角质形成细胞与黑素细胞体外构建含黑素的组织工程皮肤

目的 探讨体外构建含黑素的组织工程皮肤.方法 采用两步酶消化法处理健康小儿包皮,获得表皮细胞悬液,分别用人角质形成细胞(KC)无血清培养基(SFM)及改良的M254黑素细胞培养基培养KC、黑素细胞(MC),并传至第3代.将第3代KC接种于培养瓶中,48 h后加入第3代MC(MC:KC为1:10)混合培养.制备人去表皮的真皮(DED),将培养第3代的MC、KC制成细胞悬液,按照1:10的比例接种于DED表面,采用液下培养和空气-液面培养相结合的方式进行培养,2周后取培养的组织工程皮肤分别做HE染色、角蛋白免疫组化染色及Masson-Fontana染色.结果 KC、MC混合培养于培养皿5 d后,于倒置显微镜下观察到KC呈铺路石状生长,其间散布MC,且树突延伸到KC细胞间.两种细胞混合接种于DED 15 d后,HE染色显示在DED上有3～6层表皮细胞,并可见角质层,角蛋白免疫组化染色阳性,银氨染色显示基底层见黑素着色.结论 MC、KC混合接种于培养皿可构建MC和KC接触生长的单细胞层,将MC、KC接种于DED可构建含有黑素成分的组织工程皮肤.

Abstract：

Objective To construct tissue-engineered skin containing melanin with mixed culture of human keratinocytes (KCs) and melanocytes (MCs) on de-epidermized dermis (DED) in vitro. Methods Single-cell suspension was obtained by digestion of isolated preputial epidermis with pancreatin. Keratinocyte serum-free medium (K-SFM) and modified M254 culture medium were used to culture KCs and MCs respectively. Third-passage KCs were seeded into cell culture flasks and cultured for 48 hours; then, third-passage MCs were seeded into the same cell culture flasks with the MC/KC ratio being 1: 10 followed by a 5-day coculture. The suspension of third-passage KCs and MCs with the MC/KC ratio of 10:1 were seeded onto the surface of a prepared DED and maintained at the air-liquid interface for 11 days following a 4-day submerged culture.Subsequently, the constructed tissue-engineered skin was examined with HE staining, immunohistochemical staining for keratin and Masson-Fontana staining. Results After coculture in flasks for 5 days, KCs exhibited a typical paving-stone appearance, MCs with projected dendrites were scattered in the extracellular space between KCs. HE staining revealed 3 to 6 layers of cells with the formation of stratum corneum after mixed culture on DED for 15 days. Keratin protein was positive throughout the artificial epidermis, and melanin pigments were located in the basal layer of the epidermis as Masson-Fontana staining showed. Conclusions The co-culture of MCs and KCs can form single-cell layers with the contact between MCs and KCs in flasks, and construct tissue-engineered skin with melanin component on DED in vitro.     

以正常人皮肤成纤维细胞滋养层培养人角质形成细胞的研究

目的探索和建立人皮肤成纤维细胞(HDF)滋养层培养人角质形成细胞的技术方法。方法在HDF滋养层制备中,对丝裂霉素C的较适浓度、同一株不同代数的HDF滋养层、滋养层的细胞密度对正常人表皮角质形成细胞（NHEK）生长的影响及NHEK的最低接种密度进行了初步的探索。结果①终浓度为10μg/mL的丝裂霉素C是制备HDF滋养层的较适浓度。②同一株1～20代的HDF滋养层对不同来源的NHEK均有较好的促生长增殖作用,1～20代HDF的培养代数与9例NHEK生长达80％融合时间(平均为11.1d)之间相关无显著性(r=-0.27,P>0.05)。③用HDF滋养层培养NHEK可减少原代培养NHEK的接种量,用NHEK最小接种密度是0.1×10     

五倍子对角质形成细胞、黑素细胞和成纤维细胞体外增殖的影响

目的 了解中药五倍子治疗瘢痕疙瘩的药用成分和药用机制以及可能存在的不良反应。方法 用MTT比色试验研究五倍子单宁酸对正常人皮肤中的角质形成细胞、黑素细胞和成纤维细胞体外增殖的影响。并与秋水仙碱及红花和芦荟进行了比较。结果 ①五倍子单宁酸与五倍子生药醇提物对人成纤维细胞的增殖具有相似的抑制作用。在20μg/mL及以上质量浓度时,对人皮肤黑素细胞的抑制作用较大,其细胞增殖率是不加药对照组的73.6%～68%。在50μg/mL以下的质量浓度对人角质形成细胞的体外增殖有轻微的促进作用(111%～112%)。②红花生药醇提物和芦荟水提液在实验浓度下均可促进人角质形成细胞的体外增殖,芦荟水提液还可促进人成纤维细胞的体外增殖。结论 单宁酸是五倍子醇提物中的主要活性物质,其对黑素细胞的抑制作用提示五倍子单宁酸可能存在毒副作用。     

不同培养条件对皮肤角质形成细胞和成纤维细胞增殖的影响

目的观察含不同血清浓度培养基对皮肤角质形成细胞和成纤维细胞体外活性的影响。方法体外培养、扩增皮肤角质形成细胞和成纤维细胞,按3×10^5／ml的密度接种于96孔板,加入含不同血清浓度的K-SFM培养基培养。并用MTY比色法观察细胞活性。结果应用K—SFM＋10％FBS组培养基培养成纤维细胞与DMEM＋10％FBS为对照组培养细胞的活性影响相同（P〉0．05）;应用K-SFM＋1％FBS培养基培养角质形成细胞与K—SFM为对照组培养细胞的活性影响相同（P〉0．05）;结论在构建人工皮肤体外模型时,角质形成细胞和成纤维细胞可分别加用含1％FBS、10％FBS的K—SFM培养基进行培养。     

不同培养条件对皮肤角质形成细胞和成纤维细胞的活性增殖影响

目的 观察含不同血清浓度培养基对皮肤角质形成细胞和成纤维细胞体外活性的影响. 方法 体外培养、扩增皮肤角质形成细胞和成纤维细胞,按3×105/ ml的密度接种于96孔板,加入含不同血清浓度的K-SFM培养基培养.并用MTT比色法观察细胞活性. 结果 应用K-SFM+10%FBS组培养基培养成纤维细胞与DMEM+10%FBS为对照组培养细胞的活性影响相同(P＞0.05);应用K-SFM+1%FBS培养基培养角质形成细胞与K-SFM为对照组培养细胞的活性影响相同(P＞0.05); 结论 在构建人工皮肤体外模型时,角质形成细胞和成纤维细胞可分别加用含1%FBS、10%FBS的K-SFM培养基进行培养.     

在Ⅳ型皮肤的皮肤类似物中成纤维细胞对角质形成细胞起增殖作用而对黑素细胞的生长和色素沉着起抑制作用

利用去表皮的真皮和成纤维细胞基质构建了皮肤类似物模型，并且利用该模型观察了成纤维细胞分泌的可溶性因子对黑素细胞增殖和黑素合成的影响。方法：①从新鲜环切的成人包皮(Ⅳ型皮肤)分离表皮角质形成细胞、黑素细胞和真皮成纤维细胞，分别培养至第二代；②用去表皮的真皮作底物构建     

用同一皮肤标本培养、纯化人正常黑素细胞、角质形成细胞及成纤维细胞的观察

目的建立从同一皮肤标本同步培养人正常黑素细胞、角质形成细胞和成纤维细胞的技术。方法利用同一供体的包皮,表真皮分离后,置37℃,5%CO2的孵箱中培养,根据细胞生长状况进行相应的传代和纯化处理。结果获得大量纯化、生长良好的人正常黑素细胞、角质形成细胞和成纤维细胞。结论实现了对同一组织来源的三种细胞在不同培养基中生长状况的同步观察。     

蓝光影响人皮肤角质形成细胞、成纤维细胞及黑素细胞生物活性的初步研究

目的初步探讨蓝光对人皮肤角质形成细胞、成纤维细胞与黑素细胞生物活性的影响。方法收集2021年6月至2021年12月昆明医科大学第一附属医院10例3 ～ 12岁健康儿童包皮环切术后的废弃包皮, 分离表真皮后采用选择培养基分离角质形成细胞、成纤维细胞、黑素细胞。根据预实验结果采用0、5、10、20、30、40 J/cm2剂量440 ～ 450 nm蓝光分别照射上述3种细胞, 继续培养0、6、24、48 h, 在各时间点采用CCK8法检测细胞增殖活力;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测角质形成细胞分泌白细胞介素18(IL-18)、IL-33、神经生长因子(NGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和成纤维细胞分泌IL-33、角质形成细胞生长因子(KGF)的浓度;NaOH裂解法检测黑素细胞黑素合成率;Western印迹检测黑素细胞酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸相关蛋白酶1(TRP-1)及多巴色素异构酶(DCT)的相对表达。采用双因素方差分析进行组效应、时间效应和交互效应的分析。结果各剂量蓝光照射后不同时间, 角质形成细胞组间(F时间 = 516.20、F剂量 = 421.20、F交互 ...     

角质形成细胞和成纤维细胞对白癜风发病和治疗的影响

黑素细胞在白癜风发病及治疗中是最关键的一环,但表皮、真皮间的沟通联系对皮损及非皮损皮肤的功能均具有重要影响,其中角质形成细胞、成纤维细胞及细胞外基质等非黑素细胞起了重要作用,并影响白癜风的发病。本文从细胞因子、氧化应激等角度总结了角质形成细胞、成纤维细胞对白癜风发病的影响及在临床治疗中的作用机制。     

正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞Fas和Fas配体的表达

Ｆａｓ和Ｆａｓ配体（ＦａｓＬ）结合可导致表达Ｆａｓ的细胞凋亡,是细胞凋亡的一个主要途径［１］。已经证明Ｆａｓ表达于正常角质形成细胞和成纤维细胞中,但是到目前为止还没有ＦａｓＬｍＲＮＡ表达在正常角质形成细胞中的直接证据。我们采用高敏感的ＲＮＡ酶保护法,半定量地检测了正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞的Ｆａｓ和ＦａｓＬｍＲＮＡ,并用流式细胞仪检测了细胞表面表达Ｆａｓ和ＦａｓＬ蛋白的阳性细胞数,以阐明Ｆａｓ及ＦａｓＬ在角质形成细胞和成纤维细胞凋亡中的作用,为研究正常皮肤生长、凋亡及某些皮肤病的发病机理提供…     

不同灌注流速对复方壳多糖组织工程真皮生长代谢的影响

目的：探讨三维动态培养条件下不同灌注流速对复方壳多糖组织工程真皮生长代谢的影响。方法将人真皮成纤维细胞（HDF）以2×104/ml的终浓度接种到复方壳多糖胶原凝胶中,采用自制的灌注培养装置,培养基分别以50、100和200 ml/min的流速灌注培养12 d,以静态培养为对照。用倒置显微镜观察细胞形态,MTT法检测细胞活力,葡萄糖及乳酸测试盒检测细胞代谢特性,HE染色观察细胞形态和分布,羟脯氨酸测试盒检测胶原合成,同时用改进后的高敏度小张力膜状生物材料力学检测装置检测最大抗张强度。统计分析采用重复测量方差分析、单因素方差分析及LSD?t检验。结果灌注组细胞比对照组更密集,第8天时100 ml/min灌注组细胞几乎全部融合成片,200 ml/min灌注组细胞约达80%融合,且有沿培养基流动方向生长的趋势。MTT结果显示,4组细胞增殖活性（A值）都随培养时间的延长先持续上升后逐渐下降（P<0.05）,其中灌注组的细胞增殖活性均明显高于对照组,100 ml/min灌注组的最大细胞增殖活性是对照组的1.67倍,且显著高于其他组（均P<0.05）。各组培养基中葡萄糖含量随培养时间延长均下降（P<0.05）,第12天时100 ml/min灌注组的葡萄糖含量（1.604±0.038 mmol/L）显著低于对照组（2.205±0.020 mmol/L）、50 ml/min灌注组（1.939±0.037 mmol/L）及200 ml/min灌注组（2.047±0.039 mmol/L）,均P<0.05。各组乳酸含量随时间变化的趋势与葡萄糖含量的变化相反,均缓慢上升（P<0.05）,但其最大值对真皮内HDF影响不明显。培养第12天,100 ml/min灌注组的羟脯氨酸含量及最大抗张强度均显著高于其余3组,且组间差异均有统计学意义（F=61.512、694.216,均P<0.05）。培养第6、10天,灌注培养条件下细胞在支架中的分布比静态培养时均匀,胞核较大、长,且灌注组细胞数量显著高于对照组（均P<0.05）,其中100 ml/min灌注组的细胞数量最多,显著高于其他灌注组（均P<0.05）。结论100 ml/min的灌注流速更适合培养复方壳多糖组织工程真皮,此流速下的细胞活力、细胞分布、代谢速度、胶原合成及最大抗张强度都优于其他组。     

体外重建皮肤与正常人皮肤基本特征的对比研究

目的 用正常人的皮肤角质形成细胞和黑素细胞在体外重建皮肤,为将来用于临床、生物及药理学研究奠定基础.方法 从正常儿童的包皮分离、培养角质形成细胞、黑素细胞和成纤维细胞.用成纤维细胞和I型鼠尾胶原制备真皮类似物.将角质形成细胞和黑素细胞接种到真皮类似物表面进行培养,制备表皮类似物.将重建的皮肤类似物和正常人皮肤进行对比研究.结果 皮肤类似物的组织形态包括基底层、基底上层、角质层与正常人皮肤相似.与基底膜形成有关的标志,在皮肤类似物和正常人皮肤中的表达是相似的.角蛋白10、泛角蛋白在皮肤类似物和正常人皮肤中的表达也是相似的.结论 组织形态和所检测的各种标志的表达显示,该皮肤类似物与正常人皮肤相似.     

无血清培养基培养人毛乳头细胞的研究

目的 探讨无血清培养液培养人头皮毛乳头细胞(dermal papillae cells,DPC)的可行性,并研究其生长特性。方法 预先应用纤维连接蛋白处理细胞培养瓶(板);采用Williams E无血清培养液并补充ITS(牛胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸盐)培养第2代DPC,倒置相差显微镜下观察细胞生长状态,采用MTT评价其增殖状态并绘制其生长曲线。结果 在无血清培养条件下,DPC在2～4h内贴壁。2～3d后细胞可相互融合.未见细胞明显增殖;培养4d后细胞连接开始中断。形成孤立的细胞或细胞团,并可见细胞的脱落;培养1～2周后,细胞大多脱落。给予含4%小牛血清的DMEM培养10h后,在残余的细胞团周围长出放射状排列的细胞;生长曲线显示DPC的生长呈现停滞期和缓慢生长期,未见指数生长期。结论 采用无血清培养基可以培养DPC,但其培养条件有待优化。     

须癣毛癣菌的组织工程皮肤感染模型的构建

目的 体外构建须癣毛癣菌的组织工程皮肤感染模型。 方法 用牛Ⅰ型胶原溶液复合原代成纤维细胞培养3 d后,在其表面利用气液界面培养原代角质形成细胞和黑素细胞12 d得到组织工程皮肤,取新鲜的须癣毛癣菌悬液5 μl对其进行感染,分别在12、24、48、72 h进行HE染色和PAS染色观察。 结果 成纤维细胞复合胶原构建结构致密均匀的组织工程真皮,其上角质形成细胞和黑素细胞形成了层次清晰、结构良好的组织工程表皮。须癣毛癣菌感染该组织工程皮肤后,随时间延长,HE染色和PAS染色显示须癣毛癣菌对组织工程皮肤结构的破坏逐渐加重,至48 h,表皮破坏最明显,至72 h,组织工程皮肤的整体结构被菌丝和孢子所替代。 结论 初步建立了须癣毛癣菌的组织工程皮肤感染模型。     

不同肤色个体表皮角质形成细胞Caspase14表达的研究

目的 探讨不同肤色人群角质形成细胞中Caspase14表达变化,明确黑素细胞和（或）黑素对其表达的影响。 方法 以Western印迹检测不同肤色个体原代角质形成细胞Caspase14的表达。取体外培养不同肤色的2代角质形成细胞,分别加入不同肤色的黑素细胞在分化培养基下共同培养24 h,以不加黑素细胞组为对照,Western 印迹检测Caspase14的表达。结果 浅、深肤色个体包皮原代角质形成细胞Caspase14的表达存在显著差异,深肤色者（Fitzpatrick Ⅳ/Ⅴ）原代角质形成细胞中Caspase14的表达显著高于浅肤色者（FitzpatrickⅠ/Ⅱ）（P ＜ 0.01）;深、浅肤色个体的角质形成细胞在与不同肤色个体的黑素细胞在分化培养基中共培养后24 h后,检测发现,与对照组相比,浅肤色个体角质形成细胞Caspase14表达的增加,差异无统计学意义（P ＞ 0.05）,而深肤色个体角质形成细胞Caspase14的表达则显著上调（P ＜ 0.05）。结论 深肤色个体角质形成细胞Caspase14表达显著高于浅肤色个体者。黑素细胞显著增加深肤色者角质形成细胞中Caspase14水平的表达。     

Comparison of Gene Expression Profiles between Keratinocytes,Melanocytes and Fibroblasts

Background

The skin has many important functions such as protection, preservation, temperature regulation, and vitamin D synthesis. It is composed of a variety of cell types including keratinocytes, melanocytes and fibroblasts.

Objective

We attempted to compare the gene expression profiles between keratinocytes, melanocytes and fibroblast, using cDNA microarray.

Methods

Keratinocytes, melanocytes and fibroblasts were primary cultured from five foreskin specimens. Total RNAs were extracted and pooled to reduce the individual variations, and then used for cDNA microarray.

Results

Total 12,028 genes were selected as the reliable genes whose expression was detected in at least one of the three cell types. By comparing the relative expression levels with cutoff limitation as a fourfold change, we obtained 126 fibroblast-specific, 179 keratinocyte-specific and 173 melanocyte-specific genes, many of which are known to be characteristically expressed in each cell type. In addition, we identified many genes whose skin-specific functions have not yet been determined.

Conclusion

Our data provide important information on which to base further investigation into the specification of skin cell types.     

一种胶原基质全层皮肤模型的构建和表征

目的 构建一种体外维持时间长、有利于后续测试研究的胶原基质皮肤模型。方法 将猪胶原和正常人皮肤成纤维细胞混合接种于培养皿,培养得到真皮层结构后,将第3 ~ 7代正常人角质形成细胞接种于真皮层表面,培养得到双层皮肤模型。通过HE和Masson染色评估皮肤模型的形态和组织结构,使用电镜观察模型的超微结构,并通过免疫组化和免疫荧光染色观察模型中各层的主要标记物表达情况。结果 HE和Masson染色发现,皮肤模型与正常人皮肤组织有相近的真皮及表皮结构,且模型收获后仍具有稳定良好的真表皮结构,可在体外继续培养14 d。电镜下显示,皮肤模型中可见角质层中脂质、颗粒层中透明角质颗粒、角化桥粒、桥粒、基底膜等超微结构。免疫组化及免疫荧光显示,皮肤模型在表皮层中具有与正常皮肤一致的转谷氨酰胺酶、丝聚合蛋白、角蛋白10、Ki67的表达,基底膜具有与正常皮肤一致的Ⅳ型胶原和层黏连蛋白5表达,真皮层具有一致的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及原纤维蛋白表达。结论 本研究构建的三维皮肤模型组织结构和多种蛋白的表达与正常人体皮肤相似,模型收获后体外可继续稳定培养至少14 d。     

组织工程皮肤的临床应用

组织工程皮肤是目前组织工程领域研究的热点，也是该领域发展最成熟的。国外许多产品已经被美国食品药品管理局批准进入临床应用。供研究和应用的组织工程皮肤主要包括表皮替代物、真皮替代物、全层皮肤替代物。已广泛应用于烧伤、溃疡、皮肤病的治疗中。