紫杉醇和顺铂诱导下的凋亡卵巢癌细胞对树突细胞提呈功能影响

目的:本研究旨在探索紫杉醇、顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡后能否具有较强的免疫原性,并可以被抗原提呈细胞交叉提呈并促进免疫应答.方法:用巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)刺激人外周血单核细胞分化诱导为树突状细胞(DC),6d后将DC和经紫杉醇联合顺铂在体外诱导发生凋亡的人卵巢癌细胞株共同培养,并以冻融细胞共培养DC组和单独DC组作对照,共培养4 h后,进行激光扫描共聚焦显微镜观察DC细胞对凋亡细胞的吞噬作用,同时以流式细胞术(FCM)检测不同培养组DC的分化和成熟程度.结果:紫杉醇、顺铂诱导的凋亡卵巢癌细胞可被DC有效吞噬,与对照组相比,凋亡组DCs的表达及成熟度均明显增高,并具有统计学意义(P＜0.05).结论:紫杉醇、顺铂诱导的凋亡卵巢癌细胞具有较强的免疫原性,可以促进DC的分化和成熟.     

转染FasL基因树突状细胞诱导异基因小鼠脾脏T细胞凋亡的研究

目的 制备稳定表达FasL蛋白的小鼠骨髓源树突状细胞(dendritic cell,DC)并探讨其诱导异基因小鼠脾脏T细胞凋亡的机理.方法 采用培养基选择法体外培养小鼠骨髓源DC,脂质体法转染FasL基因至小鼠成熟DC,实时定量PCR检测转染前后FasL mRNA的表达,流式细胞仪和免疫蛋白印迹检测转染前后FasL蛋白的表达.异系小鼠静脉分别输注未转染DC、转染空质粒DC和转染FasL的DC,7 d后TdT介导的原位末端标记法(TUNEL)和流式细胞仪检测脾脏中T淋巴细胞凋亡.结果 体外培养可获得成熟的小鼠骨髓源DC,转染FasL基因的DC较未转染DC FasL mRNA和FasL蛋白表达明显升高.对脾脏中T淋巴细胞凋亡的检测发现,转染FasL的DC组凋亡指数(11.67±1.53)明显高于未转染DC组(2.67±0.58)和转染空质粒组(3.33±0.58),P＜0.01.结论 培养基选择法可收获大量骨髓源DC,脂质体转染FasL基因至小鼠骨髓源DC,可以使DC高表达FasL蛋白.转染FasL的DC输注能明显诱导异系小鼠脾脏T淋巴细胞凋亡.     

氢化可的松对人外周血来源树突状细胞的诱导凋亡作用研究

旨在探讨氢化可的松对人外周血单核细胞来源树突状细胞 (DC )的凋亡诱导作用及其表型、功能的变化 ;采用细胞因子体外诱导人外周血来源DC ,加入不同浓度的氢化可的松进行培养 ;以细胞计数、PI染色测定细胞周期、间接荧光表型分析、ELISA法测定DC分泌的IL 12和3H TdR掺入测定DC对T细胞的激发作用 ;实验结果表明 ,外周血贴壁的单核细胞在细胞因子的诱导下可以分化为成熟的DC ,不同浓度 (2 μg/ml～ 5 0 μg/ml)的氢化可的松可下调DC表达的CD80和HLA DR分子 (分别下降 41 1%和 10 9% ) ,并使其分泌IL 12的能力明显下降 (由 38 1pg下降为 0 ) ,DC对自体T细胞的激发功能明显降低 ,而且一定浓度的氢化可的松还可以使DC发生凋亡 (凋亡率可达 5 6 6 % )。糖皮质激素不仅通过下调DC表达的协同刺激分子及其分泌的IL 12从而影响DC对T细胞的激发作用 ,而且可以直接诱导DC发生凋亡 ,从而下调免疫应答的发生。     

创伤弧菌诱导树突状细胞凋亡的过程观察

目的 实验观察创伤弧菌(Vibrio vulnificus,Vv)诱导鼠树突状细胞(dendritic cell,DC)凋亡的过程.方法 建立小鼠树突状细胞(DC2.4株)与创伤弧菌(Vv1.1758株)混合培养模型,DAPI荧光染色分析细胞凋亡的形态特征,DNA Ladder检测凋亡细胞的DNA片段化水平分析,Annexin V FITC/PI染色分析DC2.4细胞凋亡率,分光光度法测定caspase-3、caspase-8活性,JC-1荧光标记检测线粒体膜电位(△Ψm)变化.结果 Vv1.1758株与DC2.4细胞混合培养4h时DAPI荧光染色出现典型的凋亡特征——染色质浓缩及边缘化；DNA琼脂糖凝胶电泳出现凋亡条带；2、4、6h细胞凋亡率分别为(37.8±9.8)％、(54.3±12.7)％和(68.2±14.6)％；1、2、4h线粒体膜电位(△ψm)分别下降了7.1％、16.1％与46.7％；caspase-8活性在1.5h增高,2h达高峰(2.48±0.19) U/μg,而caspase-3活性于3h开始增高,4h达高峰(1.91±0.16) U/μg.结论 创伤弧菌诱导树突状细胞可通过线粒体膜电位下降及激活caspase-8启动子两条途径,最终活化效应因子caspase-3,促使细胞凋亡发生.     

树突状细胞直接抗肿瘤作用研究进展

树突状细胞(DC)是功能最强的抗原递呈细胞,其除可将肿瘤抗原递呈给T细胞以间接杀伤肿瘤细胞外,还可作为效应细胞直接发挥抗肿瘤作用.DC可通过细胞间接触和分泌细胞因子直接抑制肿瘤细胞的增殖,并可通过与TNF家族密切相关的凋亡通路直接杀伤敏感肿瘤细胞.DC的这一固有免疫功能在肿瘤免疫治疗中具有重要的意义.     

转化生长因子β1基因转染对大鼠骨髓树突状细胞免疫功能的影响

目的 研究人转化生长因子β1(TGFβ1)基因修饰对大鼠骨髓树突状细胞(DC)免疫功能的影响。方法 构建TGFβ1-pcDNA3质粒并转染未成熟DC。检测转染后DC的TGFβ1表达及其功能变化,输注1周后柃测TGFβ1-DC在受者脾和淋巴结的分布、T细胞凋亡水平及T细胞端粒酶表达。结果 TGFβ1-pcDNA3质粒转染DC能有效抑制DC的成熟和分化,并下调Dc的多种功能。TGFβ1基因转染不仅能降低DC对LPS的反应,同时抑制DC在MLR中刺激T细胞增殖的能力。TGFβ1-DC输注受者后,1周内可在脾和淋巴结内形成微嵌合,并有效诱导T细胞的凋亡,抑制T细胞端粒酶的活性和表达。结论 TGFβ1基因能有效抑制DC的多种功能,可用于诱导机体免疫耐受。     

CTLA4Ig修饰的树突状细胞在体外对淋巴细胞增殖及胞毒效应的影响

目的:探讨CTLA4Ig修饰的树突状细胞(DC)对T细胞增殖和细胞毒性T细胞(CTL)细胞毒活性的影响。方法:采用脂质体转染法,将质粒pG/CTLA4Ig转入DC。采用ELISA和SDS-PAGE鉴定转染质粒pG/CTLA4Ig的DC培养上清。以C57BL/6小鼠的单个核细胞作为反应细胞,以未修饰的DC及修饰的DC作为刺激细胞,共培养6 d,用MTT比色法检测细胞的增殖。用乳酸脱氢酶法和ELISA法,分别测定细胞毒活性及T细胞凋亡。结果:CTLA4Ig融合蛋白和修饰的DC,对同种细胞刺激的增殖反应有明显地抑制作用;而未修饰的DC可显著诱导淋巴细胞增殖反应。CTLA4Ig融合蛋白和修饰的DC,对特异性CTL的细胞毒活性有明显地抑制作用,且可诱导T细胞凋亡。结论:稳定表达CTLA4Ig融合蛋白的DC,对T细胞增殖和对CTL的细胞毒活性具有明显地抑制作用,并可诱导T细胞凋亡。     

TRAIL基因修饰的树突状细胞诱导黑色素瘤细胞凋亡的实验研究

为研究TRAIL基因修饰的树突状细胞诱导黑色素瘤细胞凋亡的作用,研究用携带TRAIL基因的重组腺病毒转染小鼠来源的树突状细胞(dendritic cell,DC),采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测DC TRAIL蛋白的表达水平;将DC-TRAIL与B16黑色素瘤细胞混合培养,显微镜观察细胞生长情况,FCM检测B16细胞的凋亡情况;构建小鼠黑色素瘤模型,分别将DC-TRAIL、DC和PBS皮下注射于肿瘤接种部位,观察小鼠的瘤体生长情况,测量瘤体的体积。结果显示:用Ad-TRAIL转染DC后DC可高表达TRAIL。DC-TRAIL组与DC组相比可明显诱导肿瘤细胞凋亡。用DC-TRAIL、DC和PBS处理黑色素瘤移植小鼠2周后,发现DC-TRAIL组小鼠平均肿瘤体积为(0.33±0.10)cm~3,DC组小鼠平均肿瘤体积为(1.32±0.29)cm~3,PBS组小鼠平均肿瘤体积为(3.01±0.52)cm~3。与DC组和PBS组相比,DC-TRAIL组可明显抑制肿瘤生长。     

树突状细胞与NK细胞相互作用的研究进展

树突状细胞(DC)不但参与天然免疫,而且是启动获得性免疫的关键因素。自然杀伤细胞(NK细胞)是天然免疫的重要组成部分。DC与NK细胞之间存在相互作用。DC可通过分泌IL-12和IL-18等细胞因子与细胞间直接接触而影响NK细胞功能。NK细胞不但可通过死亡受体途径促进DC凋亡溶解,还可通过所分泌的细胞因子促进DC的成熟,其作用结果取决于NK/DC的比例。     

017 树突状细胞、转化生长因子β1与移植免疫研究进展

树突状细胞(dendrtic cell,DC)是分布广泛的抗原呈递细胞,一方面可激活静息型T细胞,启动T细胞抗原特异性免疫反应,另一方面由于未成熟DC可诱导T细胞凋亡,在移植免疫中也发挥重要作用.近年研究发现转化生长因子β1(TGF-β1)不仅具有下调淋巴细胞和巨噬细胞功能等非特异性免疫抑制作用,还能抑制DC分化成熟从而诱导供者特异性移植耐受.     

布鲁菌S2株感染巨噬细胞与树突状细胞的比较

目的 比较猪布鲁菌S2菌株感染巨噬细胞和树突状细胞(DC)的特点.方法 采用瑞氏-吉姆萨染色法观察细胞形态并计算吞噬率;用ELISA法测定细胞培养上清中的IL-12和TNF-α以及与T细胞共培养上清中IFN-γ和IL-4的含量;用annexin-V-FITC/PI双染,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 感染S2菌株1h后巨噬细胞的吞噬率为(43.6±4.8)％,显著高于DC的吞噬率(13.08±2.36)％ (P ＜0.05);正常巨噬细胞凋亡率为(3.09±1.21)％感染S2菌株后6、12和24h的凋亡率分别为(19.89±1.36)％、(22.73±2.21)％和(42.44±3.12)％,明显高于DC感染后相同时间点的凋亡率(P＜0.05),正常DC凋亡率为(1.82±0.01)％,DC感染S2菌株6、12、24h凋亡率分别为(3.76±0.13)％、(7.87±0.56)％和(9.08±0.23)％.巨噬细胞在感染S2菌株后24、48 h分泌的IL-12均明显低于DC分泌IL-12的量(P＜0.05);24、48、72 h分泌的TNF-α量均明显低于DC(P ＜0.01);在24、48、72 h与T细胞共培养分泌的IFN-γ含量均明显低于DC(P＜0.01).结论 巨噬细胞吞噬猪布鲁菌S2菌株的能力高于DC,猪布鲁菌S2感染后巨噬细胞的凋亡率高于DC,感染S2菌株后DC的活化及提呈抗原并激活T细胞的能力强于巨噬细胞.     

凋亡肿瘤细胞负载的树突状细胞对抗原特异性CTL的激活

为探讨凋亡Daudi细胞负载的树突状细胞 (DC )激发诱导肿瘤抗原特异性CTL及其生物学特性 ,采用常规方法从人外周血单个核细胞 (PBMC )诱导DC ,激发型CD40mAb联合 50Gyγ射线辐照诱导Daudi凋亡后负载DC ,然后与自体T细胞共育 ,并联合IL 2激发诱导肿瘤特异性CTL ;采用免疫荧光标记和流式细胞仪测定分析膜分子的表达 ;ELISA检测细胞因子的产生 ;Dextran FITC内吞实验分析DC的抗原摄取能力 ;3H掺入试验和51 Cr释放试验分别测定CTL的增殖和细胞毒效应。结果 :(1 )细胞因子序贯体外诱导 7d的DC ,对Dextran吞噬能力最强 ;(2 )CD40mAb诱导联合γ射线辐照 ,能有效介导Daudi细胞的凋亡 ;(3 )抗原负载联合CD40mAb激发可使DC上调表达CD1a、CD80、CD86和HLA DR ,并能促进IL 1 2的分泌 ;(4)凋亡Daudi负载后的DC在激发型CD40mAb作用下 ,能激发和扩增对Daudi细胞具有高效和特异杀伤作用的细胞毒性T细胞。因而认为凋亡肿瘤细胞负载联合CD40mAb刺激的DC可有效激活和扩增肿瘤特异性CTL。     

肿瘤通过抑制树突状细胞功能逃避免疫监视的研究进展

树突状细胞(DC)在T细胞介导的免疫反应中起核心作用,可在体内外诱导强烈的抗肿瘤免疫反应.DC作为恶性肿瘤免疫治疗因子被广泛的研究.如今,开发了多种基于DC的抗肿瘤免疫治疗.然而肿瘤也会影响宿主的造血功能以及导致大量未成熟和免疫耐受的DC产生,这些直接抑制免疫反应.了解肿瘤相关DC的免疫抑制作用机制,可提高对肿瘤免疫逃逸的认识.     

树突状细胞、转化生长因子β1与移植免疫研究进展

树突状细胞 (dendrticcell,DC)是分布广泛的抗原呈递细胞 ,一方面可激活静息型T细胞 ,启动T细胞抗原特异性免疫反应 ,另一方面由于未成熟DC可诱导T细胞凋亡 ,在移植免疫中也发挥重要作用。近年研究发现转化生长因子 β1(TGF β1)不仅具有下调淋巴细胞和巨噬细胞功能等非特异性免疫抑制作用 ,还能抑制DC分化成熟从而诱导供者特异性移植耐受。     

信号素6d(Sema6d)对树突状细胞天然免疫功能的影响及机制研究

目的:研究信号素6d(Sema6d)分子在树突状细胞(DC)成熟、活化及迁移中的作用及调控机制.方法:qPCR筛选并获得DC中趋化因子配体19(CCL19)和趋化因子配体21(CCL21)刺激12 h后表达显著上调的信号素6亚家族分子信号素6d.流式细胞术检测干扰信号素6d后DC成熟、凋亡标志变化,qPCR和Trans...     

雷帕霉素通过PU.1对树突状细胞DC-SIGN表达及生物学功能影响的研究

探讨雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)对树突状细胞(DC)表面DC-SIGN及其胞内转录因子PU.1基因表达,以及对DC功能的影响。体外培养人外周血单个核细胞来源的DC,结合PU.1基因特异性siRNA转染,给予不同浓度Rapa处理。采用流式细胞术及Western blot检测DC表面DC-SIGN表达变化;细胞迁移试验检测DC迁移能力;混合淋巴细胞反应检测DC刺激T细胞增殖能力。结果显示,Rapa呈剂量依赖性尤以10ng/ml时可下调DC-SIGN表达(P<0.01),同时可抑制DC胞内PU.1基因表达,以及DC迁移及刺激T细胞能力均受到明显抑制(P<0.01)。另发现,经siRNA沉默PU.1基因后,Rapa对DC-SIGN表达基本无影响。本研究表明,Rapa可通过抑制DC-SIGN表达,从而产生对DC迁移、刺激T细胞能力的调抑效应。这一效应可能与Rapa影响PU.1基因转录途径有关。     

脂多糖通过调控树突状细胞存活和分泌细胞因子促进CD4~+T细胞增殖

目的探索脂多糖(LPS)调节树突状细胞(DC)的功能,促进T细胞免疫反应的机制。方法应用CDllc~+免疫磁珠分离小鼠脾脏DC。LPS处理DC后。流式细胞术检测DC表面的共刺激分子CD80和CD86的表达,ELISA检测DC培养上清中白细胞介素4(IL-4)、IL-5、IL-6、IL-12p40、IL-12p70、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平,异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双染色结合流式细胞术检测DC凋亡,Phos-flow技术检测核因子κB P65(NF-κB P65)磷酸化水平,实时定量PCR检测基因芯片变化差异明显基因的mRNA水平,DC经OVA323-329多肽处理后与和CD4~+T细胞共培养,流式细胞术检测CD4~+T细胞的增殖。结果利用CD11 c磁珠分离,可获得纯度为93%的DC,LPS可以上调DC表面CD80和CD86的表达,增强DC介导的CD4~+T细胞的增殖。并且LPS能促进促炎细胞因子IL-12 p40、TNF-α和IL-6的分泌,同时通过NF-κB通路抑制DC的凋亡。结论 LPS通过调节DC的存活和细胞因子的产生促进DC介导的CD4~+T细胞的增殖。     

脓毒症患者T淋巴细胞凋亡的调节因素

脓毒症可同时存在免疫功能亢进和抑制，在此过程中，T淋巴细胞凋亡发挥重要作用，其所导致的免疫细胞数量，功能的变化，是导致脓毒症患者从免疫功能亢进到抑制乃至麻痹的一个重要因素。在T淋巴细胞的凋亡过程中，Treg、DC、TNF—α及其受体、Bcl家族、IL-2等起着重要的调节作用，这些物质相互作川，最终造成了T细胞凋亡，引起免疫抑制，使病原体难以清除，且易于继发感染。针对与T淋巴细胞凋亡有关的因素进行治疗有了长足进步，并在一定程度上抑制了T细胞凋亡，但却未能达到应有的效果，也未能改善患者的预后，究其原因多在于对脓毒症机制的认识有一定局限性，为了进一步阐明脓毒症的发生机理，对脓毒症患者T细胞凋亡过程中起重要作用的调节因素作简单介绍     

荷载人生存素的多表位树突状细胞疫苗的抗肿瘤活性研究

目的:观察荷载人生存素(survivin)的多表位树突状细胞(DC)疫苗的抗肿瘤活性.方法:分别将含4个sur-vivin的HLA-A2类限制性CD8+ CTL表位和1个CD4+ Th细胞表位的重组真核表达质粒pPIRESneo3.0-survivin(4)/Th,以及含4个CD8+ CTL表位的重组质粒pPIRESneo3.0-survivin (4),转染人DC并制备DC疫苗.实验分为survivin(4)/Th组、survivin (4)组、空质粒组、未转染DC与T细胞共培养组和单独T淋巴细胞组.DC疫苗作用后,MCF-7细胞的凋亡率明显高于survivin(4)组(P＜0.05),亦明显高于空质粒组、未转染DC与T细胞共培养组和单独T淋巴细胞组(P＜0.05).运用流式细胞术(FCM)分别检测DC表面CD83、CD86、T淋巴细胞表面CD4、CD8a的表达以及DC疫苗作用后MCF-7乳腺癌细胞的凋亡.用ELISA法检测上清中IFN-γ的含量.用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测DC疫苗诱导的CTL对MCF-7细胞的抑制率.结果:流式细胞术检测显示,人DC高表达CD83、CD86;人外周血T淋巴细胞高表达CD4、CD8a;survivin (4)/Th组IFN-γ的含量[(66.50±3.34) ng/L]明显高于survivin(4)组[(46.10±1.35)ng/L]、空质粒组[(25.17±0.32) ng/L]、未转染DC与T细胞共培养组[(25.47±0.95)ng/L]和单独T淋巴细胞组[(23.73 +0.50)ng/L],P＜0.05.survivin (4)/Th组中MCF-7细胞的抑制率明显高于survivin (4)组、空质粒组、未转染DC与T细胞共培养组和单独T淋巴细胞组(P＜0.05).DC疫苗作用后,MCF-7细胞的凋亡率[ (10.63±0.29)％]明显高于survivin(4)组(P＜0.05),亦明显高于空质粒组、未转染DC与T细胞共培养组和单独T淋巴细胞组(P＜0.05).结论:荷载多个survivin的CD8+ CTL表位的树突状细胞肿瘤疫苗具有很强的抗肿瘤活性,CD4+ Th细胞对CD8+ CTL的抗肿瘤方面有明显的促进作用.     

29 人外周血树状突细胞抗肿瘤作用的探讨

<正>有关树状突细胞(Dendritic Cell,DC)在肿瘤免疫中作用的研究,多限于观察肿瘤局部DC的变化,而对DC抗肿瘤作用的探讨尚属起步.本研究采用多因素不同水平的全面试验设计,进行DC的体外抗肿瘤实验.首先应用新的三步分离法分离、纯化,获得纯度为60～70%的DC;又在用重组IL-2诱导淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK 细胞)的基础上,以中性红摄入比色法检测细胞毒活性,观察了体外DC对LAK细胞杀伤H_7402肿瘤细胞活性的影响,也观察了形态学变化.结果:活细胞观察发现DC联合LAK作用组残存的活肿瘤细胞比单LAK作用组明显减少,HE染色见肿瘤细胞呈不同程度的坏死状态.免疫细胞化学染色显示S-100蛋白阳性的DC与LAK细胞形成花环,DC、LAK和肿瘤细胞三者形成细胞簇.扫描电镜下可见DC借助突起与肿瘤细胞相连,也与LAK细胞接触,三者形成细胞簇.细胞毒活性检测所得各孔光密度OD值经方差分析和参数估计,表明LAK细胞体外杀伤H_(7402)肿瘤细胞的活性随效靶比增加而增强,DC能协同LAK细胞的活性,上调其杀伤肿瘤的作用(P<0.01),并以中等剂量的DC上调速度最明显,加入IL-2后,DC的调节作用更有上升.提示人外周血DC在细胞免疫抗肿瘤过程中起重要使用.