辐射敏感性新基因UHRF1真核表达载体的构建及鉴定

目的构建UHRF1的真核表达载体,并验证其在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达。方法采用RT-PCR方法,从乳腺癌细胞MCF-7的总cDNA中扩增出2.3kb的UHRF1基因的cDNA片段,经限制性内切酶KpnⅠ与XhoⅠ双酶切,定向克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建重组质粒pcDNA3（＋）-UHRF1,利用限制性内切酶双酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;构建成功的重组质粒,经脂质体Lipofactamin2000介导转染MDA-MB-231细胞,G418筛选阳性克隆,以RT-PCR和Western blot检测UHRF1的mRNA和蛋白的表达。结果获得全长约为2.3kb的UHRF1基因片段;重组质粒经限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ酶切、电泳后显示2.3kb的UHRF1目的片段和5.4kb的pcDNA3载体片段,即UHRF1基因的cDNA已正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中;UHRF1转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后的RT-PCR和Western blot的结果显示：UHRF1的mRNA和蛋白水平均呈现高表达。结论成功构建UHRF1基因的真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

人DNA聚合酶δ2真核载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建人DNA聚合酶δ2(DNA Polδ2)真核表达载体,转染人胚胎肾细胞(HEK293)并观察其表达水平。方法用逆转录PCR(RT-PCR)方法从人胚肺成纤维细胞(WI38细胞)扩增目的基因DNA Polδ2cDNA片段,与pMD-18T载体连接,构建质粒pMD-18T-Polδ2;将目的片段DNA Polδ2从质粒pMD-18T-Polδ2切下,与真核表达载体pcDNA 3.1(+)连接,构建正义及反义真核表达载体pcDNA 3.1-Polδ2。应用脂质体转染试剂,分别将正义、反义真表达载体pcDNA 3.1-Polδ2,空载体pcDNA3.1(+)转染至HEK293细胞,同时设置阴性对照;用RT-PCR和Western blot方法检测目的基因DNA Polδ2mRNA及蛋白表达水平。结果正义和反义DNA Polδ2真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2中插入的目的片段与GENEBANK上DNA Polδ2cDNA序列完全一致。RT-PCR方法显示正义及反义真核表达载体转染组细胞的目的基因DNA Polδ2mRNA表达均明显高于空载体转染组及阴性对照组;Western blot显示正义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达明显增强,反义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达阴性。结论人DNA Polδ2正义及反义真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2构建成功。     

HIV-1B亚型包膜糖蛋白gp120基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型包膜糖蛋白gp120基因,构建真核表达载体,并在真核细胞中表达,进一步为制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗奠定基础。方法以克隆好的HIV-1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板,根据Genbank中gp120基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5'端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性地扩增gp120基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gp120编码基因的真核表达载体,并进行酶切鉴定分析pcDNA3.1( )/gp120。在脂质体介导下转染HepG2细胞,经G418压力筛选建立稳定转染gp120基因的细胞系,用RT-PCR及Westernboltting检测其在HepG2细胞中的表达。结果重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切成5.4kb与1.44kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1( )中插入了gp120基因片断,测序结果表明编码框正确。RT-PCR及Westernblotting证实稳定转染gp120基因的HepG2细胞系中有该基因的表达。结论成功构建了HIV-1B亚型包膜糖蛋白gp120基因的真核表达载体pcDNA3.1( )/gp120,并在HepG2细胞中获得稳定表达。     

血红素氧合酶-1基因真核表达载体的构建及其在大鼠腹膜间皮细胞中的表达

目的 构建大鼠血红素氧合酶-1(HO-1)真核表达载体,并以该重组表达载体体外转染培养的大鼠腹膜间皮细胞(RPMCs).方法 从SD大鼠脾脏中提取总RNA,并经RT-PCR扩增HO-1基因的CDS区全长片段,将PCR产物克隆至pMD-18T载体,BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切后获取HO-1片段,用T4DNA连接酶将HO-1片段与双酶切后的真核表达载体pcDNA3.1(-)连接,构建大鼠HO-1真核表达载体pcDNA3.1(-)-HO-1.酶切鉴定和测序验证后,利用脂质体介导将重组质粒转染原代培养的RPMCs,通过RT-PCR和Western blotting检测RPMCs中HO-1的表达.结果 成功克隆了大鼠HO-1基因并构建了其真核表达载体pcDNA3.1(-)-HO-1,酶切鉴定证实基因正确地插入表达载体中,并经DNA测序验证.pcDNA3.1(-)-HO-1转染RPMCs后,经RT-PCR和Western blotting检测,HO-1在RPMCs中获得高效表达.结论 HO-1基因真核表达载体的成功构建以及HO-1在RPMCs中的高效表达,为进一步研究HO-1在腹膜透析所致RPMCs损伤中的作用奠定了基础.     

人肝素酶基因正反义荧光真核表达载体的构建及肺癌细胞转染

目的: 构建正义和反义人肝素酶与绿色荧光蛋白真核共表达载体,并分别转染人低转移肺癌细胞株95C及高转移细胞株95D. 方法: 采用基因重组技术,用EcoRⅠ从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7 kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入 pIRES2-EGFP质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并用脂质体法将肝素酶正义真核表达载体转入人低转移肺癌细胞株95C、反义真核表达载体转入人高转移肺癌细胞株95D,G418筛选后,荧光倒置显微镜检测转染结果. 结果: 经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成5.3 1.7 kb两条DNA片段,而反义重组质粒为6.5和0.5 kb两条DNA片段,与理论计算值完全一致;转染后肺癌细胞倒置荧光显微下呈绿色荧光. 结论: 成功构建了人肝素酶的正、反义真核表达载体,并成功转染人低、高转移肺癌细胞株,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对肿瘤细胞的影响奠定了基础.     

肾上腺髓质素真核表达质粒的构建及其在大鼠近端肾小管上皮细胞中的表达

目的构建大鼠肾上腺髓质素(ADM)真核表达质粒,观察其在大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)中的表达。方法提取大鼠肾上腺组织总RNA,RT-PCR扩增ADM全长cDNA;将扩增产物连接于pMT-18T载体,双酶切及测序鉴定重组质粒。用限制性内切酶BamHⅠ/EcoRⅠ分别对pMT-18T-ADM和真核表达质粒pcDNA3.1双酶切;将目的基因定向克隆到pcDNA3.1载体上;对重组质粒进行双酶切鉴定。将重组质粒通过脂质体介导转染NRK-52E,RT-PCR检测ADM表达。结果特异扩增出ADM片段,大小为585 bp;片段成功插入pcDNA3.1载体中。RT-PCR方法证明NRK-52E中存在ADM高表达。结论成功构建大鼠ADM真核表达质粒,并将其成功转染NRK-52E。     

人CXC型趋化因子受体CXCR6真核表达载体的构建及生物学功能研究

目的:克隆和构建带人CXC型趋化因子受体6(CXCR6)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+).CXCR6,分析瞬时转染CXCR6基因对人乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移能力的影响.方法:Trizol一步法抽提人外周血单个核细胞(PBMC)总RNA,RT-PCR扩增CXCR6全长基因,克隆入T载体,测序,双酶切连入真核表达载体peDNA3.1(+),酶切鉴定.将构建好的pcDNA3.1(+)-CXCR6瞬时转染.MDA-MB-231细胞,RT-PCR和Western blotting鉴定重组质粒的表达.利用微孔隔离小室检测转入人CXCR6基因的MDA-MB-231细胞的迁移能力.结果:扩增出人CXCR6基因全长,测序结果和GenBank记载完全一致,成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+).瞬时转染pcDNA3.1(+)-CXCR6显著增强MDA.MB-23l细胞的迁移能力.结论:成功构建带有人CXCR6基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-CXCR6,为CXCR6在肿瘤学中的研究奠定基础.     

小鼠pcDNA3.1/CXCL14真核表达载体的构建、表达及意义

目的 构建小鼠pcDNA3.1/CXCL14真核表达载体,观察其在293T细胞中的表达,为进一步探讨CXCL14对脂肪细胞因子、氧化应激及胰岛素信号转导通路的影响提供工具.方法 从C57/BL胚鼠肝脏组织中抽提RNA,RT-PCR扩增CX-CL14基因片段,并将其插入pcDNA3.1进行测序,鉴定正确构建pcDNA3.1/CXCL14后转染293T细胞,用RT-PCR法和Western blot法分别从mRNA水平和蛋白质水平分别检测CXCL14的表达情况.结果 重构质粒经PCR、限制性核酸内切酶Nhe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切以及DNA序列分析鉴定,表明真核表达载体构建正确;以脂质体法转染293T细胞后,RT-PCR、Western blot能检测到目的蛋白表达.结论 成功构建了小鼠pcDNA3.1/CXCL14真核表达载体并能在真核细胞中进行表达.     

反义c-myc表达载体的构建及其瞬时表达对HepG2.2.15细胞的体外生物学效应

目的:构建反义RNA表达载体pcDNA3.1-as-myc,建立新型的c-myc反义RNA肝癌靶向性转移系统,研究瞬时表达对HepG2.2.15细胞的体外生物学效应。方法:XbaI和HindIII双酶切携带目的基因的质粒pcMYC和pcDNA3.1(-)真核表达载体,T4DNA连接酶连接,构建c-myc反义RNA表达载体。合成针对表皮生长因子受体(EGFR)的相应16肽GE7和流感病毒血凝素功能域的HA20寡肽,并与多聚赖氨酸连接,连接物与c-myc的反义RNA表达载体混合,构建新型c-myc反义RNA肝癌靶向性转移系统,即四元复合体。结果:成功构建反义RNA表达载体pcDNA3.1-as-myc,建立了as-myc四元复合体基因转移系统,经HepG2.2.15细胞系瞬时转染,证实c-myc蛋白的表达下降。结论:构建的反义表达载体pcDNA3.1-as-myc具有阻断c-myc表达的效应。     

NOV基因真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

目的获得NOV基因真核表达载体并检测其在细胞中的表达.方法利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法,从新鲜大鼠大脑组织的总cDNA中扩增出1 165 bp的NOV基因的cDNA编码区序列,然后用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His( )/lacZ质粒中,用脂质体法将载体转染入COS-7细胞中,用Western blot和免疫细胞化学方法检测其表达情况.结果 NOV基因cDNA已经正确克隆到真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His( )/lacZ质粒中;体外转染入COS-7细胞中后,可见转染细胞有NOV蛋白的表达.结论本实验所构建的重组质粒为NOV基因的作用研究提供了有利的分子工具.     

pcDNA3.1(-)/UBE2C质粒在Chang Liver细胞中的表达和鉴定

[摘要] 目的 构建pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒并建立人正常肝细胞Chang Liver的稳定表达株。方法 采用RT-PCR法从HepG2细胞中克隆得到UBE2C cDNA全长序列, 将之与pMD18-T载体连接。双酶切和测序鉴定后,再将UBE2C片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)。构建好的pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒经双酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将其转入Chang Liver细胞株中,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再用Western blot法检测转染后UBE2C的蛋白表达水平。结果 pcDNA3.1(-)/UBE2C质粒经双酶切鉴定和DNA测序证实,目的基因UBE2C的序列完全正确,真核表达质粒成功构建。Western blot检测显示,转pcDNA3.1(-)/UBE2C组UBE2C的蛋白表达水平高于转pcDNA3.1(-)组,具有统计学意义（P﹥0.01）。结论 成功构建UBE2C基因的真核表达质粒并建立其稳定表达的Chang Liver细胞株,为下一步研究奠定基础。     

HPV16 E5蛋白原核表达、鉴定及真核表达稳定株的筛选

目的研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16 E5蛋白原核和真核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPVl6感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16 E5基因,经BamHⅠ和HindIⅡ双酶切后插入相同酶切的pET32a（＋）载体,转染JMl09感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Wlescem blotting检测目标蛋白表达情况。将BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pET32（＋）,E5质粒后取得的E5全基因片段转入pcDNA3．1（＋）空质粒,构建pcDNA3．1（＋）m5真核表达质粒并对NIH3T3细胞进行转染,最后用G418进行稳定表达株的筛选,并采用RT．PCR鉴定细胞内HPV16 E5基因表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32/E5,在1mmol／LPTG、28℃诱导条件下BL21（DE3）菌体中HPVl6E5．TRX融合蛋白占菌体总蛋白的10％左右。真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／E5在成功转染NIH3T3细胞后于250μg/mlG418浓度时筛选21d得到了E5基因稳定表达株,RT-PCR产物测序得到了HPV16 E5基因全序列。结论成功构建了pET32／E5原核和pcDNA3．1（＋）／E5真核表达质粒,HPV16 E5蛋白在大肠杆菌和NIH3T3细胞中的稳定表达．这些结果为进一步深入研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用奠定了坚实基础。     

脂质体介导质粒pcDNA3.1/ KDRn3基因在转染小鼠视网膜组织中的表达及定位

目的：将真核表达质粒pcDNA3.1/ KDRn3以脂质体介导转染C57BL/6J小鼠视网膜组织,观察其表达及定位。方法：首先对真核表达质粒pcDNA3.1/KDRn3进行扩增和酶切鉴定,然后将20只健康C57BL/6J小鼠随机分成对照组及玻璃体腔注射后2、5、7和14 d组,每组4只鼠8眼。注射组每眼玻璃体腔注射脂质体pcDNA3.1/ KDRn3复合物1 μL,分别于注射后2、5、7及14 d摘除眼球,制成石蜡切片,用KDRn3蛋白免疫荧光染色在激光共聚焦显微镜下观察KDRn3蛋白表达及定位。结果：Xho Ⅰ和BamHⅠ进行双酶切,切下900 bp大小片段,与目的片段大小一致,表明该质粒确实为KDRn3。注射后2 d在视网膜神经节细胞层细胞胞浆内可见红色荧光信号,注射后5和7 d组视网膜神经节细胞层、内核层部分细胞胞浆内可见红色荧光信号;注射后14 d视网膜神经节细胞层、部分内核层细胞胞浆内可见红色荧光信号,但发出红色荧光信号的细胞数明显减少。　结论：阳离子脂质体可有效将pcDNA3.1/ KDRn3基因转染小鼠视网膜组织,并得到持续表达。     

核基质蛋白SAFB真核表达载体的构建及其鉴定

目的构建人SAFB基因真核表达载体,为SAFB基因功能研究提供研究基础。方法设计人SAFB特异性引物,提取人正常结直肠上皮组织总RNA,应用RT-PCR方法提取人SAFBcDNA,通过双酶切及测序鉴定,将SAFB克隆至pcDNA3.1（-）,构建人SAFB基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）/SAFB,转染SW480细胞,用WesternBlot技术检测目的蛋白的表达。结果成功扩增人SAFB全长cDNA,双酶切鉴定和测序结果证实成功构建pcDNA3.1（-）/SAFB真核表达载体,转染细胞后,可检测出分子量约为140KD的目的蛋白。结论获得人SAFB基因全长cDNA并成功构建了SAFB真核表达载体,证实pcDNA3.1（-）/SAFB转染SW480细胞后可表达SAFB蛋白,为深入研究SAFB基因在肿瘤发生发展中的作用提供了基础。     

乏氧/辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因载体的构建及表达

目的：构建乏氧（HRE）/辐射（Egr1）双敏感启动子介导的分泌型人TRAIL (shTRAIL)基因表达载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,观察乏氧和辐射对其表达的影响。 方法：利用化学合成HRE上、下链,PCR扩增得到双链HRE;pMD19T-Egr1经Sac Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切得到Egr1;pshuttle-shTRAIL 经Kpn Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切得到shTRAIL;利用基因重组技术构建含有HRE/Egr1双敏感启动子介导shTRAIL的表达载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,经酶切、PCR和测序鉴定正确。肺腺癌A549细胞分为正常组、乏氧组（1%）、照射组(6 Gy)和乏氧加照射组;表达载体转染肺腺癌A549细胞,RT-PCR及ELISA法检测shTRAIL的表达。结果：BamH Ⅰ和Sma Ⅰ酶切,所得片段大小分别为1 284和4 998　bp、2 292和3 990 bp;以Egr1和shTRAIL引物PCR扩增该载体,得到469和820 bp产物;将pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL进行测序,所得结果与设计一致,说明构建正确。转染肺腺癌A549细胞后,乏氧组、辐射组及乏氧加照射组shTRAIL mRNA和蛋白表达增加,与对照组比较差异有显著性（P<0.05）,且乏氧加照射组表达更明显。结论：成功地构建了乏氧/辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因表达的载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL;乏氧及照射能够诱导TRAIL表达增加,且二者具有协同作用。     

人源性肝细胞生长因子高效真核表达载体的构建

目的 :通过基因克隆构建人源性肝细胞生长因子 (hHDSSF)真核高效表达重组体。方法 :通过T A克隆构建hHDSSF中间重组体pGEM hHDSSF ;酶切鉴定后构建真核表达重组体pcDNA3.1hisB hHDSSF ;末端终止法测定插入片断基因序列。结果 :酶切证实hHDSSF完整插入pGEM中 ;酶切筛选得到正向插入的真核表达重组体pcDNA3.1hisB hHDSSF ,并经序列分析证明。结论 :成功构建了真核表达重组体pcDNA3.1hisB hHDSSF ,为进一步转染真核细胞建立稳定的转染表达细胞株和高效表达hHDSSF奠定了坚实的基础。     

人p21活化激酶6基因截短区域的GST标签原核表达质粒的构建及其重组蛋白的表达

目的：构建人p21活化激酶6(PAK6)的各个截短区域原核表达质粒,并诱导和鉴定其融合蛋白的表达,为探讨PAK6基因的生物学功能提供依据。方法：以真核表达质粒pcDNA3.1-GFP-PAK6 为模板,PCR扩增出 PAK6基因的各个截短片段。所获得的各截短片段经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后克隆至GST标签的原核表达载体pGEX-5X-1中。将构建的PAK6各截短质粒转化入E.coli BL21中,采用IPTG诱导PAK6基因截短融合蛋白表达, 采用Western blotting 法鉴定PAK6基因截短融合蛋白的表达。结果：EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后得到与预期大小相符的载体片段（5 000 bp）和PAK6 1-55(165 bp)、PAK6 56-210(465 bp)、PAK6 211-410（600 bp）及PAK6 385-681（891 bp） 4个片段。Western blotting检测, PAK6各截短区域质粒GST-PAK6截短融合蛋白相对分子质量分别为32 000、43 000、48 000和60 000。结论：成功构建PAK6基因各个截短区域GST标签原核表达质粒并表达其重组蛋白。     

大鼠野生型IRF-1基因和IRF-1 shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠野生型干扰素调节因子1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)基因及其特异性短发夹状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察IRF-1在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达及沉默IRF-1基因的情况。方法:用DNA重组技术将针对大鼠IRF-1基因的CDS区序列和针对其不同位点所设计的3种shRNA序列分别克隆到pcDNA3.1及pGCsi.U6.neo.GFP真核表达质粒中。在酶切鉴定及序列测定正确后,用GenEscortTMⅢ转染试剂将上述两种质粒分别转染入培养的大鼠GMC中,然后用Western blot检查IRF-1融合蛋白的表达,同时筛选最佳沉默效率的shRNA。结果:限制性酶切及核酸序列分析证明,两种重组质粒均构建成功。Western blot证实构建的pcDNA3.1/IRF-1质粒在大鼠GMC中能正确表达,且IRF-1shRNA-2具有最佳沉默效率。结论:本实验成功构建了大鼠野生型IRF-1及其特异性的shRNA真核表达质粒,为进一步研究IRF-1基因的生物学功能提供了必要的实验材料。     

pRluc-KOR真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的：构建与海肾萤光素酶（Rluc）融合的κ型阿片受体（KOR）真核表达载体,用于生物发光共振能量转移法（BRET）检测apelin受体和KOR之间的相互作用．方法：以质粒pcDNA3．1-KOR为模板,PCR方法扩增KOR．扩增的KOR用NotI和XhoI双酶切,同时用这两种酶双酶切质粒pRluc．将这两种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌Top10．挑取菌落培养,提取质粒,行酶切鉴定及测序．将测序正确的重组载体用脂质体法转染人胚胎肾（HEK293）细胞,免疫荧光染色,共聚焦显微镜观察．结果：扩增出了1条1145bp的片段,与预期的KOR大小相符,质粒酶切结果显示pRluc-KOR被切成2条片段,其中一条为pRluc载体大小,另一条为目的片段大小．经测序鉴定,序列与GenBank（NM_000912）中的序列高度同源．共聚焦显微镜观察显示,阿片受体主要表达在细胞膜上．结论：构建成功了pRluc—KOR重组表达载体,此表达载体可用于检测KOR与apelin受体或与其他受体之间的相互作用．     

应用AdEasy-1腺病毒系统构建含人nm23-H1基因的重组腺病毒质粒

目的应用AdEasy-1腺病毒载体系统制备含人nm23-H1基因的重组腺病毒载体。方法设计带有限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切位点的引物,利用PCR法从质粒pMD18-T-nm23-H1上克隆出nm23-H1 cDNA并定向连接至穿梭载体pShuttle-CMV上,行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定和测序。将pAdEasy-1腺病毒骨架载体电转化B J5183感受态细菌,Pm eⅠ酶线性化并去磷酸化处理重组质粒pShuttle-CMV-nm23-H1,并电转化含pAdEasy-1的B J5183感受态细菌,利用卡那霉素筛选,PacⅠ酶切鉴定,重组腺病毒质粒在XLGold-10感受态细菌中大量扩增,产物行PCR鉴定。结果经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切pShuttle-CMV-nm23质粒得到460bp的片段,该片段经测序与nm23-H1基因序列一致,重组腺病毒质粒pAdEasy-nm23-H1经PacⅠ酶切后可以得到3.0kb和4.5kb的片段,大量扩增重组腺病毒质粒后行PCR仍然得到460bp的片段。结论利用AdEasy-1腺病毒系统成功构建含人nm23-H1基因重组腺病毒质粒。