小鼠B7-H4慢病毒表达载体的构建及对脾细胞增殖的影响

目的:构建小鼠B7-H4(mB7-H4)慢病毒表达载体并观察B7-H4蛋白对脾细胞增殖的影响。方法:从BALB/c小鼠肺脏中克隆B7-H4基因,构建表达载体mB7-H4-EGFP,酶切后克隆入慢病毒表达载体pCDH1-MCS1-EF1-Puro中,命名为pCDH1-mB7-H4-EGFP;以包含起始密码和多克隆位点的寡核苷酸取代mB7-H4作为对照载体pCDH1-Control-EGFP。分别与包装载体混合物一起经LipofectamineTM2000转染入293T细胞包装成病毒颗粒,感染293T细胞。pCDH1-mB7-H4-EGFP重组慢病毒感染的293T细胞分别与BALB/c、C57BL/6、BALB/c∶C57BL/6(1∶1)小鼠脾细胞混合培养,用MTT法检测其对脾细胞增殖的影响,对照为pCDH1-Con-trol-EGFP重组慢病毒感染的293T细胞进行的相同处理。结果:mB7-H4被成功克隆,测序证实与GenBank的mRNA核酸序列2个核苷酸有差异,但与其编码的氨基酸一致。pCDH1-mB7-H4-EGFP慢病毒表达载体被成功构建。mB7-H4蛋白表达在293T细胞表面,与对照相比,对BALB/c、C57BL/6、BALB/c∶C57BL/6(1∶1)小鼠脾细胞增殖均具有明显抑制作用。结论:成功构建小鼠B7-H4慢病毒表达载体,感染293T细胞后表达出对脾细胞增殖具有抑制活性的mB7-H4膜表面蛋白。     

HPV16 E7基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建HPV16 E7慢病毒表达载体。方法用RT-PCR方法从Caski细胞中扩增HPV16 E7基因的编码区序列,对扩增出目的片段酶切纯化后将目的片段交换连接入慢病毒表达质粒,酶切鉴定并测序正确后进行慢病毒包装和滴度测定。Western-blot验证3FLAG-E7融合蛋白在293 T细胞中的表达。结果成功获得HPV16 E7基因,成功将HPV16 E7克隆到慢病毒表达质粒中,且包装产生的慢病毒颗粒能成功表达3FLAG-E7融合蛋白。结论成功构建HVP16 E7和flag基因共表达的慢病毒表达载体,为进一步研究HPV16 E7基因的功能建立了高效稳定的转基因技术平台。     

BTLA对调节性T细胞发育及功能的影响

目的 研究B和T淋巴细胞弱化因子(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)对调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)发育和功能的影响.方法 构建在Treg中特异性敲除BTLA基因的小鼠模型,使用流式细胞术检测该模型小鼠中枢及外周各淋巴器官中T细胞外周环境稳态、T细胞的活...     

应用Gateway技术构建过表达β-catenin基因的慢病毒载体

目的 应用Gateway技术构建靶向过表达β-catenin基因的慢病毒载体,验证该载体的功能.方法 利用多位点Gateway克隆技术,通过BP重组反应,构建穿梭载体pDown-Ctnnb1;再通过LR重组反应,将pUp-EF1A、pDown-Ctnnb1、pTail-IRES/DsRed-Express2和母载体pLV.Des3d.P/puro 4个质粒构建成表达载体pLV.EX3d.P/puro-EF1A＞Ctnnb1 ＞IRES/DsRed-Express2;再转化到感受态细胞stbl3,经PCR筛选菌落阳性克隆测序鉴定.将成功构建的慢病毒表达载体转染293T细胞,用实时荧光定量PCR法验证重组载体对β-catenin基因mRNA水平的影响.结果 菌落PCR筛选和DNA测序鉴定显示入门克隆和表达载体插入片段序列正确,实时荧光定量PCR证实β-catenin基因mRNA水平显著上调(P＜0.01).结论 成功构建能显著上调β-catenin基因mRNA表达的慢病毒载体.     

SDF-1慢病毒表达载体的构建和鉴定

基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF-1)主要由骨髓基质细胞合成和分泌,是骨髓造血微环境的重要组成部分,在造血干细胞动员、归巢、定植和增殖中发挥重要作用,同时,可单独或协同G-CSF、TPO等细胞因子通过细胞内信号系统增强维持造血干细胞的功能,与自体外周干细胞移植后造血恢复密切相关[1].     

小鼠ST2基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

<正>ST2是白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)受体家族的一员[1],是IL-33的受体。它最初是在成纤维细胞增殖的初期阶段发现的一个基因,也被称为T1,Fit-1[2-3]。由于剪切和拼接方式的不同,ST2在人体内有跨膜型ST2(transmembrane ST2 isoform,ST2L)、可溶型ST2(soluble ST2,sST2)及ST2变体     

小鼠BTLA胞外功能区基因克隆表达及其对DC表面B7分子表达的影响

目的:研究重组谷胱甘肽S-转移酶(GST)-小鼠B/T细胞弱化因子包外功能区(mBTLAext)融合蛋白(GST-mBT-LAext)对小鼠树突状细胞系DC2.4表面B7分子表达的影响。方法:采用RT-PCR技术从小鼠脾细胞总RNA中逆转录mB-TLAcDNA。将其胞外功能区基因克隆入原核表达载体pGEX-4T-2中,构建重组表达质粒pGEX-4T-2/mBTLAext并转化E.coliBL21(DE3),以1mmol/L的IPTG诱导表达。提取包涵体,经变性、负性后,采用GlutathioneSepharose4B柱纯化可溶性的GST-mBTLAext。将不同浓度的GST-mBTLAext加入到DC2.4的培养体系中,采用流式细胞术检测其对DC上B7-1和B7-2表达的影响。结果:成功地克隆了mBTLA基因,并构建了重组原核表达载体。变性、复性,经GlutathioneSepharose4B柱纯化,获得了可溶性的GST-mBTLAext融合蛋白。经SDS-PAGE鉴定表明,融合蛋白的相对分子质量(Mr)为43000,同预期的结果一致。流式细胞术检测显示,GST-mBTLAext可上调DC2.4上B7-1的表达并呈剂量依赖性,这一作用可被抗GST-mBTLAext血清阻断。未检测到GST-mBT-LAextDC2.4上B7-2的表达有影响。结论:BTLA对DC2.4表面B7分子表达的上调可能是BTLA-HVEM途径反向信号对DC作用的结果,对进一步研究其对DC生物学行为的影响及其分子机制具有重要的理论意义。     

PEX慢病毒载体构建及其在293FT细胞中的分泌表达

目的 构建含人MMP-9信号肽-MMP-2-PEX片段的重组慢病毒,并在293FT细胞中分泌表达PEX蛋白.方法 利用RT-PCR、基因重组等技术,构建含MMP-9信号肽-MMP-2-PEX片段的重组慢病毒表达载体pBPLV-signal-PEX,在脂质体介导下与包装质粒(pLP1、pLP2)、包膜质粒(pLP/VSVG)共转染293FT细胞,包装产生慢病毒并进行滴度测定.慢病毒感染2931;3细胞后,Western印迹法检测293FI细胞培养上清中PEX的表达.结果 酶切和DNA测序表明慢病毒表达载pBPLV-signal-PEX构建正确,四质粒共转染293FT细胞成功获得慢病毒;慢病毒感染293FT细胞后,在细胞培养卜清中可检测到PEX蛋白的表达.结论 成功构建了含人PEX的重组慢病毒,在体外有效感染293fT细胞并持续分泌表达目的 蛋白,为进一步研究PEX在肿瘤侵袭与转移中的作用提供实验基础.     

人microRNA-146a慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建针对has-miR-146a的慢病毒表达载体,并鉴定成熟has-miR-146a在细胞内表达水平。方法PCR扩增pri-miR-146a,克隆于慢病毒载体plenti-GFP中,转染293FT细胞,收获并浓缩慢病毒颗粒,感染Jurkat细胞。结果成功构建了has-miR-146a的慢病毒表达载体,建立了高效转染系统。结论建立了高效稳定表达has-miR-146a的慢病毒转染系统。     

Hsa-mir-196b慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建Hsa-mir-196b慢病毒表达载体并对其进行鉴定。方法以正常人外周血DNA为模板,PCR扩增得到目的基因。通过HpaⅠ/XhoⅠ双酶切及其后的连接将其插入Lentilox3.7（pLL-3.7）质粒中。PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pLL-3.7-mir-196b、pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.91三质粒系统共感染HEK-293FT细胞,包装生产慢病毒。将所得病毒悬液梯度稀释后感染HEK293FT细胞,以检测病毒滴度,并用实时定量PCR检测慢病毒感染后Hsa-mir-196b的表达变化。结果 PCR及测序结果证明成功构建了pLL-3.7-mir-196b重组质粒。所得慢病毒上清滴度为（7.2±1.1）×107TU/ml。感染慢病毒的239FT细胞中,Hsa-mir-196b的表达量相对于未感染细胞提高了约24倍。结论成功构建Hsa-mir-196b慢病毒表达载体。     

BIRC5 shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的:应用RNA干扰技术,以人BIRC5基因为靶基因,设计合成3对短发夹结构的互补DNA序列和一对阴性对照序列,构建慢病毒干扰载体并鉴定。方法:将设计合成的单链引物退火成双链oligo序列,连接入经AgeI和EcoR I双酶切线性化的pMAGic慢病毒质粒载体中,经转化DH5α感受态细胞并筛选出阳性克隆,采用PCR扩增和DNA测序鉴定阳性克隆。结果:PCR扩增产物经凝胶电泳阳性克隆得到335 bp条带,阴性克隆得到298 bp条带,DNA测序结果证实其含设计合成序列。结论:4对BIRC5 shRNA重组慢病毒表达载体构建成功,为研究靶向BIRC5 siRNA对肿瘤细胞增殖抑制与诱导凋亡作用及基因治疗研究奠定了实验基础。     

Beclin1 基因慢病毒表达载体的构建和鉴定

背景：Beclin1基因是哺乳动物的自噬调控基因。 目的：实验拟构建Beclin1 基因慢病毒过表达载体。 方法：聚合酶链反应扩增目的基因Beclin1 后插入慢病毒表达载体pLenex中,构建重组载体pLenex-Beclin1。使用聚合酶链反应、双酶切和DNA的测序方法对其进行鉴定,并与辅助包装质粒共感染293T细胞。慢病毒颗粒转染非小细胞肺癌A549细胞后,用蛋白质印迹法检测Beclin1 基因的过表达效率。 结果与结论：聚合酶链反应鉴定结果显示扩增的阳性片段已插入pLenex载体,聚合酶链反应、双酶切和DNA测序结果表明,重组慢病毒载体pLenex-Beclin1 的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染A549细胞后,细胞内Beclin1蛋白高效表达。结果证实,实验成功构建了Beclin1 基因慢病毒过表达载体。     

小鼠端粒酶蛋白亚单位真核表达载体的构建和序列测定

目的： 克隆小鼠端粒酶蛋白亚单位(mTERT)的cDNA，构建真核表达载体并进行序列测定。 方法: 从肝癌细胞中提取总RNA，采用RT-PCR 技术扩增mTERT的基因编码区序列，将序列定向克隆至真核表达载体pAC，并进行序列测定。 结果： 获得mTERT编码区 3 369 bp的cDNA片段，用PCR和限制性内切酶分析鉴定，表明获得重组质粒pAC-mTERT。通过对mTERT编码区cDNA序列测序证实其与GenBank中的已知序列一致。 结论： 成功克隆了mTERT编码区序列，并构建了其真核表达载体，为以TERT为基础的肿瘤生物治疗奠定基础。     

趋化因子受体7基因绿色荧光慢病毒载体构建及在未成熟树突状细胞中的表达**

背景：趋化因子受体7(chemokine receptor-7, CCR7)是树突状细胞从外周迁移至淋巴系统发挥作用的最重要的启动和调节者,但未成熟树突状细胞表面不表达CCR7,因此利用携带CCR7基因的未成熟树突状细胞可以更好地诱导免疫耐受。 目的：构建携带小鼠CCR7基因的绿色荧光蛋白重组慢病毒载体,观察其在未成熟树突状细胞中的表达。 方法：采用RT-PCR扩增小鼠CCR7基因并克隆至pCR-Blunt载体。将CCR7 DNA片段及IRES-GFP连入慢病毒转移质粒LV-Lac,生成重组慢病毒质粒LV-CCR7。采用脂质体转染法将慢病毒系统3质粒(重组慢病毒质粒LV-CCR7、包装质粒     ΔNRF及包膜质粒pVSVG)共转染包装慢病毒,重组慢病毒感染未成熟树突状细胞,光学显微镜观察细胞状态,流式细胞术鉴定CCR7蛋白的表达。 结果与结论：实验成功扩增出小鼠CCR7 DNA片段并克隆至pCR-Blunt载体,亚克隆构建慢病毒表达载体LV-CCR7,经3质粒包装系统感染293 FT细胞后,24 h于荧光显微镜下均观察到绿色荧光蛋白阳性表达,病毒滴度为108 U/L以上,获得携带CCR7基因的重组慢病毒。慢病毒颗粒可有效感染未成熟树突状细胞,荧光显微镜可见大量GFP蛋白表达,阳性细胞达50%,流式细胞术检测到CCR7蛋白表达,LV-CCR7基因修饰的未成熟树突状细胞仍保持在未成熟状态。结果证实,实验成功构建携带小鼠CCR7基因绿色荧光慢病毒载体LV-CCR7,并可在未成熟树突状细胞细胞中表达。 关键词：趋化因子受体7;未成熟树突状细胞;慢病毒载体;真核表达;组织工程 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.01.029     

小鼠survivin基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

背景：间充质干细胞体内有限的存活能力严重制约其用于体内治疗方面的应用,因此寻找一种能延长存活能力的实验方法是间充质干细胞进行体内实验的重要前提。 目的：应用pLV.Des3d.P/hygro构建小鼠survivin基因的慢病毒表达载体。 方法：采用Oligo核酸软件对Genbank上所发表的小鼠survivin mRNA序列进行分析,设计一对survivin基因上下游引物,利用Gateway 克隆方法,分别在其两端添加attB重组位点,运用PCR扩增mSurvivin和IRES/EmGFP,将PCR产物进行BP反应然后转化到Stbl3感受态菌,通过卡那霉素抗性筛选、PCR鉴定,选取鉴定正确的pDown-mSurvivin和pTail-IRES/EmGFP克隆测序。将pDown-mSurvivin和pTail-IRES/EmGFP与pLV.Des3d.P/hygro混合进行LR反应,构建慢病毒载体pLV.EX3d.P/hygro-EF1A>mSurvivin>IRES/EmGFP,再次进行PCR、测序的鉴定。 结果与结论：显示基因序列克隆正确,成功构建了含有小鼠survivin基因的重组慢病毒表达载体。说明慢病毒表达载体pLV.EX3d.P/hygro-EF1A>mSurvivin>IRES/EmGFP构建成功,为下一步研究survivin在间充质干细胞中抗凋亡作用奠定基础。     

SPARC基因RNAi慢病毒载体的构建及其在SKM-1细胞中的表达

目的:构建SPARC基因RNAi慢病毒载体获得稳定产毒的细胞,并观察其对人MDS细胞株SKM-1细胞的转染效率及其对SPARC基因的抑制效率。方法:针对已经筛选确定的SPARC基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生GC-shSPARC慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。用GC-shSPARC、pHelper1.0和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度,并将获得的重组慢病毒GC-shSPARC转染SKM-1细胞,通过荧光显微镜检测转染后GFP表达情况,测定转染效率;RT-PCR和Western blot分别验证转染后SKM-1细胞SPARC mRNA及蛋白的表达。结果:经测序证实,构建出了SPARC shRNA的慢病毒载体GC-sh SPARC。包装、浓缩病毒悬液的滴度为1×109TU/mL。荧光显微镜下能直接观察到转染组细胞的GFP表达,转染效率为70%,RT-PCR、Western blot技术分别检测到GC-shSPARC慢病毒转染SKM-1细胞SPARC mRNA、SPARC蛋白表达水平较空白组明显降低(P<0.05)。结论:成功构建SPARC基因RNAi慢病毒载体,其能高效干扰SKM-1细胞SPARC基因的表达。     

靶向TPX2基因shRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建靶向TPX2基因的RNA干扰慢病毒载体,获得稳定感染的人宫颈癌He La细胞株,为宫颈癌细胞TPX2基因的相关研究奠定基础。方法以TPX2基因为靶点,设计并合成四组对应于目标shRNA的双链DNA发卡结构,分别与慢病毒载体Pglv2-U6-Puro连接经转化感受态细胞,阳性克隆经测序、病毒包装、滴度测定、感染细胞、嘌呤霉素筛选得到TPX2基因沉默稳转细胞株。实时荧光定量PCR和Western blot检测TPX2 mRNA和蛋白的沉默效果。流式细胞计量术检测其对细胞周期分布及凋亡的影响。结果测序结果证实5种慢病毒载体均包装成功,采用0.4μg/m L嘌呤霉素成功筛选出TPX2沉默细胞株。He La细胞感染4种载有TPX2-shRNA的重组慢病毒后,均发挥了沉默效应,尤以TPX2-shRNA-1沉默效果最佳,TPX2 mRNA相对表达量为0.21±0.07,低于对照组的1.08±0.07(P0.01);TPX2蛋白质相对表达量为0.19±0.28,低于对照组的0.64±0.03(P0.01);G2及S期细胞高于对照组(P0.05);细胞凋亡率明显多于对照组(P0.05)。结论获得了一种有效TPX2基因的干扰序列,成功构建了TPX2 shRNA慢病毒干扰载体,并筛选出TPX2基因沉默的He La细胞株,为进一步研究TPX2基因在宫颈癌中的作用奠定了基础。     

小鼠IL-10重组慢病毒载体的构建和病毒包装

目的:构建小鼠IL-10重组慢病毒表达载体并进行包装,为进一步研究IL-10基因修饰树突细胞在哮喘免疫耐受中的作用提供实验基础。方法:小鼠IL-10基因片段经PCR扩增后,与酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,获得PGC-LV-IL-10重组慢病毒并转化细菌感受态细胞。克隆菌落行PCR鉴定,对阳性的重组质粒进行测序并转入293T细胞,荧光显微镜下观察GFP表达并行Western blot鉴定。将重组质粒与慢病毒包装系统一同转染293T细胞进行病毒包装,Real-time定量PCR法检测病毒滴度。结果:DNA测序结果及Western blot鉴定证实成功构建小鼠IL-10重组慢病毒载体,对其进行包装后测定慢病毒滴度为2×108TU/ml。结论:成功构建并包装小鼠IL-10重组慢病毒表达载体。     

携EGFP的人Synoviolin基因慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建携EGFP的人Synoviolin基因慢病毒表达载体。方法应用基因重组手段,SalⅠ/NotⅠ双酶切质粒pIRES2-EGFP-syno,得到含EGFP和人Synoviolin的基因片段,将其亚克隆至入门载体pENTR1A的多克隆位点内得到入门质粒pENTR1A-syno-egfp。采用LR重组酶将pENTR1A-syno-egfp和目的载体pLenti4/TO/V5-DEST进行重组反应,形成慢病毒表达载体pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp。将pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp与包装质粒混合,利用脂质体共转染293FT细胞,包装产生慢病毒,以293FT细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果PCR,酶切及测序结果表明慢病毒表达载体pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp构建成功,转染后的293FT细胞在荧光显微镜下观察可见强绿色荧光。包装的慢病毒原液滴度为1×10~8TU/ml。结论成功构建了EGFP和Synoviolin基因共表达的慢病毒表达载体,为Synoviolin基因的功能研究提供了高效稳定的转基因技术平台。