体外分离与培养SD乳鼠神经干细胞实验过程中部分方法的改进

目的:探讨体外培养与分离SD乳鼠神经干细胞的方法,以便获得大量的神经干细胞.方法:实验于2003-06/10在四川大学华西医学中心细胞生物学教研室完成.分别取出生3 d的SD乳鼠侧脑室和大脑皮质,用改进后的胰蛋白酶消化法分离单个细胞,进行细胞培养,加20μg/L表皮生长因子,20μg/L碱性成纤维细胞生长因子刺激生长,用半定量法换培养液,用免疫细胞化学方法对神经干细胞进行鉴定,流式细胞仪分别对每天培养的神经干细胞凋亡率进行检测.结果:①所获得的克隆细胞具有抗巢蛋白免疫荧光反应阳性、具有增殖、血清诱导分化的特性,证明这些细胞为神经干细胞.②培养的侧脑室神经干细胞比大脑皮质的神经干细胞增殖快.③改进的胰蛋白酶消化法得到了1×108 L-1单细胞,避免了过度消化或过度机械吹打造成的细胞碎片.④含20μg/L表皮生长因子和20μg/L碱性成纤维细胞生长因子培养基适合神经干细胞短期培养.⑤流式细胞仪定量检测细胞凋亡率呈下降趋势.结论:SD乳鼠体外培养神经干细胞取材最佳位置应该是脑室管膜或室管膜下.神经干细胞的存活和分裂有赖于表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子按一定比例的共同作用.采用改进的胰酶消化法提高有效细胞产生率,应用半定量换液法可有效减少细胞凋亡率.     

含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养建立大鼠胚胎神经干细胞克隆的实验

背景：体外培养获得神经干细胞的有效方法是干细胞实验研究中很值得关注的问题。 目的：观察应用含有不同生长因子的培养基体外培养神经干细胞的有效方法。 设计：单一样本观察。 单位：四川大学生命科学院细胞生物学实验室。 材料：孕14dSD大鼠10只。DMEM／F12 1：1，碱性成纤维细胞生长因子，表皮生长因子；巢蛋白抗体IgG，β-微管蛋白Ⅲ抗体IgG，胶质纤维酸性蛋白抗体IgG，生物素标记二抗和三抗、异硫氰酸荧光素标记二抗。 方法：实验于1999／2001在四川大学生命科学院细胞生物学实验室完成。①从胎鼠前脑取出脑组织，采用酶消化．机械吹打、离心、培养原代神经干细胞克隆。②神经干细胞以2&;#215;10^8 L^-1密度接种培养，分4组，每组6瓶细胞，DMEM／F12组：加入DMEM／F12（1：1）培养基含体积分数为0．1的小牛血清；碱性成纤维细胞生长因子组：培养基为含20μg／L碱性成纤维细胞生长因子；表皮生长因子组：培养基含30μg／L表皮生长因子；碱性成纤维细胞生长因子＋表皮生长因子组：先用含碱性成纤维细胞生长因子的培养基培养2h后再换成含表皮生长因子的培养基培养。培养24h后更换培养瓶，培养14d后显微镜下计数原代克隆数，免疫组化法检测干细胞特殊标记蛋白巢蛋白的表达。 主要观察指标：①神经干细胞的原代克隆。②单细胞克隆培养结果。③诱导分化结果。 结果：①从胎鼠脑中分离的细胞具有连续传代形成克隆的能力，免疫荧光化学显示细胞球内细胞巢蛋白表达阳性。②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法形成神经干细胞克隆率最高（0．630％）。③培养的神经干细胞克隆能诱导分化成神经元和神经胶质细胞。 结论：①结果证实培养分离的细胞是神经干细胞。②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法是获得神经干细胞的有效方法。     

含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养建立大鼠胚胎神经干细胞克隆的实验

背景体外培养获得神经干细胞的有效方法是干细胞实验研究中很值得关注的问题.目的观察应用含有不同生长因子的培养基体外培养神经干细胞的有效方法.设计单一样本观察.单位四川大学生命科学院细胞生物学实验室.材料孕14 d SD大鼠10只,DMEM/F12 11,碱性成纤维细胞生长因子,表皮生长因子;巢蛋白抗体IgG,β-微管蛋白Ⅲ抗体Ig G,胶质纤维酸性蛋白抗体Ig G,生物素标记二抗和三抗、异硫氰酸荧光素标记二抗.方法实验于1999/2001在四川大学生命科学院细胞生物学实验室完成.①从胎鼠前脑取出脑组织,采用酶消化、机械吹打、离心、培养原代神经干细胞克隆.②神经干细胞以2×108L-1密度接种培养,分4组,每组6瓶细胞,DMEM/F12组加入DMEM/F12(11)培养基含体积分数为0.1的小牛血清;碱性成纤维细胞生长因子组培养基为含20μg/L碱性成纤维细胞生长因子;表皮生长因子组培养基含30μg/L表皮生长因子;碱性成纤维细胞生长因子+表皮生长因子组先用含碱性成纤维细胞生长因子的培养基培养2 h后再换成含表皮生长因子的培养基培养.培养24 h后更换培养瓶,培养14 d后显微镜下计数原代克隆数,免疫组化法检测干细胞特殊标记蛋白巢蛋白的表达.主要观察指标①神经干细胞的原代克隆.②单细胞克隆培养结果.③诱导分化结果.结果①从胎鼠脑中分离的细胞具有连续传代形成克隆的能力,免疫荧光化学显示细胞球内细胞巢蛋白表达阳性.②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法形成神经干细胞克隆率最高(0.630%).③培养的神经干细胞克隆能诱导分化成神经元和神经胶质细胞.结论①结果证实培养分离的细胞是神经干细胞.②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法是获得神经干细胞的有效方法.     

不同体外诱导培养条件下新生鼠基底前脑神经干细胞增殖和分化为神经元的能力

目的：研究神经干细胞的增殖、迁移和分化可为揭示神经系统的发生、发育过程提供可靠依据。观察表皮生长因子和碱性成纤维生长因子在体外刺激新生鼠基底前脑神经干细胞的增殖情况，及其各自诱导神经干细胞分化成神经元的能力。 方法：实验于2005-12／2006—07在广州医学院解剖学教研室完成。①动物：清洁级新生24h内的SD大鼠30只，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：新生鼠在无菌条件下取脑，分离出基底前脑，胰蛋白酶消化，离心过滤制备单细胞悬液，接种于含B27的DMEM／F12培养基培养瓶中，每瓶40-60万个细胞，加入终浓度均为10μg／L的表皮生长因子和碱性成纤维生长因子刺激生长，在体外进行神经干细胞的克隆培养，传代培养过程中加入终浓度为6mg／LBrdU用于标记神经球，设立3组，各自加入体积分数为0．1的小牛血清、终浓度均为10μg／L的表皮生长因子、碱性成纤维生长因子，对培养得到的神经干细胞进行诱导分化。③实验评估：免疫荧光染色检测神经干细胞巢蛋白抗原的表达，并用BrdU标记和免疫荧光证实其增殖能力。免疫荧光染色检测不同诱导条件下神经干细胞向神经元分化的能力。 结果：①细胞形态观察：从新生鼠基底前脑成功分离出神经干细胞，原代培养呈透亮的圆球形，2—3d后细胞数目明显减少，部分细胞开始分裂。1周左右培养瓶中出现许多由数十到数百个细胞组成的悬浮生长的细胞球，球中的细胞形态规则，边界清楚，折光性较强，胞浆颜色较深，核，浆比较大。该细胞具有连续增殖能力，可以传代培养。②巢蛋白抗原的表达：传代神经球中的细胞均呈巢蛋白抗原阳性。③BrdU标记检测：克隆球中的细胞均为BrdU阳性，表明克隆球是由不断分裂增殖的细胞组成。④诱导分化结果：?     

脑源性神经生长因子促进成年大鼠脑海马神经干细胞定向分化的浓度选择

目的：探讨培养基中表皮生长因子与血清两者浓度一定的条件下，不同浓度的脑源性神经生长因子对成年大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的影响。 方法：实验于2007—08在中国医科大学神经解剖研究室完成。①材料：清洁级雄性成年SD大鼠1只，由中国医科大学实验动物部提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。实验过程中应用的表皮生长因子、脑源性神经生长因子均由R＆D公司提供：（多实验方法：无菌条件下分离大鼠脑海马组织，剪碎后胰蛋白酶消化，过滤、离心、弃上清，加入含2％B27、20μg／L表皮生长因子、20μg／L碱性成纤维生长因子的DMEM／F12无血清条件培养基体外培养神经干细胞，传至第4代时利用有限稀释法进行单克隆培养，100倍镜下克隆球直径约为200μm时制备单细胞悬液，稀释后滴加于96孔板内，设立两组，全量新鲜培养基组加入刚配置未使用过的DMEM／F12无血清培养基100μL，半量条件培养基组加入上述曾用于神经干细胞培养且含有其代谢产物的1／2DMEM／F12无血清培养基100斗L。（劲实验评估：观察神经干细胞的单克隆培养增殖情况。对克隆球行巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质原纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色。按培养基中脑源性神经生长因子终浓度的不同将所培养细胞设立0，50，100，150，200μg／L组，各组均加入20μg／L表皮生长因子和体积分数为0．1的胎牛血清，1周后行神经元特异性烯醇化酶免疫细胞化学染色，检测神经干细胞向神经元分化情况。 结果：①神经干细胞单克隆培养结果：单克隆培养开始时神经干细胞增殖缓慢，半量条件培养基组细胞增殖速度快于全量新鲜培养基组，随着细胞数的增多，两组细胞增殖速度也相应加快，分别在培养后第12天、第15天形成直径为200μm的克隆球。②神经干细胞免疫细胞化学染色结果：单克隆培养后克隆球表达巢蛋白，诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质原纤维酸性蛋白均呈阳性表达：③各组神经干细胞分化为神经元的比例：与0μg／L脑源性神经生长因子组比较，50，100μg／L脑源性神经生长因子组的神经干细胞分化为神经元比例均明显增高（t=2．502～5．025，P〈0．05）；而浓度为150，200μg／L时均无明显变化（t=0．420～1．857，P〉0．05）。 结论：向含有B27、表皮生长因子、碱·性成纤维生长因子的DMEM／F12条件培养基中加入20μg／L表皮生长因子和体积分数为0．1胎牛血清的情况下，脑源性神经生长因子促使神经干细胞向神经元分化的较佳浓度为50μg／L。     

昆明种小鼠胚胎神经干细胞的分离及培养

目的：在神经干细胞的分离培养过程中，国内外的报道多数是用胰蛋白酶对组织细胞进行消化，但是消化时间比较难把握。采用胰酶消化与机械分离法相结合的方式对昆明种小鼠胚胎脑神经干细胞进行分离、培养和初步的免疫组织化学检测，为相关研究建立实验条件。 方法：实验于2006—10／2007-09在广西医科大学基础医学实验室完成。实验室为广西重点实验室、基础医学博士后工作站。①实验材料：孕14-16d的昆明种小鼠由广西医科大学实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：分离昆明种小鼠胎鼠的脑组织，经胰酶消化加机械吹打后，在加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子的B27无血清培养基中培养。③实验评估：用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞。 结果：在无血清DMEM／F12培养液中，加入碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子及B27的条件下，培养24h后可见细胞以悬浮方式生长，三五聚集成团块，48h后形成由十数个至数十个细胞组成的，大小不等的细胞球，形态规则，细胞无突起，形成典型的神经球，可传代。免疫细胞化学法检测显示，细胞表达神经巢蛋白。 结论：①来自昆明种小鼠胎脑的神经干细胞能在体外培养、增殖并具有增殖传代能力。②无血清B27培养基添加表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子有利于神经干细胞的体外培养和促进其增殖。     

不同体外诱导培养条件下新生鼠基底前脑神经干细胞增殖和分化为神经元的能力

目的:研究神经干细胞的增殖、迁移和分化可为揭示神经系统的发生、发育过程提供可靠依据.观察表皮生长因子和碱性成纤维生长因子在体外刺激新生鼠基底前脑神经干细胞的增殖情况,及其各自诱导神经干细胞分化成神经元的能力.方法:实验于2005-12/2006-07在广州医学院解剖学教研室完成.①动物:清洁级新生24 h内的SD大鼠30只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:新生鼠在无菌条件下取脑,分离出基底前脑,胰蛋白酶消化,离心过滤制备单细胞悬液,接种于含B27的DMEM/F12培养基培养瓶中,每瓶40～60万个细胞,加入终浓度均为10μg/L的表皮生长因子和碱性成纤维生长因子刺激生长,在体外进行神经干细胞的克隆培养,传代培养过程中加入终浓度为6 mg/L BrdU用于标记神经球,设立3组,各自加入体积分数为0.1的小牛血清、终浓度均为10μg/L的表皮生长因子、碱性成纤维生长因子,对培养得到的神经干细胞进行诱导分化.③实验评估:免疫荧光染色检测神经干细胞巢蛋白抗原的表达,并用BrdU标记和免疫荧光证实其增殖能力.免疫荧光染色检测不同诱导条件下神经干细胞向神经元分化的能力. 结果:①细胞形态观察:从新生鼠基底前脑成功分离出神经干细胞,原代培养呈透亮的圆球形,2～3 d后细胞数目明显减少,部分细胞开始分裂.1周左右培养瓶中出现许多由数十到数百个细胞组成的悬浮生长的细胞球,球中的细胞形态规则,边界清楚,折光性较强,胞浆颜色较深,核/浆比较大.该细胞具有连续增殖能力,可以传代培养.②巢蛋白抗原的表达:传代神经球中的细胞均呈巢蛋白抗原阳性.③BrdU标记检测:克隆球中的细胞均为BrdU阳性,表明克隆球是由不断分裂增殖的细胞组成.④诱导分化结果:在体积分数为0.1小牛血清、终浓度均为10μg/L的表皮生长因子、碱性成纤维生长因子诱导条件下,神经干细胞分化为神经元的比例分别为20%,22%,40%.结论:①表皮生长因子和碱性成纤维生长因子在体外能够刺激新生鼠基底前脑神经干细胞连续增殖,且具有胚胎源性.②以血清作为对照,碱性成纤维生长因子诱导神经干细胞向神经元分化的能力强于表皮生长因子.     

表皮生长因子对脑源性神经生长因子诱导体外培养大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的影响

目的:获得大量神经干细胞并且能够控制其向神经元定向分化可为进一步修复损伤大脑和治疗退行性神经系统疾病奠定种子细胞基础,实验观察了表皮生长因子对脑源性神经生长因子诱导神经干细胞向神经元分化过程中的影响.方法:实验于2007-08在中国医科大学神经解剖研究室完成.①材料:清洁级雄性成年SD大鼠3只,由中国医科大学实验动物部提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:无菌条件下分离大鼠脑海马组织,胰蛋白酶消化后采用无血清培养技术体外培养神经干细胞,传至第4代克隆球直径约为200 μ m时,滴加DMEM/F12 2?7 20μg/L表皮生长因子 20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子 条件培养液(细胞原代培养第7天的上清液的过滤液),进行单细胞克隆培养,传代的神经干细胞分成空白对照组、表皮生长因子组、脑源性神经生长因子组、表皮生长因子 脑源性神经生长因子组.空白对照组培养液为含体积分数0.1胎牛血清的DMEM/F12,其余3组培养液在此基础上分别加入各自对应的细胞因子培养1周,表皮生长因子浓度为20 μg/L,肺源性神经生长因子浓度为50 μg/L.③实验评估:传代后的克隆球进行神经干细胞免疫细胞化学染色鉴定.计数神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率,检测神经干细胞向神经元的分化情况.结果:①单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达.②与空白对照组神经干细胞分化为神经元的比例比较,表皮生长因子组有所降低:脑源性神经生长因子组、表皮生长因子 脑源性神经生长因子组均明显提高(t=2.309～2.779,P＜0.05),且后者提高幅度尤为显著(t=2.309,P＜0.05).结论:表皮生长因子可以提高脑源性神经生长因子诱导成年大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的比例.     

联合应用碱性成纤维细胞生长因子和脑源性神经营养因子对成年大鼠脑海马神经干细胞分化为神经元的影响

背景:调控神经干细胞分化的微环境因素很多,数种因素可以不同程度地刺激神经干细胞向神经元分化,如何使神经干细胞更有效地分化为神经元尤为关键.目的:观察碱性成纤维细胞生长因子与脑源性神经营养因子联合应用对成年大鼠脑海马神经干细胞分化为神经元的影响.设计、时间及地点;细胞学体外观察,于2008-05在中国医科大学神经解剖研究室完成.材料:清洁级雄性SD大鼠3只,由中国医科大学实验动物部提供.方法:无菌条件下分离大鼠脑海马组织,胰蛋白酶消化后采用无血清培养技术体外培养神经干细胞,传至第4代克隆球直径约为200 pm时,滴加含B27、表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12进行单细胞克隆培养.传代的神经干细胞分成4组:空白对照组加入含体积分数为10%胎生血清的DMEM/F12培养液,碱性成纤维细胞生长因子组、脑源性神经营养因子组、联合组分别在空白对照组培养液的基础上加入10 pg/L碱性成纤维细胞生长因子、200 μg/L脑源性神经营养因子、10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子+200 μg/L脑源性神经营养因子,培养1周.主要观察指标:免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞,检测神经干细胞分化为神经元的比例.结果:单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达.与空白对照组比较.碱性成纤维细胞生长因子组、脑源性神经营养因子组、联合组神经干细胞分化为神经元的比例均明显提高(t=3.409～7.558,P<0.05),且联合组升高幅度尤为显著.结论:适宜浓度的碱性成纤维细胞生长因子和脑源性神经营养因子联合应用,比其单独应用具有更强的促神经干细胞向神经元分化的作用.     

人胚胎脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化特征

目的：观察人胚脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化情况。 方法：实验于2004-10／2005-04在西安交通大学医学院神经生物教研室完成。①从7～10周胚龄流产人胚胎脊髓分离脊髓神经干细胞（家属知情同意），采用无血清培养技术进行原代和传代培养。培养液组成：DMEM／F12（1：1），表皮生长因子20μg／L，碱性成纤维细胞生长因子20μg／L，重组人白血病抑制因子10μg／L，N2添加剂（终浓度为10mL/L）。②并采用免疫荧光法检测细胞的分化情况。 结果：①人胚脊髓神经干细胞形态学观察：原代细胞培养得到大量悬浮生长的神经干细胞球，形态较规则，呈圆形，细胞边界清楚，折光性强。部分细胞贴壁生长继而分化。传代培养后，细胞团生长速度明显加快；传3代以后脊髓神经干细胞易贴壁。②人胚脊髓神经干细胞的鉴定和分化结果：神经干细胞球，巢蛋白染色阳性；可诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。 结论：人胚胎脊髓分离培养得到的细胞具有脊髓神经干细胞的基本特征，可进一步用于基础及临床研究。     

外源性碱性成纤维细胞生长因子对放射诱导神经干细胞凋亡的抑制效应

背景:已证实放射性神经干细胞损伤是放射性脑损伤的可能途径之一,而碱性成纤维细胞生长因子对放射性损伤具有保护作用,但其机制尚不清楚.目的:观察外源性碱性成纤维细胞生长因子对放射诱导C17.2神经干细胞凋亡的抑制作用.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2006-11/2008-06在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成.材料:C17.2神经干细胞系为小鼠小脑祖细胞永生化后构建的神经干细胞系.方法:以直线加速器进行总量为8 Gy外照射C17.2神经干细胞建立离体放射性损伤模型,以1×107L-1的细胞浓度接种C17.2神经干细胞悬液至96孔板,每孔加细胞悬液200 μL,按0,25,50,100 μg/L(0 μg/L作对照)分别加入碱性成纤维细胞生长因子干预.主要观察指标:四甲基偶氮唑盐法检测细胞活性并拟合生存曲线,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:随碱性成纤维细胞生长因子浓度升高,C17.2神经干细胞增殖比明显增加(P＜0.01),呈现明显剂量-效应关系.碱性成纤维细胞生长因子浓度为100 μg/L时活性最强,未显示细胞毒性.流式细胞仪检测结果显示:对照组细胞凋亡率高于25,50 μg/L碱性成纤维细胞生长因子组(P<0.01),25,50,100μg/L碱性成纤维细胞生长因子组组间相比,差异具有显著性意义(P<0.05～0.01).结论:外源性碱性成纤维细胞生长因子对放射诱导的C17.2神经干细胞凋亡具有明显抑制作用.     

新生大鼠神经干细胞培养过程中加入相关因子对其生长特性的影响

目的：观察神经干细胞体外分离、培养过程中加入人重组表皮生长因子、人重组碱性成纤维细胞生长因子后生长情况及二次传代后加入多聚赖氨酸对其生长的影响。方法：实验于2004—09／2005—02在泸州医学院神经生物学研究室进行。①分离新生Wistar大鼠大脑组织，采用原代机械吹打使其成为细胞悬液后，离心，吸去上清液，加入干细胞培养液（10g／L牛血清白蛋白、人重组表皮生长因子20μg／L、人重组碱性成纤维细胞生长因子20μg／L、N2补充液）重悬细胞，因其是否接种在含或者不含多聚赖氨酸包被玻片的培养瓶内分为包被组和不包被组。②将上述培养的细胞悬液离心、消化后再加入干细胞培养液重悬细胞，以1&;#215;10^5个／mL密度接种在25mL培养瓶内。以后两三天换液一次，五六天传代一次。③取包被组二次传代后的神经球滴在包被有多聚赖氨酸的盖玻片上观察神经干细胞生长情况。结果：①细胞培养过程中加入人重组表皮生长因子和人重组碱性成纤维细胞生长因子后，细胞团数量逐渐增多，原来的小细胞团体积变大，分裂的细胞折光性更强，更透亮。随着培养时间延长，瓶内飘浮的细胞团数目更为增加，几乎都成规则细胞球。将培养细胞五六天传代一次。②在预先置入有多聚赖氨酸包被的玻片组，培养第2天，全部的单个细胞和细胞团贴壁、分化，以后分化细胞逐渐增多，突起交织成网，几乎贴满瓶底。但在培养的第4天，瓶底逐渐出现成团细胞簇，起初数量少，后数量增多，贴壁生长。培养第7天后，细胞簇陆续挣脱瓶底，漂浮在培养液中，成为游离细胞球。细胞球体积明显小于不加多聚赖氨酸处理的玻片组，即使增加培养时间，也未见细胞团继续长大。将二次传代后的神经球，继续加多聚赖氨酸处理的玻片，细胞生长状况同原代。结论：①在神经干细胞的分离及培养、传代过程中加入促有丝分裂因子人重组表皮生长因子和人重组碱性成纤维细胞生长因子能促进神经干细胞的分裂和增殖。（乡相同培养条件下，加入多聚赖氨酸包被的玻片，神经干细胞生长的速度和大小均小于不加入多聚赖氨酸包被的玻片。     

碱性成纤维生长因子和神经生长因子联合应用培养成年大鼠海马神经干细胞向神经元样细胞的分化

背景：影响神经干细胞向神经元分化的因素很多,各种营养因子可以不同程度地刺激神经干细胞向神经元分化,如何使神经干细胞大量分化为神经元是研究的热点问题。目的：观察联合应用碱性成纤维生长因子和神经生长因子对成年大鼠海马神经干细胞为神经元的影响。方法：无菌条件下分离大鼠脑海马组织,传至第4代克隆球直径约为200μm时,滴加DMEM/F12＋2%B27＋20μg/L表皮生长因子＋20μg/L碱性成纤维细胞生长因子,进行单细胞克隆培养,传代的神经干细胞分成空白对照组、碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子＋神经生长因子组。观察传代后的克隆球进行神经干细胞免疫细胞化学染色鉴定,计数神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率,检测神经干细胞向神经元的分化情况。结果与结论：①单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。②与空白对照组神经干细胞分化为神经元的比例比较,碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子组＋神经生长因子组均明显提高（P〈0.05）,且碱性成纤维细胞生长因子组＋神经生长因子组神经元的比例最高（P〈0.05）。提示,碱性成纤维细胞生长因子可以提高神经生长因子诱和神经生长因子均可促进神经干细胞向神经元分化,且二者联合应用效果更佳。     

碱性成纤维生长因子和神经生长因子联合应用培养成年大鼠海马神经干细胞向神经元样细胞的分化

背景:影响神经干细胞向神经元分化的因素很多,各种营养因子可以不同程度地刺激神经干细胞向神经元分化,如何使神经干细胞大量分化为神经元是研究的热点问题。目的:观察联合应用碱性成纤维生长因子和神经生长因子对成年大鼠海马神经干细胞为神经元的影响。方法:无菌条件下分离大鼠脑海马组织,传至第4代克隆球直径约为200μm时,滴加DMEM/F12+2%B27+20μg/L表皮生长因子+20μg/L碱性成纤维细胞生长因子,进行单细胞克隆培养,传代的神经干细胞分成空白对照组、碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子+神经生长因子组。观察传代后的克隆球进行神经干细胞免疫细胞化学染色鉴定,计数神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率,检测神经干细胞向神经元的分化情况。结果与结论:①单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。②与空白对照组神经干细胞分化为神经元的比例比较,碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子组+神经生长因子组均明显提高(P<0.05),且碱性成纤维细胞生长因子组+神经生长因子组神经元的比例最高(P<0.05)。提示,碱性成纤维细胞生长因子可以提高神经生长因子诱和神经生长因子均可促进神经干细胞向神经元分化,且二者联合应用效果更佳。     

表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对人胎脑室下区神经干细胞增殖分化的影响

背景：由于神经干细胞分化的多向性和不确定性给临床应用造成巨大困难，因此，探讨神经干细胞增殖分化条件已成为解决这一问题的关键。目的：观察表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对人胎脑神经干细胞增殖分化的影响。设计：以培养的人胚神经干细胞为观察对象，随机对照实验。单位：解放军第一军医大学珠江医院儿科。材料：实验于2004—01／05在全军儿科中心实验室进行。随机在广州市某三级甲等医院产科选取自愿水囊引产的16周胎儿2例（胎儿父母签署同意书），取其脑室下区组织分别在无血清培养基和血清培养基进行细胞培养。方法：采用含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子以及表皮生长因子＋碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基对人胎脑室下区组织进行原代细胞培养；两种生长因子的浓度均为20μg／L，采用血清培养基对原代培养的细胞克隆球进行分化实验；并采用免疫组化技术对分化细胞进行检测。主要观察指标：各组克隆球数量及其分化为神经元和星形胶质细胞的变化。结果：①碱性成纤维细胞生长因子组、表皮生长因子＋碱性成纤维细胞生长因子组形成的原代克隆球数量无显著差异[（150．3&;#177;14．9），（173．6&;#177;26．4）个／孔，P〉0．05]，但均明显多于表皮生长因子组[（99.5&;#177;14．9）个／孔，P〈0．01]。②碱性成纤维细胞生长因子组以及表皮生长因子＋碱性成纤维细胞生长因子组克隆球分化为神经元的数量明显多于表皮生长因子组，而表皮生长因子组产生较多的星形胶质细胞。结论：①碱性成纤维细胞生长因子能促进人胎脑室下区神经干细胞增殖，所形成的细胞克隆球能分化出较多的神经元。②两种因子合用并没有获得明显的优于单用碱性成纤维细胞生长因子的结果，提示不存在协同作用。     

昆明种小鼠胚胎神经干细胞的分离及培养

目的:在神经干细胞的分离培养过程中,国内外的报道多数是用胰蛋白酶对组织细胞进行消化,但是消化时间比较难把握.采用胰酶消化与机械分离法相结合的方式对昆明种小鼠胚胎脑神经干细胞进行分离、培养和初步的免疫组织化学检测,为相关研究建立实验条件.方法:实验于2006-10/2007-09在广西医科大学基础医学实验室完成.实验室为广西重点实验室、基础医学博士后工作站. ①实验材料:孕14～16 d的昆明种小鼠由广西医科大学实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:分离昆明种小鼠胎鼠的脑组织,经胰酶消化加机械吹打后,在加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子的B27无血清培养基中培养.③实验评估:用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞.结果:在无血清DMEM/F12培养液中,加入碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子及B27的条件下,培养24 h后可见细胞以悬浮方式生长,三五聚集成团块,48 h后形成由十数个至数十个细胞组成的,大小不等的细胞球,形态规则,细胞无突起,形成典型的神经球,可传代.免疫细胞化学法检测显示,细胞表达神经巢蛋白.结论:①来自昆明种小鼠胎脑的神经干细胞能在体外培养、增殖并具有增殖传代能力.②无血清B27培养基添加表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子有利于神经干细胞的体外培养和促进其增殖.     

昆明种小鼠胚胎神经干细胞的分离与培养

背景：对于神经千细胞的分离培养,目前多采用胰蛋白酶对组织细胞予以消化,但消化时间较难把握。 目的：采用胰酶消化与机械分离法相结合的方式对昆明种小鼠胚胎脑神经干细胞进行分离、培养,并进行初步的免疫组织化学检测。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2006～10/2007—09在广西医科大学基础医学实验室完成。材料：孕14-16d的昆明种小鼠由广西医科大学实验动物中心提供。 方法：分离昆明种小鼠胎鼠的脑组织,经胰酶消化加机械吹打后,在加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子的B27无血清DMEMIF12培养基中培养。主要观察指标：用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞。结果：培养24h后,细胞以悬浮方式生长,聚集成团：48h后形成由数十个细胞组成的细胞球,形态规则,体积大小不等,细胞无突起,形成典型的神经球,可传代扩增。免疫细胞化学染色结果示细胞巢蛋白呈阳性表达。 结论：在含有表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的无血清B27培养基条件下,有利于小鼠胚胎神经干细胞的体外培养和传代增殖。     

碱性成纤维细胞生长因子对体外培养大鼠胚胎脊髓神经细胞的作用

目的:适当的碱性成纤维细胞生长因子剂量能促进脂质过氧化活性,发挥保护脊髓神经细胞的功能。设立不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子,比较其对大鼠胚胎脊髓神经细胞生长发育和脂质过氧化的影响,筛选出保护脊髓损伤的机会窗口。方法:实验于2006-08/10在江苏大学医学技术学院细胞培养室完成。①实验方法:健康成年妊娠16d的Wistar孕鼠1只,取出胚胎脱颈椎法处死,分离脊髓组织胰蛋白酶消化,制备细胞悬液,将脊髓神经细胞密度调整至4×105L-1。碱性成纤维细胞生长因子组分别向细胞悬液中加入1,10,50,100,200μg/L碱性成纤维细胞生长因子20μL,设立正常对照组。②实验评估:倒置相差显微镜下观察胚胎脊髓神经细胞形态,计数集落数,确定细胞分化的结果。检测超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量及相对蛋白质含量。结果:①胚胎脊髓神经细胞的形态:刚接种的脊髓神经细胞为圆形,随着培养的时间延长胞体逐渐增大,伸出突起的脊髓神经细胞逐渐增多、突起伸长。培养5～8d的脊髓神经细胞胞体最丰满,周围晕光明显,随后大量脊髓神经细胞增殖形成细胞岛。②鼠胚胎脊髓神经细胞的生长分化:与正常对照组比较,碱性成纤维细胞生长因子10,50,100μg/L组细胞集落数明显增加(P<0.05);至200μg/L时细胞集落数减少(P<0.01),细胞存活率明显下降,甚至出现细胞死亡现象。③鼠胚胎脊髓神经细胞相对蛋白质含量:与正常对照组比较,碱性成纤维细胞生长因子10,50,100μg/L组可明显提高鼠胚胎脊髓神经细胞相对蛋白质含量(P<0.05);至200μg/L时则产生抑制作用(P<0.01)。④鼠胚胎脊髓神经细胞抗氧化指标检测:与正常对照组比较,碱性成纤维细胞生长因子10,50,100μg/L组超氧化物歧化酶活性升高,丙二醛含量降低(P<0.05);至200μg/L时丙二醛含量明显升高(P<0.01)。结论:10～100μg/L的碱性成纤维细胞生长因子能促进鼠胚胎脊髓神经细胞的生长发育,增加细胞突起长度,调节脂质过氧化水平,维持细胞内的自由基动态平衡。     

山羊骨髓间充质干细胞向纤维软骨分化的形态学改变简

背景：前期初步研究发现,碱性成纤维细胞生长因子可诱导骨髓间充质干细胞向颞下颌关节盘细胞方向分化,且碱性成纤维细胞生长因子10μg/L诱导组合成胶原量明显高于5μg/L诱导组。目的：观察经不同浓度碱性成纤维细胞生长因子诱导后的骨髓间充质干细胞的超微结构变化。方法：原代分离培养山羊骨髓间充质干细胞,选P3,P4细胞,用5,10μg/L碱性成纤维细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞,以未加碱性成纤维细胞生长因子培养的骨髓间充质干细胞做对照。倒置相差显微镜观察细胞生长状况,用第7,14,21天的细胞爬片行蕃红O、天狼猩红和Ⅰ型胶原免疫组织化学染色,并观察第21天细胞的超微结构。结果与结论：经不同浓度碱性成纤维细胞生长因子诱导后,骨髓间充质干细胞可向颞下颌关节盘成纤维细胞样细胞形态分化,10μg/L组细胞更像关节盘成纤维细胞样细胞。提示骨髓间充质干细胞有向颞下颌关节盘细胞方向分化的形态学基础。     

胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1联合诱导大鼠脊髓源性神经干细胞的分化特点

目的:观察胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1体外联合诱导对脊髓源性神经干细胞分化的影响,为了解神经干细胞在体内多因素环境下的分化表现提供实验依据。方法:实验于2005-10/2006-09在南方医科大学附属深圳医院中心实验室完成。①碱性成纤维细胞生长因子,表皮生长因子,胶质细胞源性神经营养因子,转化生长因子β1(PeproTech);胎牛血清(Hyclone);神经巢蛋白多抗(武汉博士德);胶质纤维酸性蛋白多抗,神经丝蛋白单抗(Sigma)。②选用清洁级孕16d的SD大鼠10只,无菌条件下取出胚胎,进行脊髓源性神经干细胞的分离培养。基础培养基组成:含青霉素、链霉素、两性霉素B及体积分数为0.02B27添加液的DMEM/F12。③原代培养1周后,获取体外稳定增殖的鼠脊髓源性神经干细胞克隆,在基础培养基中加入体积分数为0.1的胎牛血清作为对照。同时设立碱性成纤维细胞生长因子组、转化生长因子β1组、胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组,换用诱导培养基,即分别在基础培养基中加入20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2μg/L转化生长因子β1、10μg/L胶质细胞源性神经营养因子 2μg/L转化生长因子β1。观察在不同因子诱导情况下脊髓源性神经干细胞的分化行为,免疫细胞化学染色标记神经元与星状胶质细胞的表达。④通过荧光激发流式细胞仪分选技术对分化细胞计数,检测不同诱导环境下神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率。结果:①细胞分化的形态学观察:分化早期可见神经球贴壁,大量细胞向四周爬出,1周后迁徙的大部分细胞完全贴壁,完成分化过程。在细胞密度较低区域可辨认出3种神经细胞类型:神经元样细胞、星状胶质样细胞、寡突胶质样细胞。②神经干细胞免疫组织化学检测:血清对照组、转化生长因子β1组存在大量胶质纤维酸性蛋白染色阳性的星状胶质细胞;而碱性成纤维细胞生长因子组、胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组分化的神经元细胞数量较多,神经丝蛋白染色阳性。③流式细胞荧光分选计数:诱导1周后,胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组神经元分化比例最高,明显高于碱性成纤维细胞生长因子组(χ2=19.56,P<0.05),而与血清对照组、转化生长因子β1组比较差异有极其显著性意义(χ2=24.15,25.32,P均<0.01)。碱性成纤维细胞生长因子组星状胶质细胞分化比例最低,胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组组与其相近(χ2=17.23,P>0.05),而血清对照组、转化生长因子β1组则显著升高(χ2=24.45,23.79,P均<0.01)。结论:体外胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1的联合诱导有利于脊髓源性神经干细胞向神经元的分化,为脊髓原位神经干细胞分化及神经干细胞移植体内后的分化表现提供了实验数据。