可对动员外周血中微量的CD34^ 细胞进行有效的动态监测，对适时采集干细胞进行移植提供了重要的参考。     

CD34定量分析外周血干细胞的研究

目的定量检测外周血干细胞(PBSC).方法以藻红蛋白(PE)标记的CD34单克隆抗体,用流式细胞术(FCM)对34例白血病患者与33例健康成人外周血表达CD34抗原(CD34+)的细胞进行定量分析,并以普通光学显微镜(LM)、透射电子显微镜(TEM)、激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)分别对CD34+/CD34-细胞进行观察.结果经LSCM证实,FCM定量检测CD34+细胞特异性强,CD34+细胞在0%～16.1%范围内线性良好(r=0.9947),当CD34+细胞为91.0%、38.3%时,CV＜3%.CD34+/CDD34-细胞在LM、TEM下形态与结构相似,但CD34+细胞在LSCM下显示圆环状橙红色荧光.结论FCM检测外周血干细胞灵敏、特异、快速,但其方法学待进一步标准化.     

免疫磁性分选系统大量分选CD34+细胞的实验研究

CD3 4 细胞的分离纯化在自体外周血干细胞、异基因骨髓移植 /外周血干细胞移植及干细胞研究中具有重要的应用价值。为了摸索大量分选CD3 4 细胞的方法 ,本研究应用Isolex3 0 0i磁性分选系统富集CD3 4 细胞 ,采用流式细胞术监测分选前后细胞表面标志 ,经CD3 4 细胞体外增殖实验及克隆形成实验验证分选获得的CD3 4 细胞生物学活性。结果显示 ,所完成的 5例次自体外周血富集CD3 4 细胞时 ,先收获单个核细胞约 ( 3 .5 -6.0 )× 10 10 ,CD3 4 细胞占单个核细胞百分率为 ( 0 .5 5 - 1.2 ) % ;收获的CD3 4 阳性细胞总数为 ( 2 - 3 )× 10 8,纯度为 ( 75 - 85 ) % ,回收率为 ( 4 0 - 65 ) %。体外实验表明 ,在SCF IL 3 FL TPO EPO存在下 ,经过 3 - 4天培养 ,可扩增 2 - 3倍 ;经CFU GM、BFU E集落形成实验显示具有形成集落的能力 ,证实分选后细胞具有造血祖细胞生物活性。结论 :应用Isolex3 0 0iCD3 4 细胞分选仪可以高效大量富集CD3 4 细胞 ,适于临床应用。     

自体纯化CD34+细胞移植治疗严重自身免疫性疾病的初步研究

目的探讨自体外周血CD34+细胞移植治疗严重自身免疫性疾病的干细胞动员、细胞采集和分选、预处理和并发症处理等问题.方法 10例重度自身免疫性疾病患者接受自体外周血CD34+细胞移植治疗.采用环磷酰胺(CTX)+rhG-CSF方案动员外周血干细胞,并以CliniMACS细胞分选仪分选CD34+细胞,适时用CTX+抗胸腺细胞球蛋白(7例)或CTX+全身照射(3例)两种预处理方案后,进行CD34+细胞回输的方法治疗.结果经CTX+rhG-CSF方案动员并以CliniMACS细胞分选仪分选后,可获得(1.98±0.95)×108的CD34+细胞,其纯度为(91.4±10.6)%,回收率为(60.5±19.8)%.在回输(2.14±1.05)×106/kg的CD34+细胞后,ANC ≥0.5×109/L的时间为(8.6±2.5)d,血小板升至20×109/L的时间为(9.0±5.2)d.在造血恢复后,所有CD3+细胞、CD19+细胞和CD16+CD56+细胞均未恢复至移植前状态.在造血和免疫抑制时,巨细胞病毒感染的发生率较高.2例患者死于移植相关并发症.所有患者近期疗效满意,6例系统性红斑狼疮患者DAI评分由移植前的平均17分降为移植后的4分;类风湿关节炎患者DAS28评分由6.4分降至1.8分;干燥综合征患者的症状和体征均明显缓解.结论对常规治疗无效的严重自身免疫性疾病,自体外周血CD34+细胞移植是可选择的治疗方法之一.     

影响外周血CD34+细胞纯化的相关因素

背景:造血干细胞具有良好的自我复制和更新的能力,CD34+细胞具备有造血干细胞的标志.目的:分析影响外周血CD34+细胞纯化的因素.方法:90例患者,经粒细胞集落刺激因子5 μg/(kg·d)动员1～3 d后,应用COBE血细胞分离机采集外周血单个核细胞液80～100 mL,经Clini MACS免疫磁珠分选技术纯化CD34+细胞.结果与结论:90例CD34+细胞平均数为(1.73±1.15)×107,经流式细胞仪分析,CD34+细胞阳性率大于80%.COBE血细胞分离机单次收集的循环血量在980～1 100 mL时,利于CD34+细胞收集(P=0.005);动员后白细胞浓度在(16～21)×109 L-1时,利于CD34+细胞收集(P < 0.05);中间细胞和淋巴细胞总比例超11%时,利于CD34+细胞收集(P < 0.05);单个核细胞液血小板小于2 100×109 L-1时,利于CD34+细胞的收集(P < 0.05);年龄小于16岁,CD34+细胞数高(P=0.003);CD34+细胞抗体的温度、磁性标记及细胞处理时离心力的大小,均有影响.结果提示,经Clini MACS免疫磁珠细胞分选技术纯化的CD34+细胞能满足临床需要,实验稳定性好,重复性好;注重相关因素的影响,可提高纯化的CD34+细胞数量.     

经粒系集落刺激因子刺激外周血CD34~+细胞动员效果相关因素的考察

目的探讨粒系集落刺激因子(G-CSF)动员健康供者外周血造血干细胞效果的影响因素。方法对24例健康供者皮下注射G-CSF动员造血干细胞,检测外周血T淋巴细胞亚群和血常规数据。结果经G-CSF刺激后,外周血CD3+(%)、CD3+CD4+(%)、白细胞计数、血小板均明显升高(P0.05);而动员第4天、第5天、第6天骨有核细胞密度、CD34+细胞百分比无明显差别。经相关性分析,性别、年龄、体质量与CD34+细胞百分比呈负相关(P0.05),白细胞计数呈正相关(P0.01)。结论在一定范围内男性供者优于女性供者,年龄越小,体质量越轻,白细胞计数越高,经G-CSF动员的外周血造血干细胞CD34+细胞百分比越高。     

影响外周血CD34^＋细胞纯化的相关因素

背景：造血干细胞具有良好的自我复制和更新的能力,CD34^＋细胞具备有造血干细胞的标志。目的：分析影响外周血CD34^＋细胞纯化的因素。方法：90例患者,经粒细胞集落刺激因子5μg/（kg·d）动员1～3d后,应用COBE血细胞分离机采集外周血单个核细胞液80～100mL,经CliniMACS免疫磁珠分选技术纯化CD34^＋细胞。结果与结论：90例CD34^＋细胞平均数为（1.73±1.15）×107,经流式细胞仪分析,CD34^＋细胞阳性率大于80%。COBE血细胞分离机单次收集的循环血量在980～1100mL时,利于CD34^＋细胞收集（P=0.005）;动员后白细胞浓度在（16～21）×109L-1时,利于CD34^＋细胞收集（P〈0.05）;中间细胞和淋巴细胞总比例超11%时,利于CD34^＋细胞收集（P〈0.05）;单个核细胞液血小板小于2100×10^9L^-1时,利于CD34^＋细胞的收集（P〈0.05）;年龄小于16岁,CD34^＋细胞数高（P=0.003）;CD34^＋细胞抗体的温度、磁性标记及细胞处理时离心力的大小,均有影响。结果提示,经CliniMACS免疫磁珠细胞分选技术纯化的CD34^＋细胞能满足临床需要,实验稳定性好,重复性好;注重相关因素的影响,可提高纯化的CD34^＋细胞数量。     

流式细胞术三色分析调查成年人外周血CD34+造血干细胞绝对计数参考范围

造血干细胞移植 (ＨＳＣＴ)是治愈某些恶性血液病最有效的方法 ,也是治疗某些免疫性疾病、遗传性疾病、代谢性疾病 ,尤其某些实体肿瘤的根本途径。据统计 1997年全世界范围内约进行异体基因造血干细胞移植 4 .2 5万例 ,自体造血干细胞移植 6万余例 ,且每年以 15 %～ 2 0 %的高速增长[1] 。随着移植造血干细胞来源不断扩大 ,外周血干细胞移植 (ＰＢＳＣＴ)技术迅速发展 ,目前已占自体造血干细胞移植的90 %以上 ,异体造血干细胞移植的 2 0 %以上[2 ,3] 。对于有剂量要求的造血干细胞移植方案而言 ,精确的造血干细胞计数十分重要。在早期 ,临床…     

CD34~-造血干细胞的研究进展

造血干细胞(HSCs)的表型一直是研究的重要课题。一般认为:CD34~ 是骨髓HSCs的标志之一。但近年研究发现:存在一CD34~- HSCs群,它能长期重建造血并可分化为CD34~ 细胞,可能是CD34~ 细胞的前身细胞。本文对CD34~- HSCs从发现、含量、表面分子表达、体外体内生物学特性及体外培养扩增条件方面的研究进展等作一综述。     

CD34抗原阴性的造血干细胞

即往研究表明造血干细胞(HSC)存在于CD34~ 的细胞组群中,但最近研究发现在鼠和人体内存在有CD34~-的HSC。本文对CD34~-HSC的认识现况作了一简要的概述。     

CD34^＋细胞纯化在外周血干细胞移植中的应用

外周血干细胞的纯化方法有多种,其中,利用干细胞和一些肿瘤细胞,Ｔ细胞表面不同的抗原表达而设计的ＣＤ３４阳性／阴性选择已开始应用于临床,可以明显减少干细胞植入时移植物所含的有肿瘤细胞和Ｔ细胞的数量,从而降低了自身移植后的复发倾向和同种异基因移植后ＧＶＨＤ的发生。     

单个CD34^＋CD38^＋和CD34^＋CD38^—l细胞的增殖与分化性能

为深入探讨ＣＤ３４＾＋细胞亚群的不均一性及单个细胞的增殖分化特性，利用ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ自动细胞分选系统（ＡＣＤＵ）分选出单个ＣＤ３４＾＋亚群细胞：ＣＤ３４＾＋ＣＤ３８＾＋和ＣＤ３４＾＋ＣＤ３８＾－，在９６孔板无血清培养体系中，经ＳＣＦ、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ和Ｅｐｏ刺激，１４－１８天后扩增形成原代集藩。单个ＣＤ３４＾＋ＣＤ３８＾＋细胞形成原代集落的比例为３８．０％±９     

CD34+细胞分选及临床应用

CD34+是造血干细胞的免疫表型。采用某种方法选择CD34+细胞,选择后CD34+细胞浓集,其百分率有较大增高,并可以有效去除T细胞及某些恶性肿瘤细胞。选择CD34+细胞移植可以减少异基因移植后急性、重度移植物抗宿主病(GVHD),并可能减少自体移植后原发病复发。本文介绍了造血干细胞的免疫表型,生物学特性及CD34+细胞分选方法、临床应用等方面的研究进展。     

免疫磁珠法分选骨髓CD34+细胞:纯度影响因素的分析

背景:免疫磁珠分选技术已成为分选CD34+细胞的主要方法之一,在长期实验中发现诸多因素影响其分离纯度,包括磁珠与细胞孵育时干冰与碎冰的使用、磁珠与细胞孵育及分离时摇床的摇摆方向、红细胞裂解液裂解单个核细胞的使用等.目的:在免疫磁珠分选CD34+细胞过程中分别对上述影响因素进行分析改进,以提高分选CD34+细胞的纯度.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-07/2009-03在太原市中心医院皮肤科实验室完成.材料:骨髓象筛选正常的人骨髓29份,由太原市中心医院血液科提供,取材均经患者同意.CD34+免疫磁珠为Dynal公司产品.方法:采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离培养人骨髓单个核细胞,用免疫磁珠法分选骨髓CD34+细胞,对其分选过程中的主要环节如冰块与碎冰、摇床的种类以及红细胞裂解液的使用进行方法改进.方法1:按试剂盒提供方法进行磁珠常规分选CD34+细胞.方法2:在方法1基础上,用碎冰替代冰块进行磁珠与单个核细胞孵育.方法3:在方法2基础上,用万向摇床替代水平摇床.方法4:在方法3基础上,向单个核细胞中预先加入红细胞裂解液裂解残留红细胞.主要观察指标:通过流式细胞仪检测不同方法分选出的CD34+细胞纯度.结果:随着不同环节的逐渐改进,CD34+细胞纯度由(32.7±6.6)%升至(84.5±512)%,方法1,2,3,4所分选出的CD34+细胞纯度逐渐升高,组间方差分析差异显著(F=76.209,P<0.01),Bonferroni法两两比较差异亦有非常显著性意义(P<0.01).结论:碎冰、万向摇床及红细胞裂解液的使用能有效提高免疫磁珠法分选人骨髓CD34+细胞的纯度.     

CD34—造血干细胞的研究进展

造血干细胞（ＨＳＣｓ）的表型一直是研究的重要课题。一般认为：ＣＤ３４＾＋是骨髓ＨＳＣｓ的标志之一,但近年研究发现：存在－ＣＤ３４＾－ＨＳＣｓ群,它能长期重建造血并可分化主国ＣＤ３４＾＋细胞,可能是ＣＤ３４＾＋细胞的前身细胞。本对ＣＤ３４＾－ＨＳＣｓ从发现、含量、表面分子表达、体外体内生物学特性及体外培养扩增条件方面的研究进展等作一综述。     

关于CD34-造血干细胞的新观点

最近的研究表明CD34-造血干细胞的存在,改变了传统的造血干细胞必须表达CD34抗原的观点.近来大量资料对其功能、与CD34+细胞的关系、表面标志以及基因表达等作了报道,现对此做一综述.     

异基因外周血干细胞移植供者CD34细胞及亚群的测定

目的　探讨流式细胞技术测定异基因外周血干细胞移植 (allo PBSCT)中供者细胞表面分化抗原 34 (CD34 )细胞及其亚群变化和意义。方法　应用流式细胞多色分析技术 ,测定 15 1份allo PBSCT供者 ,经细胞因子动员后外周血标本CD34 及其亚群变化及影响因素。结果　在检测的15 1份标本中 ,CD34 细胞占外周血单个核细胞的 (0 .95 4± 0 .46 6 ) % ,含量为 (3.5 5± 2 .41)× 10 9/L ;其中CD34 CD38-亚群含量为 (0 .2 5 3± 0 .2 40 )× 10 9/L ,占CD34 细胞的 6 .78% ;CD34 HLA DR 亚群含量为 (0 .2 73± 0 .310 )× 10 9/L ,占CD34 细胞的 6 .82 % ,两者差异无显著意义 (P >0 0 5 ) ;随着采集次数的增加 ,CD34 细胞及其亚群数量逐渐减少 (P <0 .0 5 ) ;随着供者年龄增加 ,其外周血CD34 细胞数逐渐减少 ,≥ 40岁供者CD34 细胞百分比和含量比 <2 0岁供者分别降低了 47%和 5 0 % ;动员后外周血CD34 细胞数存在性别差异 ,男性供者外周血CD34 细胞数较女性高 2 3%。结论　应用流式细胞多色技术测定外周血造血干祖细胞 ,不仅能确定造血细胞数量 ,而且对造血干祖细胞的质量进行评价 ,为临床干细胞移植治疗提供重要数据。