弓形虫ROP16蛋白诱导肝癌细胞凋亡的检测

目的观察弓形虫ROP16蛋白转染肝癌细胞Hep G2后,肝癌细胞的凋亡比率的变化以及细胞凋亡蛋白的表达水平变化。方法克隆弓形虫ROP16基因,构建真核转染质粒,并用脂质体转染的方式转染Hep G2细胞,48小时后,用流式细胞仪检测细胞凋亡比率,用western blotting和RT-PCR的方法检测细胞凋亡相关蛋白caspase-9、Bax、Bcl-2等的表达水平。结果与未转染细胞组相比,弓形虫ROP16转染Hep G2细胞后,肝癌细胞的凋亡比率明显升高。促细胞凋亡蛋白caspase-9、Bax的蛋白表达水平和基因转录水平均升高,而抑制细胞凋亡蛋白Bcl-2的表达水平和转录水平下降。结论 ROP16蛋白可以诱导肝癌细胞Hep G2发生凋亡。     

TRAIL联合环氧合酶抑制剂体外诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的 探讨塞莱昔布增加TRAIL诱导肝癌细胞HepG2、Hep3B凋亡的分子机制.方法 应用流式细胞仪分析塞莱昔布联合应用TRAIL对肝癌细胞HepG2和Hep3B细胞周期的影响;Western blot检测HepG2和Hep3B细胞在塞莱昔布作用前后凋亡信号传导蛋白caspase-8,caspase-3,caspase-9,DR4,DR5,DcR1,c-FLIP,RIP,Cytc,Smac和Bid的表达变化.结果 联合用药组中HepG2及Hep3B细胞生存率分别为29.37%±2.68%和22.75%±2.77%,显著低于塞莱昔布单独用药组的73.04%±4.03%和66.90%±3.47%(t=9.975,P＜0.01).塞莱昔布预先处理能够下调c-FLIP及RIP的表达及增加Cytc、Smac、Bid的表达,但对DR4、DR5、DcR1的表达无明显影响.结论 TRAIL联合塞莱昔布通过下调c-FLIP及RIP的表达,活化死亡受体通路及上调Bid的表达,激活线粒体通路诱导肝癌细胞凋亡.     

Survivin mRNA表达对肝癌细胞凋亡和增殖及MDR-1影响的实验研究

目的　研究新的凋亡抑制因子survivinmRNA在肝细胞癌 (hepatocellularcarcinoma ,HCC)中的表达 ,测定肝癌的细胞凋亡和增殖及多药耐药基因mRNA在HCC中的表达 ,探讨survivin表达对肝癌细胞凋亡和增殖的影响及其与HCC多药耐药之间的相互关系。方法　 31例HCC癌组织及癌旁组织标本取自 2 0 0 0年 8月至 2 0 0 1年 4月浙江大学医学院第二附属医院。用逆转录聚合酶链反应(RT PCR)、TUNEL法和免疫组织化学法分别测定HCC癌组织及癌旁组织中survivinmRNA的表达情况、细胞凋亡指数和增殖指数及MDR 1mRNA的表达 ,分析在HCC中survivin表达与细胞凋亡和增殖之间的相互关系 ,探讨survivin表达在HCC发生发展中的作用及其与MDR 1mRNA表达之间的关系。结果　 31例肝癌组织中survivinmRNA阳性例表达率为 71% (2 2 / 31) ,阴性表达率为 2 9% (9/ 31) ;而癌旁正常组织中均无表达。肝癌标本中的凋亡指数为 :0 4 %～ 15 % ,平均值为 :(4 2 4± 3 92 ) %。Sur vivinmRNA阳性表达病例平均AI值为 (4 6 4± 4 30 ) % ,阴性表达平均AI值为 (3 36± 2 98) %。两者比较P >0 0 5 ,两组间无显著差异。肝癌标本中增殖指数为 :2 %～ 80 % ,平均值为 (2 6 2 1± 14 9) %。SurvivinmRNA阳性表达病例平均Ki 6 7LI值为 (30 32± 15 4     

Survivin 抑制人胆管癌细胞凋亡相关信号通路的实验研究

目的:探讨survivin基因对人胆管癌细胞凋亡信号通路的调节机制.方法:构建针对survivin基因的siRNA和对照siRNA,将QBC939人胆管癌细胞分为3组,分别为siRNA-survivin转染组,对照siRNA转染组和未转染组.转染后,首先用Western blot检测未转染QBC939细胞和QBC939/siRNA(-)细胞及QBC939/siRNA(+)细胞中survivin的表达,验证干扰效果,继而分别用流式细胞仪,激酶活性测定和Western blot检测以上3种状态的QBC939细胞的凋亡情况,caspase-3的活性和caspase-3,caspase-9及procaspase-9凋亡信号分子的表达.结果:QBC939/siRNA(+)细胞survivin蛋白表达量明显低于未转染的QBC939细胞(P＜0.05),而QBC939/siRNA(-)细胞survivin蛋白表达量无明显改变(P＞0.05).与未转染的QBC939细胞比较,QBC939/siRNA(+)细胞凋亡明显增加,caspase-3活性明显升高,caspase-3和caspase-9表达明显上调,而procaspase-9表达降低(均P＜0.05);上述指标在QBC939/siRNA(-)细胞与未转染的QBC939细胞间的差异无统计学意义(均P＞0.05).结论:survivin基因可能通过促进procaspase-9的活化阻止caspase-3和caspase-9的激活,从而抑制胆管癌细胞的凋亡.     

抑制survivin 表达对肝癌细胞阿霉素化疗敏感性的影响

目的:探讨survivin基因沉默对人肝癌耐药株阿霉素化疗敏感性的影响.方法:针对人survivin基因设计并合成3条siRNA序列,分别用脂质体法转染人肝癌BEL-7402细胞(3组).以未转染的BEL-7402细胞为对照,分别用RT-PCR法,免疫细胞化学技术及MTT法检测各组细胞survivinmRNA与蛋白的表达,及对阿霉素敏感性.结果:与对照组比较,各转染组细胞survivin mRNA与蛋白的表达均明显降低(均P＜0.05);对照组细胞对阿霉素的IC50值为(20.60±2.86) μg/mL,各转染组细胞对阿霉素的IC50值分别为(11.53±1.46) μg/mL,(14.13±1.82) μg/mL,(15.53±0.46) μg/mL,与对照组比较差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论:抑制survivin基因的表达能增加BEL-7402细胞阿霉素化疗敏感性.     

高良姜素下调Bcl-2通过线粒体途径促进人肝癌Hep3B细胞凋亡

目的 研究高良姜素对人肝癌Hep3B细胞凋亡的影响并探讨相关机制. 方法 体外培养人肝癌Hep3B细胞,经高良姜素处理后,RT-PCR和Western blot检测Bcl-2 mRNA和蛋白的表达水平,MTT法测定细胞生长抑制率,Annexin V-FITC/PI双标记法测定细胞凋亡率,流式细胞仪分析线粒体膜电位,Western blot检测Caspase-3、9及Cytochrome C蛋白的表达水平. 结果 高良姜素使Hep3B细胞中Bcl-2 mRNA和蛋白的表达水平明显下降.不同剂量的高良姜素(40、80、120 μmol/L)对细胞生长抑制率分别为6.38％±1.32％,21.58％±1.97％和43.18％±3.89％,明显高于对照组(t低剂量组=13.01,t中剂量组=15.12,t高剂量组=14.79,均P＜0.01);细胞凋亡率分别为21.58％±1.97％,34.18％±3.89％和43.18％±3.89％,明显高于对照组(分别t低剂量组=24.67,t中剂量组=32.35,t高剂量组=25.89,均P ＜0.01);线粒体膜电位绿色荧光蛋白表达百分比分别为18.93％±2.3％,31.11％±2.67％和46.06％±2.95％,明显高于对照组(分别t低剂量组=16.70,t中剂量组=31.38,t高剂量组=48.15,均P ＜0.01);Caspase-3、9和胞质内Cytochrome C表达水平明显高于对照组(Caspase-3:分别t低剂量组 =11.94,t中剂量组=10.18,t高剂删量组=18.82,均P＜0.01;Caspase-9:分别t低剂量组=15.11,t中剂量组=20.41,t高剂量组=21.25,均P＜0.01;Cytochrome C:t低剂量组=15.11,t中剂量组=28.47,t高剂量组=16.01,P＜0.01),而线粒体中Cytochrome C表达水平明显低于对照组(分别t低剂量组=16.70,t中剂量组=12.00,t高剂量组=27.61,均P＜0.01). 结论 高良姜素可下调Bcl-2 mRNA和蛋白表达促进人肝癌Hep3B细胞凋亡,其作用机制可能与线粒体途径相关.     

受体作用蛋白在肝癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导凋亡耐受中的作用

目的 观察受体作用蛋白(RIP)基因的表达变化在肝癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导凋亡耐受中的作用.方法 以肝癌细胞HepG2、Hep3B为研究对象,制备RIP siRNA的细胞模型,应用流式细胞仪分析两种细胞模型对TRAIL作用后细胞周期的变化,Western blot检测其在RIP基因沉默前后凋亡信号传导蛋白Caspase-8、Caspase-3、DFF-45的表达变化.结果 转染RIP siRNA后,细胞恢复了对TRAIL诱导凋亡的敏感性,当TRAIL浓度为100 μg/L时,HepG2及Hep3B转染组的细胞生存率为(60.02±5.23)％和(50.78±3.76)％,显著低于对照组的(96.44±5.43)％和(101.85±6.41)％(P＜0.01);细胞生存周期SubG1期为(76.89±6.68)％和(72.45±7.31)％,显著高于对照组的(0.78±0.07)％和(3.62±0.38)％(P＜0.01).转染组TRAIL单独作用,可以引起HepG2 siRNA及Hep3B siRNA凋亡传导通路上传导蛋白Caspase-8、Caspase-3的裂解.结论 肝癌细胞对TRAI诱导凋亡的耐受可能与其传导通路上RIP蛋白的表达相关,抑制其表达可以导致凋亡传导蛋白Caspase-8、Caspase-3的裂解,促使凋亡的发生,恢复肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性.     

小分子RNA干扰同时沉默表皮生长因子受体和胰岛素样生长因子-1受体基因对肝癌细胞周期和凋亡的影响

目的 观察小分子RNA干扰(riRNA)同时沉默表皮生长因子受体(EGFR)和胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)基因对肝癌细胞周期和凋亡的影响.方法 构建真核表达载体,转染质粒48 h后通过流式细胞仪、噻唑蓝(MTT)检测细胞周期、凋亡、增殖变化以及Western blot检测CDK1、CDK2和p53蛋白的表达.结果 转染48 h后双基因干扰组吸光度为0.2,G0/G1和G2/M期细胞比例分别为72.70±0.26和7.38±0.06,凋亡率为17％,CDK1、CDK2蛋白的表达降低,与对照组和单基因干扰组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 同时沉默EGFR和IGF1R基因能有效干扰肝癌细胞增殖、诱导细胞凋亡,并使肝癌细胞阻滞于G0/G1期,干扰多个受体分子可能是一种新的肝癌治疗途经.     

RNA干扰survivin联合X线放射对大肠癌SW480细胞的影响

目的探讨RNA干扰技术和X线放射处理对大肠癌细胞survivin基因表达的影响。方法合成靶向人survivin基因的siRNA,转染大肠癌细胞SW480,联合或不联合放射治疗。检测转染前后及放射前后细胞survivinmRNA的表达;细胞抑制率及凋亡率,细胞周期分布,细胞survivin蛋白的表达。结果转染survivinsiRNA后的SW480细胞survivin mRNA及蛋白的表达明显低于对照组;SW480细胞转染survivinsiRNA 48 h后G2/M期细胞达(20.90±2.62)%,survivinsiRNA联合放射处理组细胞生长抑制率达59.8%,FCM显示survivinsiRNA联用放射处理组细胞凋亡率达(35.72±1.07)%。结论靶向survivin的siRNA能有效抑制大肠癌细胞SW480 survivin基因的表达,引起大肠癌细胞SW480 G2/M周期阻滞,抑制大肠癌细胞SW480的生长并能诱导其凋亡,并对大肠癌细胞SW480具有放射增敏作用。     

靶向survivin的siRNA诱导肝癌细胞化疗敏感性的研究

目的探讨靶向survivin的siRNA对肝癌细胞化疗敏感性的影响。方法构建siRNA真核表达载体,稳定转染肝癌细胞HepG2后观察其对丝裂霉素(MMC)作用的转基因后肿瘤细胞的效应。结果测序证实siRNA真核表达载体构建成功。RT-PCR检测到siRNA在mRNA水平抑制survivin基因表达率达73%。MTT法观测siRNA作用下MMC对HepG2,HepG2/Silence(-)细胞的存活率,结果显示,仅在48 h时,加MMC组细胞的存活率(0.505±0.015)显著低于对照组(0.824±0.322)(P0.05)。当survivin的表达被有效抑制时,肝癌细胞存活率(0.520±0.017)在12 h点显著低于对照组(0.741±0.005),且48 h点达到高峰(P0.05)。免疫印迹法显示,未加MMC前survivin蛋白表达的OD值为34 273±323,加入MMC12,24,48 h survivin蛋白表达的OD值均显著降低(分别为21 415±142,16 771±122和13 672±133),均有统计学差异(均P0.05)。流式技术检测HepG2/Silence(+)加MMC组12,24,48 h细胞凋亡率与对照组比较,差异有统计学意义。Caspase-3活性检测显示HepG2/Silence(+)细胞在MMC作用下0,12,24,48 h Caspase-3活性分别为0.19±0.05,0.33±0.12,3.79±0.27和9.34±0.86;各时点间差异具显著性(均P0.05)。结论靶向survivin的siRNA不仅有效抑制肝癌细胞中survivin的表达,而且增强了细胞对MMC的敏感性,其作用机制系通过增强细胞内caspase-3活性,增加肝癌细胞的凋亡而实现的。     

重组质粒pcDNA3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP的构建及在HepG2细胞的表达

目的 构建热休克蛋白70(HSP70)启动子调控内皮抑素(Endo)基因的重组质粒pcDNA3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP,观察其在HepG2细胞中的表达规律.方法 用聚合酶链反应(PCR)法体外扩增HSP70启动子(350 bp);用EcoR Ⅰ、Sal Ⅰ双酶切法切取质粒pSP-Endo/EGFP中Endo/EGFP,克隆到pcDNA 3.1(+)中获得重组质粒pcDNA 3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP.脂质体介导转染HepG2细胞,转染24 h后予以37、39、41、43、45℃加热诱导30 min,荧光显微镜和流式细胞术检测EGFP的表达,逆转录(RT)-PCR法检测细胞内Endo mRNA的表达;ELISA法检测转染细胞上清中Endo蛋白浓度.结果 合成HSP70启动子序列测序结果与Gene Bank中AL671762所提供序列完全一致.低温加热可增强HepG2细胞中Endo/EGFP表达,43℃组EGFP表达强度达37℃组的3.3倍.43℃组Endo mRNA表达水平高于不加热组.43℃组上清Endo蛋白浓度为(177±28)μg/L,高于不加热组(43±11)μg/L.结论 成功构建HSP70启动子调控Endo基因的重组质粒,低温加热可增强HepG2细胞中Endo基因的表达.     

生存素反义寡核苷酸联合 P53基因抑制胃癌细胞的生长作用

目的 研究生存素（survivin）反义寡核苷酸联合抑癌基因P53对人胃癌细胞系HS-746T的抑制作用及机制。方法 用P53基因和设计合成的survivin反义寡核苷酸（ASODN）对胃癌细胞系HS-746T进行处理，分空白对照组、反义survivin转染组，P53基因组，反义survivin加P53共转染组。采用细胞计数和四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖能力及细胞生长速度，用RT-PCR技术和Western印迹法分析survivin mRNA及蛋白质的表达情况，末端原位标记染色法（TUNEL）分析细胞凋亡指数。结果 不同时间反义survivin转染组、P53基因组和共转染组均对胃癌细胞的生长有抑制作用，且能够下凋胃癌细胞survivin mRNA和蛋白质的表达，共转染组较单独用药组效应明显增强，共转染组胃癌细胞凋亡指数高于另外两组。结论 Survivin反义寡核苷酸联合P53基因抑制人胃癌细胞的生长及诱导凋亡的作用大于单独应用一种药物。     

不同温度热疗对宫颈癌Caski细胞坏死和凋亡的分析

目的探讨不同温度热疗对宫颈癌Caski细胞坏死和凋亡的影响。方法采用水浴对宫颈癌Caski细胞行43℃,45℃,47℃实验组和37℃对照组热疗,四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪测定细胞凋亡和坏死率,免疫组化检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的表达。结果45℃,47℃组的细胞增殖抑制率在24h、48h、72h、96h分别为76.11%±5.32%、81.08%±4.03%、74.71%±3.78%、72.16%±4.75%和88.57%±3.77%、91.33%±2.43%、91.09%±1.17%、92.05%±1.67%,明显高于43℃组的26.57%±3.46%、25.49%±2.76%、22.80%±3.16%、26.87%±4.01%（q=10.41,18.23,14.53,13.57,P〈0.05;q=14.41,21.62,16.03,16.01,P〈0.05）。45℃与47℃组细胞增殖抑制率在24h、72h、96h的差异无显著性（q=3.01,1.49,2.44,P〉0.05）。45℃组的细胞凋亡率最高,为12.82%±1.77%,与其他各组之间的差异具有显著性（F=18.69,P〈0.05）。47℃组的细胞坏死率最高,为39.15%±5.67%,各组之间的差异均有显著性（F=69.16,P〈0.05）。PCNA的表达随着温度的增加而降低,45℃,47℃组的平均光密度值（average optical density,AOD）分别是0.22±0.02、0.21±0.01,与37℃对照组0.28±0.02相比差异具有显著性（q=4.75,5.76,P〈0.05）。结论45℃及以上的热疗能够明显抑制Caski细胞的增殖,增加凋亡和坏死率,降低PCNA的表达。     

缺氧诱导因子1α的表达对HepG2细胞增殖与凋亡的影响

目的观察缺氧诱导因子1α（HIF-1α）对HepG2细胞增殖相关CyclinD1、CyclinA基因与凋亡相关Survivin、Bcl-2基因的影响。方法对Tet—on基因表达系统调控的缺氧诱导因子1α转染入HepG2细胞,用不同质量浓度的强力霉素对受强力霉素调控、稳定表达HIF—1α的HepG2^Tet-on进行凋亡诱导,检测肝癌细胞的凋亡和HIF-1α、CyclinD1、CyclinA、Survivin、Bcl-2的基因表达。结果终浓度分别为0、0．1、1、5mg／L的对HIFHepG2^Tet-on进行细胞凋亡诱导,细胞凋亡率分别为56．4％±7．8％、42．7％±4．9％、31．5％±6．1％、19．7％±4．5％;随着强力霉素浓度的增加,HIF-1α、CyclinD1、CyclinA、Survivin、Bcl-2基因表达水平增加,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论HIF-1α基因在体外可以促进HepG2细胞的增殖,抑制其凋亡,而且随着HIF—1α基因表达水平的增加作用不断增强,这可能与HIF-1α诱导CyclinD1、CyclinA、Survivin、Bcl-2基因表达有关。     

IGF-Ⅱ对阿霉素诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的拮抗作用研究

目的 研究胰岛素样生长因子Ⅱ(insulin-like growth factor Ⅱ,IGF-Ⅱ)对阿霉素(adriamycin,ADM)诱导的人肝癌细胞HepG2凋亡的影响及其与凋亡抑制蛋白survivin表达的关系.方法 实验分组:A组:空白对照组;B组:200 ng/ml ADM组;C组:2 n/ml IGF-Ⅱ+200 ng/ml ADM组;D组:20 ng/ml IGF-Ⅱ+200 ng/ml ADM组;E组:200 ng/ml IGF-Ⅱ+200 ng/ml ADM组,分别处理HepG2细胞48 h后,应用MTF检测各组细胞活力,流式细胞仪检测细胞的凋亡率,Western blot检测细胞中survivin蛋白的表达.结果 A、B、C、D、E组的HepG2细胞活力分别为:0.568±0.025、0.201±0.020、0.232±0.027、0.268±0.013、0.304±0.019,凋亡率分别为:6.9%±1.3%、35.4%±2.1%、31.2%±2.2%、26.4%±1.7%、21.7%±1.9%,survivin与β-actin的比值分别为:0.527±0.039、0.147±0.081、0.311±0.069、0.421±0.033、0.469±0.031,结果显示IGF-Ⅱ+ADM组的HepG2细胞活力较ADM组明显好转(P＜0.01),凋亡率显著降低(P＜0.01),IGF-Ⅱ+ADM组的HepG2细胞中survivin蛋白的表达较ADM组明显增高(P＜0.01),且IGF-Ⅱ的上述作用随IGF-Ⅱ浓度的增高而增强(P＜0.05).结论 IGF-Ⅱ能够上调HepG2细胞中survivin蛋白的表达,拮抗ADM诱导的HepG2细胞凋亡.     

Survivin基因在原发性胆囊癌中的表达及其与P53,PCNA蛋白表达的关系

目的: 探讨Survivin基因在原发性胆囊癌(PGC)中的表达情况,以及与P53,PCNA蛋白表达的相互关系.方法: 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测9例PGC新鲜癌组织Survivin mRNA表达,对38例PGC石蜡包埋组织应用免疫组织化学法检测Survivin,P53和PCNA蛋白的表达,并将结果进行相关分析.结果: 9例PGC新鲜癌组织中3例有Survivin mRNA表达.21例(55.2%)PGC Survivin蛋白表达阳性,而12例胆囊腺瘤中有2例表达,20例癌旁正常组织中则无表达.PGC Survivin蛋白表达阳性率显著高于胆囊良性病变和正常胆囊组织(P<0.01).Survivin蛋白在PGC中的表达与PCNA指数相关,与P53蛋白表达、PGC病理分级和Neiv分期无显著相关.结论: Survivin基因在PGC中存在高表达,Survivin基因表达上调通过不同的机制影响PGC细胞的凋亡和增殖,在PGC发生、发展过程中起作用.     

联合转染Livin和Survivin shRNA表达载体对肝癌HepG2细胞生物学行为的影响

目的:分别构建Livin、Survivin基因短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,探究联合转染Livin和Survivin真核表达载体对肝癌HepG2细胞生物学行为的影响。方法:分别设计并构建针对Livin、Sur-vivin基因shRNA真核表达载体pSD11-Livin和pSD11-Survivin,脂质体法单独或联合转染肝癌HepG2细胞,分空白对照组、质粒对照组、Survivin组、Livin组和共转染组。荧光定量PCR、Western blot分别检测Livin、Survivin mRNA及蛋白的相对表达量,MTT法检测细胞增殖的变化,TUNEL法检测细胞凋亡率。结果:针对Livin、Survivin基因的shRNA真核表达载体构建成功。共转染组Livin、SurvivinmRNA相对表达量分别为0.120±0.022、0.325±0.125,与单独转染组相比显著降低(P<0.05);共转染组Livin、Survivin蛋白相对表达量分别为0.412±0.099、0.473±0.051,与单独转染组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。共转染组转染后48、60、72 h细胞生长抑制率均显著高于单独转染组(P<0.05),转染后48 h细胞凋亡率明显上升(P<0.05)。结论:针对Livin、Survivin基因的shRNA真核表达载体构建成功。联合转染pSD11-Livin和pSD11-Survivin更有效地降低了Livin和Survivin基因在HepG2细胞中的表达,更显著地抑制了肝癌细胞的增殖,促进了肝癌细胞的凋亡。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ对人肝癌细胞生长和凋亡的影响及其机制

目的 检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)在人肝癌、癌旁和正常肝组织的表达,探讨激活或抑制PPARγ在肝癌细胞株生长和凋亡中的作用及其机制.方法 应用免疫组织化学方法检测20例肝癌、癌旁和正常肝组织中PPARγ的表达,Western blot检测2种肝癌和1种正常肝细胞株中PPARγ表达;PPARγ激动剂15dPGJ2和拮抗剂T0070907分别干预培养的2种肝癌细胞株,噻唑蓝(MTT)检测细胞生存率,流式细胞术(FCM)检测细胞周期及凋亡,试剂盒检测Caspase-3活性变化.结果 肝癌组织中PPARγ表达高于癌旁和正常肝组织(P＜0.05),PPARγ主要在肝癌细胞质中表达;肝癌细胞株PPARγ表达比正常肝细胞株高(P＜0.05);15dPG-J2抑制肝细胞增殖而T0070907则促进肝癌细胞增殖(P＜0.05).15dPG-J2可使肝癌HepG2和SMMC7721细胞G0/G1期细胞比例由(42.5±0.9)%和(49.0±3.8)%增高至(61.0±2.0)%和(67.5±2.2)%,(P＜0.05),S期由(30.5±0.3)%和(43.0±2.5)%降低至(6.6±1.1)%和(25.1±2.0)%(P＜0.05).而且,15dPG-J2可明显促进两种肝癌细胞凋亡,凋亡率分别增加约24.4%和22.4%,并可增强细胞Caspase-3活性(P＜0.05);Caspase抑制剂Z-VAD-FMK则可逆转15dPG-J2对肝癌细胞的促凋亡作用.结论 PPARγ在肝癌细胞中表达升高,其表达主要位于细胞质中,为无活性状态.PPARγ激动剂可活化PPARγ和Caspase通路,抑制肝癌细胞生长,促进细胞凋亡.

Abstract：

Objective To investigate the expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) in human liver cancer tissue and cells, and to explore the effects and mechanisms of PPARγ on growth and apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells. Methods The expression of PPARγ in 20 cases of liver cancer, tumor adjacent tissue, normal liver, one liver cell line and two liver cancer cell lines were detected by immunohistochemistry or Western blotting. Two incubated malignant cell lines were exposed to PPARγ agonist 15dPGJ2 or antagonist T0070907, cell viability was determined by methyl thiazol tetrazolium (MTT) assay and cell cycle distribution and apoptosis were examined by flow cytometry (FCM). Consequently, the activity of caspase-3 following treatments of 15dPGJ2 or T0070907 was observed by the commercial Caspase-3 Activity Kit. Results The expression of PPARγin liver cancer was higher than that in adjacent and normal liver tissue ( P ＜ 0. 05) and PPART was predominantly expressed in the cytoplasm. Further,the expression of PPARγwas higher in hepatoma cell line than that in normal liver cell line (P＜ 0.05 ). PPARγ agonist 15dPG-J2 inhibited the proliferation while the antagonist T0070907 induced the growth of hepatoma cells (P ＜ 0. 05). G0/G1 phase of HepG2 and SMMC772 cells was blocked by 15dPG-J2, and the ratio were raised from (42.5 ±0.9)% and (49.0 ±3.8)% to (61.0 ±2. 0)% and (67.5 ±2. 2)% ,respectively. Meantime,S phase ratio were decreased from (30. 5 ± 0. 3 ) % and (43.0 ± 2. 5 ) % to ( 6. 6 ± 1. 1 ) % and ( 25. 1 ± 2. 0 ) %. Further, 15 dPG-J2 facilitated significant apoptosis in those cell lines and the increased apoptosis ratio were 24. 4% and 22. 4% respectively.Accordingly,the activity of Caspase-3 induced by 15dPGJ2 were 21-and 23-fold higher than those in control groups (P ＜ 0. 05 ). The Caspase inhibitor Z-VAD-fmk expectedly reversed the apoptosis induced by 15dPGJ2 in HepG2 and SMMC772 cells. Conclusion The expression of PPARγ increases in human hepatoma predominantly in cytoplasm with its inactivated form. 15dPG-J2 ,an agonist of PPART inhibits growth and induces apoptotic in hepatoma cells through activation of PPARγ pathway and the consequent Caspase3 signal.     

细胞色素C在氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡中的作用

目的:检测细胞色素C在氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡过程中的作用，分析细胞色素C在线粒体和胞浆中的分布及其与caspase-9活化的关系。方法:用1×10-2mol/L的5-FU处理HepG2细胞，分别作用2,4,8,16,24h，用荧光检测试剂盒检测HepG2细胞凋亡过程中细胞色素C分布变化;Western-blot检测caspase-9的活化和细胞色素C在胞浆及线粒体中的分布。结果:氟尿嘧啶处理肝癌细胞4h后，caspase-9活性开始升高，于16h后达到高峰，与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。Western-blot分析发现caspase-9被蛋白酶水解切断后形成10kD片段;细胞色素C在胞浆中的分布从4h后逐渐增加，16h最明显，而其在线粒体中的分布却正相反;细胞色素C的分布改变和caspase-9的活化基本同步。结论:在氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡过程中caspase-9被活化，并伴有细胞色素C自线粒体中释放到胞浆，提示细胞色素C可能在Caspase-9的活化和肝癌细胞凋亡中起重要作用。     

消化道肿瘤凋亡抑制蛋白表达与体外化疗药物敏感性的关系

目的 探讨消化道肿瘤中p53、survivin、bcl-2蛋白表达与肿瘤细胞体外化疗药物敏感性的关系.方法 对84例胃癌和大肠癌进行MTT法体外化疗药物敏感实验和p53、survivin、bcl-2蛋白免疫组化染色,分析3种凋亡抑制蛋白与9种化疗药物对肿瘤细胞抑制的关系. 结果 本组肿瘤中p53、survivin、bcl-2蛋白表达率分别为64%、89%、61%,survivin与Bcl-2蛋白表达具有正相关性(r=0.3027,P＜0.05).p53强表达与紫杉醇、顺铂对肿瘤细胞抑制率明显降低有关(t=2.1282,P=0.0363;t=3.8850,P=0.0002);survivin蛋白强表达时,长春新碱、顺铂对肿瘤细胞的抑制率明显降低(t=2.1693,P=0.0329;t=2.0247,P=0.0046),但奥沙利铂对肿瘤细胞的抑制率明显增加(t=-2.9070,P=0.0047);bcl-2强表达时,氟尿嘧啶、长春新碱、表阿霉素、奥沙利铂对肿瘤细胞的抑制率明显低于弱表达组(t=2.1483～3.2330,P=0.0347～0.0018).结论 消化道肿瘤凋亡抑制蛋白的表达程度与部分化疗药物耐药性有关,评价某种耐药因子与肿瘤化疗药物敏感性的关系时必须考虑其他因素的影响.