稳定表达HBx的肝前体细胞株的构建及其对增殖的影响

目的 构建稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的肝前体细胞株,检测对肝前体细胞增殖,细胞周期及Wnt/β-catemn信号通路的影响.方法 重组质粒pSEB-Flag-HBx与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带HBx基因的重组逆转录病毒,并感染小鼠肝前体细胞HP14.5,稻瘟菌素(blasticidin)筛选出稳定表达HBx基因的细胞克隆并扩大培养(HP14.5/HBx组),设HP14.5/Rv(空质粒pSEEB-Flag感染组)及空细胞组HP14.5组为对照组.MTS比色法检测各组细胞的增殖活力,流式细胞术检测细胞周期中各时相所占的比例,荧光定量PCR检测cyclin D1和c-myc mRNA的表达量,Western blot法检测HBx、GSK3β、p-GSK3β(ser-9)、β-catenin、cyclin D1以及c-myc等蛋白的表达.结果 RT-PCR和Western blot法检测到HBx基因和蛋白阳性表达,与对照组相比,HP14.5/HBx细胞增殖活力显著增加(P＜0.05);G1细胞比例明显减少(P＜0.05),S期和G2细胞比例显著升高(P＜0.05);cyclin D1和c-myc mRNA的表达量显著升高(P ＜0.05); GSK3β蛋白水平表达无明显变化(P＞0.05),p-GSK3β、β-catenin、cyclin D1和c-myc蛋白的表达水平显著升高(P＜0.05).结论 成功筛选出稳定表达HBx的肝前体细胞株,HBx通过活化Wnt/β-catenin信号途径促进肝前体细胞的增殖.     

高表达ITGB1促进人乳腺上皮MCF10A细胞EMT及迁移

目的探讨ITGB1基因过表达对人乳腺上皮MCF10A细胞迁移和侵袭的影响。方法构建重组质粒p BABEpuro-myc-ITGB1,在人胚肾上皮细胞系293T细胞中包装反转录病毒,转染人乳腺上皮MCF10A细胞系,构建ITGB1基因过表达的稳定细胞系;实验设空白对照组(MCF10A)、阴性对照组(MCF10A-vector)和ITGB1基因过表达组(MCF10A-ITGB1);经嘌呤霉素筛选后,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测ITGB1 mRNA及蛋白的表达;Transwell迁移和侵袭实验分别检测细胞株迁移和侵袭能力;蛋白质印迹法进一步检测上皮间质转换(EMT)相关蛋白E-cadherin、vimentin、fibronectin、N-cadherin以及ITGB1下游ILK、p-FAK和FAK蛋白的表达。结果成功构建ITGB1基因稳定过表达人乳腺上皮MCF10A细胞系;ITGB1基因过表达组(MCF10A-ITGB1)与空白对照组(MCF10A)和阴性对照组(MCF10A-vector)细胞相比,迁移能力(P0.05)和侵袭能力(P0.01)显著增强;EMT相关蛋白E-cadherin显著下调(P0.05),vimentin、fibronectin、N-cadherin以及ITGB1下游ILK,p-FAK蛋白显著上调(P0.05)。结论在人乳腺上皮MCF10A细胞中,过表达ITGB1基因诱导细胞EMT并促进其迁移和侵袭。     

BMP4沉默对骨肉瘤细胞系MG-63上皮间质转换及侵袭转移能力的影响

目的探讨沉默骨形成蛋白-4(BMP4)对骨肉瘤细胞系MG-63上皮间质转换(EMT)和侵袭迁移能力的影响。方法脂质体法转染MG-63细胞BMP4 shRNA表达质粒,将MG-63细胞分为MG-63对照组(正常培养对照)、空白对照组(转染空白质粒)和BMP4沉默组(转染BMP4 shRNA质粒)。反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和Western blot检测细胞E-cadherin、vimentin、twist和snail的mRNA及蛋白水平。Transwell侵袭实验和伤口愈合实验检测细胞侵袭和迁移能力。结果沉默BMP4后MG-63细胞的间质细胞标志物vimentin、twist1和snail水平降低,上皮细胞标志物E-cadherin表达增高(P0.05)。BMP4沉默组细胞穿膜细胞数和迁移距离显著少于MG-63对照组和空白对照组(P0.05)。结论沉默BMP4基因可以使间质型MG-63骨肉瘤细胞向上皮细胞表型转变,从而有效地降低肿瘤细胞的侵袭迁移能力。     

PTBP1通过EMT途径促进肝癌细胞的迁移与侵袭

目的:基于上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)途径研究多聚嘧啶区结合蛋白1(polypyrimidine tract-binding protein 1, PTBP1)促进肝癌细胞迁移与侵袭的分子机制。方法:通过qPCR与Western blot实验筛选不同细胞中差异表达的剪接蛋白,生物信息学分析肝癌与正常肝组织中PTBP1的表达差异。划痕及侵袭实验研究过表达或敲减PTBP1对肝癌细胞迁移与侵袭能力的影响,Western blot检测过表达或敲减PTBP1对EMT通路蛋白的影响。结果:高转移肝癌细胞系HCCLM3中PTBP1的表达显著升高(P0.05),且肝癌组织中PTBP1的表达水平明显高于正常组织(P0.05)。过表达PTBP1可显著提高HCCLM3细胞的迁移与侵袭能力(P0.05),并增加间充质标志物N-cadherin和vimentin等的表达(P0.05),促进肝癌细胞的EMT进程。结论:PTBP1可通过促进肝癌细胞的EMT途径而促进肝癌细胞的迁移与侵袭。     

Twist基因逆转录病毒载体的构建及其诱导正常乳腺上皮细胞发生上皮间质转化

目的 构建Twist基因逆转录病毒载体,研究其对人正常乳腺上皮细胞MCF10A的影响.方法 酶切pcDNA3/myc-Twist获得myc-Twist,克隆到逆转录病毒载体pBABE-puro中,构建重组质粒pB AB E-myc-Twist.通过酶切、测序鉴定Twist基因正确后,在体外将质粒pBABE-myc-Twist和其对照分别与包装质粒pAmpho共同转染人胚肾上皮细胞系293T细胞,进行逆转录病毒的包装,并感染人正常乳腺MCF10A上皮细胞,用嘌呤霉素(puromycin)筛选,获得成功转入Twist的MCF10A-Twist细胞和MCF10A-Vector对照细胞.通过RT-PCR和Western blot法验证Twist细胞在MCF10A-Twist和MCF10A-Vector细胞内的表达.免疫荧光技术和Western blot法检测细胞内上皮间质转化(EMT)标志蛋白的表达.Transwell(R)法检测细胞的迁移和侵袭能力.结果 重组逆转录病毒载体质粒pBABE-myc-Twist经酶切和测序鉴定构建正确;Twist基因被逆转录病毒成功导入MCF10A细胞,并在靶细胞内稳定表达,RT-PCR检测到Twist mRNA在MCF10A-Twist细胞中表达,Western blot法检测发现myc-Twist蛋白在MCF10A-Twist细胞中表达;免疫荧光和Western blot法检测显示在MCF10A-Twist细胞中E-cadherin表达显著下调、vimentin表达明显上调;与MCF10A-Vector细胞相比,Transwell(R)法检测发现MCF10A-Twist细胞迁移和侵袭能力明显增加(P＜0.01).结论 Twist诱导MCF10A细胞发生EMT转化,并促进其迁移和侵袭.     

高表达β-连环蛋白促进人胚肺成纤维细胞趋化及上皮型钙黏连素的表达

目的:初步探讨β-连环蛋白高表达对成纤维细胞趋化及上皮型钙黏连素表达的影响。方法:利用cDNA文库构建人截短β-连环蛋白表达质粒,重组质粒瞬时转染人胚肺成纤维细胞,检测成纤维细胞趋化性变化,观察上皮型钙黏连素表达情况。结果:成纤维细胞转染重组质粒后β-连环蛋白转录和翻译水平升高(25806.3±2170.1vs8216.7±833.1,P0.05;70496.0±1960.0vs25867.3±136.5,P0.05)。β-连环蛋白高表达促进成纤维细胞趋化(340±38vs80±14,P0.05)。转染重组质粒后成纤维细胞表达上皮型钙黏连素减少(25806.3±2170.1vs8216.7±833.1,P0.05;89786.3±276.7vs31876.0±1411.3,P0.05)。成纤维细胞趋化与上皮型钙黏连素水平存在明显负相关(r=-0.988,P0.05)。结论:β-连环蛋白高表达可促进成纤维细胞趋化,造成上皮型钙黏连素表达减少。     

miR-451通过Akt负向调控糖尿病肾病患者组织上皮间质转分化

目的研究微小RNA-451(miR-451)对糖尿病肾病组织上皮间质转分化(EMT)的影响。方法取健康人肾脏组织和糖尿病患者肾脏组织,RT-qPCR检测肾组织mi-451、Akt和EMT相关基因(E-钙黏素、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白)的表达;Western blot和免疫组织化学染色(IHC)检测Akt和EMT相关蛋白的表达。结果糖尿病肾病肾脏组织中miR-451和E-钙黏素mRNA表达量显著低于正常肾组织(P<0.05);Akt、vimentin和α-SMA mRNA表达量显著增多(P<0.05);Akt、vimentin和α-SMA蛋白表达量显著增高(P<0.05);E-钙黏素蛋白表达量显著降低(P<0.05)。结论糖尿病肾病时miR-451很可能通过Akt负向影响肾脏上皮间质转分化。     

ATAD2对人胶质瘤细胞系转移及上皮间质转换的影响

目的探讨三磷酸腺苷酶家族蛋白2(ATAD2)对人胶质瘤细胞的影响。方法用real-time PCR及Western blot检测ATAD2在人胶质瘤细胞系U87MG、U251和正常人星形胶质细胞的表达。U87MG和U251分为对照组(control)、脂质体对照组(mock)、ATAD2 siRNA(转染特异性siRNA)和ATAD2 overexpression(过表达ATAD2)4组,MTT法、Transwell实验观察细胞增殖和侵袭迁移。Western blot检测上皮间质转换标志蛋白上皮钙黏素、神经钙黏素和波形蛋白的表达。结果 U87MG和U251细胞ATAD2高表达。与对照相比,ATAD2 siRNA抑制U87MG和U251细胞增殖、侵袭、迁移、神经钙黏素及波形蛋白表达,促进上皮钙黏素表达(P0.05);ATAD2 overexpression促进细胞增殖、侵袭、迁移、神经钙黏素和波形蛋白表达,降低上皮钙黏素表达(P0.05)。结论 ATAD2可能通过调节上皮间充质转换进程参与人胶质瘤细胞转移。     

同期放化疗诱导人结直肠癌细胞发生上皮-间质转化

目的:探讨放化疗抵抗的结直肠癌细胞发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的意义.方法:采用5-FU化疗同期进行放疗对人结直肠癌野生型细胞(HCTll6)进行干预,诱导放化疗共同抵抗的细胞株(HCT1 16CRR)并采用克隆形成实验进行放化疗抵抗性的鉴定.高倍显微镜下观察细胞形态学变化.采用Real-time PCR和Western印迹,检测上皮表型标志物E-cadherin,间质表型标志物N-cadherin、波形蛋白(vimentin)、核转录因子(Snail)mRNA及其蛋白的表达.结果:放化疗抵抗的结直肠癌细胞发生与EMT相符的形态学改变,细胞呈纺锤体状,极性消失,并出现伪足;Real-time PCR和Western印迹结果显示E-cadherin mRNA及蛋白表达下调;N-cadherin,vimentin,Snail mRNA及蛋白表达上调,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:放化疗抵抗后的人结直肠癌细胞发生EMT,其与结直肠癌的治疗抵抗相关.     

重组人源TNC诱导胰腺癌细胞系PANC1的EMT及迁移和侵袭

目的构建人肌腱蛋白C(TNC)真核表达质粒,利用稳定过表达TNC的胰腺癌细胞系以及探索TNC在胰腺癌转移中的作用及分子机制。方法采用独特的引物设计方法构建TNC表达质粒,经转染和G418筛选获得稳定过表达TNC的胰腺癌PANC1细胞系。通过RT-qPCR和Western blot对细胞系中TNC的表达进行鉴定。采用Transwell小室法和Western blot检测TNC对细胞迁移、侵袭能力以及上皮间质转化(EMT)相关分子表达的影响。结果成功构建TNC质粒,稳定过表达TNC的PANC1细胞迁移、侵袭能力显著增强(P<0.05),上皮标志物E-cadherin表达减少而间质标志物N-cadherin表达增加(P<0.05)。结论TNC真核表达质粒以及TNC稳定表达胰腺癌细胞系的建立,可用于TNC对细胞EMT、迁移和侵袭等方面的机制研究,也是研究TNC生物学功能和胰腺癌发生发展机制的基础。