人乳头状瘤病毒16 E6/E7基因稳定表达的永生化角质形成细胞的建立及鉴定

【摘要】 目的 构建人乳头状瘤病毒（HPV）16 E6/E7基因稳定表达的人永生化角质形成细胞（KC），为研究HPV16 E6/E7诱导的细胞永生化及恶性转化机制提供细胞模型。方法 两步消化法分离培养原代人包皮角质形成细胞（HFK），利用慢病毒感染技术对细胞稳定转染HPV16 E6/E7基因，连续培养30代以上，筛选出永生化KC，分为3组：①空白对照组：传代2次的原代HFK；②实验组：传代2次的原代HFK感染LV5-HPV16 E6/E7，感染细胞记录为A0代，感染后以传代次数记录（A1、A2……）；③阳性对照组：HPV16阳性宫颈癌细胞SiHa。应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western印迹实验分别检测空白对照组、实验组、阳性对照组HPV16 E6/E7 mRNA、蛋白及CK14蛋白的表达，CCK-8及Transwell Insert方法检测细胞的增殖及侵袭能力。裸鼠致瘤实验检测实验组A30、阳性对照组SiHa细胞的致瘤能力。结果 成功分离原代HFK。LV5-HPV16 E6/E7重组质粒感染原代HFK后，空白对照组细胞无荧光表达，连续传代后出现衰老表现，实验组A30细胞体积、形态较原代HFK无明显变化，且荧光表达率为100%。与空白对照组相比，实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E6 mRNA表达水平显著升高（t值分别为7.12、8.07、6.53、5.66；P值分别 < 0.001、 < 0.001、 = 0.001、 = 0.005）；与空白对照组相比，实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E7 mRNA表达水平也显著升高（t值分别为3.20、4.29、3.75、4.22；P值分别为0.024、0.008、0.013、0.014）。空白对照组未见HPV16 E6/E7蛋白的表达，而A30及SiHa细胞可见HPV16 E6/E7蛋白的表达。CCK-8实验显示，实验组A10、A20、A30细胞增殖水平显著高于空白对照组（t值分别为6.49、7.55、9.43；P值分别为0.003、0.002、0.001），而A1的增殖水平与空白对照组比较，差异无统计学意义（t = 2.40，P = 0.074）。Transwell Insert侵袭实验显示，A30不能穿过基底膜，SiHa细胞可穿过基底膜被染成蓝色。裸鼠接种A30细胞2个月后无肉眼可见肿瘤，组织学亦显示无肿瘤形成，裸鼠接种SiHa细胞后可于皮下形成肿瘤。结论 通过采用慢病毒技术转染HPV16 E6/E7基因成功建立人永生化角质形成细胞，可作为HPV相关研究中的理想细胞模型。     

慢病毒介导的靶向沉默HPV16E7-shRNA对SiHa细胞DNA甲基转移酶表达的影响

目的 探讨慢病毒携带的靶向人乳头瘤病毒16(HPV16)E7基因的短发夹干扰RNA(shRNA)对HPV16阳性宫颈癌SiHa细胞中4种甲基转移酶(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L)表达水平的影响.方法 构建HPV16 E7基因靶序列的shRNA重组质粒,用BLOCK-iTTM Lentiviral RNAi Expression System试剂盒进行慢病毒包装,分别转染293T细胞48、72 h后收集病毒上清液.分别用含靶向HPV 16 E7-shRNA重组质粒的病毒上清液与完全培养基(1∶1)的混合液(shRNA组)、含空白质粒(即不含靶向HPV16 E7-shRNA序列)的病毒上清液与完全培养基(1∶1)的混合液(阴性对照组)、完全培养基(空白对照组)培养SiHa细胞.感染0、48、96 h后,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测3组SiHa细胞中HPV16 E7和4种甲基转移酶mRNA的表达,Western印迹检测4种甲基转移酶的蛋白表达.结果 感染0h时,shRNA组、阴性对照组、空白对照组SiHa细胞HPV16 E7、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义(均P＞0.05);感染48、96 h时,3组细胞间HPV16 E7和4种DNMT mRNA相对表达量比较,差异有统计学意义(均P＜0.05).shRNA组HPV16 E7、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L mRNA表达水平在48 h时的沉默效率分别为71.13％、50.53％、13.72％、46.27％和17.92％,96 h时分别为83.50％、74.2％、47.8％、64.7％和48.9％;而阴性对照组和空白对照组各时间点表达水平差异无统计学意义(均P＞0.05).慢病毒感染48、96 h时,3组细胞间上述4种DNMT蛋白表达量差异有统计学意义(均P＜0.01).shRNA组4种DNMT蛋白表达水平随感染时间的延长而逐渐下降,感染48 h时DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L蛋白表达抑制率分别为84％、37.2％、59.8％、49.3％,96 h时分别为73.1％、68.7％,55.5％、65.5％.结论 靶向沉默HPV16阳性宫颈癌SiHa细胞E7基因能够干扰DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L mRNA及蛋白的表达.     

紫檀芪对人乳头瘤病毒16整合感染宫颈上皮细胞系生长、凋亡和自噬的影响

【摘要】 目的 探讨紫檀芪对人乳头瘤病毒16（HPV16）整合感染宫颈上皮细胞（H8细胞）生长、凋亡和自噬的影响。方法 紫檀芪与H8细胞共培养24 h和48 h,使用CCK8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测H8细胞凋亡和细胞周期,荧光显微镜观察MDC染色后细胞自噬形态学改变,Western印迹检测各组细胞周期相关蛋白（cyclinD1）、凋亡相关蛋白（caspase3、caspase9）、自噬相关蛋白（Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、P62）、HPV致癌基因蛋白（E6、E7蛋白）的表达。采用单因素方差分析、重复测量方差分析和LSD-t检验分析组间差异。结果 对照组（0）、25、50、75、100 μmol/L紫檀芪作用H8细胞48 h后,各组细胞相对生长率（100.00% ± 1.56%、99.02% ± 4.97%、93.59% ± 2.01%、81.28% ± 4.90%、69.17% ± 7.56%）差异有统计学有意义（F = 77.22,P < 0.05）,随着浓度增加生长率渐降低,各紫檀芪组与对照组比较,均P < 0.05。紫檀芪作用H8细胞24 h后,各组细胞G1 期、G2期、S期细胞比例差异均有统计学意义（F = 7 845.00、51.14、266.50,均P < 0.05）,各紫檀芪组G1期、G2期细胞比例均高于对照组,S期细胞比例均低于对照组（均P < 0.05）。紫檀芪作用48 h后,0 ~ 100 μmol/L组细胞凋亡率分别为11.58% ± 0.50%、14.66% ± 0.22%、13.50% ± 0.49%、14.56% ± 0.19%、15.30% ± 0.76%,各紫檀芪组均高于对照组（均P < 0.05）。紫檀芪作用24 h后细胞MDC染色显示,对照组中仅有少量H8细胞检测到高亮点状荧光,各紫檀芪组高亮点状荧光的自噬小体较对照组增多。Western印迹显示,紫檀芪作用24 h、48 h后各组细胞cyclinD1、caspase3、caspase9、Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、P62、E6、E7蛋白相对表达水平差异均有统计学意义（均P < 0.05）。与对照组比较,紫檀芪处理后cyclinD1表达降低,caspase3、caspase9表达升高,Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、P62升高,E6、E7表达降低（个别浓度组与对照组比较P > 0.05,多数组间比较P < 0.05）。结论 紫檀芪可抑制H8细胞增殖,促进其凋亡和自噬,抑制E6、E7致癌基因的表达。     

人乳头瘤病毒16型 E6通过微小RNA-504调控宫颈癌细胞增殖、侵袭和凋亡的研究

目的 探讨人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6通过微小RNA(miR)-504对宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。方法 将体外培养的SiHa细胞分为对照组、空载体组、E6过表达组、E6过表达+miR-NC组和E6过表达+miR-504组。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测HPV16 E6 mRNA和miR-504的表达;采用免疫印迹法检测HPV16 E6蛋白表达;采用噻唑蓝(MTT)法、Transwell小室和流式细胞仪分别检测细胞增殖、侵袭和凋亡情况。结果 与对照组和空载体组比较,E6过表达组细胞中HPV16 E6蛋白和mRNA表达水平均明显升高,而miR-504表达水平降低(P<0.05);与对照组比较,E6过表达组细胞增殖活力和侵袭能力明显升高,而细胞凋亡率降低(P<0.05);与E6过表达组和E6过表达+miR-NC组比较,E6过表达+miR-504组细胞中miR-504表达水平和细胞凋亡率明显升高,而细胞增殖活力和侵袭能力明显降低(P<0.05)。结论 HPV16 E6可能通过下调miR-504的表达促进宫颈癌SiHa细胞的增殖、侵袭并抑制其细胞凋亡。     

温热对HPV-6/11型早期基因E6和E7表达的影响

目的 探讨不同温热条件对HPV感染皮损中E6/E7基因表达的影响.方法 采用PCR法确定6例尖锐湿疣标本HPV型别.利用37℃,42℃,45℃不同的温热条件处理置于培养液中的离体尖锐湿疣皮损,采用实时定量PCR法检测HPV-6/11型早期基因E6/E7 mRNA的表达水平.结果 6例标本中.各有1例分别感染HPV-6、HPV-11,4例同时感染HPV-6和HPV-11.E6、E7 mRNA的表达水平均随温度升高而逐渐减少.HPV-6 E6 mRNA的相对表达量分别为37℃(1.00±0.00),42℃(0.61±0.17).45℃(0.27±0.15);HPV-6 E7 mRNA的相对表达量分别为37℃(1.00±0.00),42℃(0.56±0.21),45℃(0.16±0.11);HPV-11 E6 mRNA的相对表达量分别为37℃(1.00±0.00),42℃(0.60±0.22).45℃(0.16±0.08);HPV-11 E7 mRNA相对表达量分别为37℃(1.00±0.00),42℃(0.55±0.15).45℃(0.24±0.06).组间比较差异有统计学意义(P<0.01.结论 温热对HPV-6/11型E6和E7基因表达的抑制作用可能是感染消退的机制之一.     

清疣Ⅱ号方对SiHa细胞E7和PCNA蛋白表达的影响

目的 探讨不同浓度清疣Ⅱ号方对体外培养SiHa细胞中E7和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达的影响.方法 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)还原法测定SiHa细胞的增殖抑制水平,采用间接免疫荧光技术观察各组细胞铺片中E7和PCNA蛋白的荧光表达情况.结果 随药物浓度梯度的升高,各实验组细胞增殖活性逐渐降低,增殖抑制率逐渐增高.经中药清疣Ⅱ号方处理后,强表达E7和PCNA荧光的阳性细胞数减少,弱表达E7和PCNA荧光的阴性细胞数增加.E7和PCNA蛋白荧光表达的平均灰度随药物浓度梯度的升高逐渐增高,阳性单位随药物浓度梯度的升高逐渐减小.结论 清疣Ⅱ号方能够有效下调E7和PCNA蛋白的表达,从而抑制体外培养的SiHa细胞增殖.这可能是其临床治疗尖锐湿疣.减少复发的药理作用机制之一.     

Beclin1过表达对黑素瘤SK-MEL-2细胞生物学行为的影响

【摘要】 目的 探讨自噬标志基因Beclin1过表达对黑素瘤SK-MEL-2细胞生物学行为的影响。方法 Western印迹技术检测黑素瘤细胞A375、SK-MEL-2中Beclin1的蛋白表达水平,选取低表达 Beclin1蛋白的SK-MEL-2细胞株作为研究对象,将细胞分为空白组、阴性对照组、实验组,空白组不作处理,阴性对照组转染pcDNA.3.1/myc-His（-）A,实验组转染pcDNA3.1-Beclin1质粒。培养一定时间后,采用CCK8法分析Beclin1对细胞增殖的影响;Transwell实验和细胞划痕实验观察Beclin1过表达对SK-MEL-2细胞侵袭和迁移能力的影响。采用重复测量方差分析和完全随机设计方差分析检验各组间的指标差异,组间比较采用LSD-t检验。结果 SK-MEL-2细胞Beclin1蛋白相对表达水平（0.037 ± 0.010）显著低于A375细胞（0.670 ± 0.150）,F = 46.62,P＜0.05。实验组Beclin1蛋白相对表达水平（0.32 ± 0.04）显著高于阴性对照组（0.06 ± 0.02）和空白组（0.07 ± 0.02）,均P＜0.05。CCK8实验结果显示,不同组间、不同时间细胞增殖率差异均有统计学意义（F组间 = 1 077.36,F时间 = 4 903.04,均P＜0.05）,组别和时间之间有交互作用（F交互 = 205.20,P＜0.05）。Transwell实验显示,24 h后实验组高倍（× 200）视野下穿过小室的细胞数（18.67 ± 1.19）明显低于阴性对照组（87.89 ± 6.05）和空白组（86.78 ± 5.93）,均P＜0.05;划痕实验中24、48 h时实验组细胞迁移距离均显著低于空白组和阴性对照组（P＜0.05）。结论 Beclin1过表达可显著抑制SK-MEL-2细胞的增殖、侵袭和迁移。     

RPL34基因敲低对人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞的影响

【摘要】目的 研究ribosomal protein L34 (RPL34)基因敲低后对皮肤SCC细胞增殖、凋亡的影响。方法 首先通过免疫组化对14例皮肤cSCC患者和16例正常对照的组织进行RPL34表达分析。然后利用慢病毒感染皮肤鳞癌SCL-1 细胞RPL34表达进行基因敲低后,流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡,MTT检测细胞增殖,qPCR检测目的基因敲减效率,Western blot分析RPL34表达水平。计数资料用卡方检验进行比较,计量资料用均数±标准差表示,t检验比较2组间差异。α设定为0.05,P<0.05认为有统计学差异。结果免疫组化实验中,cSCC肿瘤组织中RPL34在细胞浆的表达明显高于正常对照皮肤组织（cSCC组细胞核表达评分为2.929±1.542,细胞浆表达评分为2.143±1.956,正常对照皮肤组织中细胞核表达评分为2.563 ±1.153,细胞浆表达评分为0.500±0.516。）。流式细胞仪分析检测细胞凋亡情况,在空白对照组凋亡率为4.58 %,而RPL34-shRNA组的凋亡率为9.42%（P<0.05）。细胞周期分布情况实验组（shRPL34）处于S期的细胞增多(P<0.05),处于G1期的细胞减少(P<0.05),处于G2/M期的细胞无显著变化(P＞0.05)。MTT检测细胞增殖,shRPL34组的SCL-1细胞OD490吸光率及吸收率变化倍数明显低于空白对照组(P<0.05),提示具有活力的细胞数量明显低于对照组。qPCR结果中,经shRNA慢病毒感染后,实验组SCL-1细胞中RPL34基因在mRNA水平的表达量受到抑制,敲减效率达到85.1%（p<0.05）。结论 RPL34在cSCC中可以调节细胞增殖、凋亡,干扰细胞周期。     

生存素小分子干扰RNA对皮肤鳞状细胞癌A431细胞生存素基因表达及生物学功能的影响

目的 探讨生存素小分子干扰RNA（siRNA）对皮肤鳞状细胞癌A431细胞生存素基因表达及细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭力的影响。方法 培养的A431细胞分为3组：生存素siRNA组、阴性对照组和空白对照组,分别用50.0 nmol/L脂质体包裹的生存素基因序列特异性siRNA、无关序列siRNA阴性脂质体及预制囊泡转染。实时定量反转录-聚合酶链反应（RT?PCR）、Western印迹法分别检测A431细胞生存素mRNA及蛋白的表达。采用MTT比色法检测细胞增殖,流式细胞仪膜联蛋白Ⅴ/碘化丙锭双染法检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭力,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果 转染后48 h,生存素siRNA组、阴性对照组、空白对照组A431细胞中生存素mRNA水平分别为0.56 ± 0.15、0.88 ± 0.37、0.90 ± 0.43,蛋白表达水平分别为0.59 ± 0.04、0.86 ± 0.05、0.91 ± 0.07,差异均有统计学意义（F = 276.67、243.61,均P < 0.001）,且生存素siRNA组生存素mRNA和蛋白表达水平均显著低于阴性对照组和空白对照组,差异均有统计学意义（P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（均P > 0.05）。重复测量方差分析显示,转染生存素siRNA能抑制A431细胞增殖（F = 13.19,P = 0.004）,且生存素siRNA组A431细胞增殖抑制率明显高于阴性对照组和空白对照组（均P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组比较,差异无统计学意义（P > 0.05）。转染后24 h, 3组间A431细胞凋亡率差异有统计学意义（F = 83.97,P = 0.002）,且生存素siRNA组A431细胞凋亡率显著高于阴性对照组（P < 0.05）和空白对照组（P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（P > 0.05）。转染后48 h,生存素siRNA组G2/M期细胞比例显著高于阴性对照组（P < 0.05）和空白对照组（P < 0.05）,而生存素siRNA组A431细胞迁移数及侵袭数均显著低于空白对照组（均P < 0.05）和阴性对照组（均P < 0.05）。结论 生存素序列特异性siRNA能抑制A431细胞生存素基因表达和细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭,提示生存素可成为皮肤鳞状细胞癌基因治疗的靶点。     

阿维A对HaCaT细胞体外凋亡和胰岛素样生长因子结合蛋白7及血管内皮生长因子表达的影响

目的 探讨阿维A对HaCaT细胞体外凋亡和胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP7）及血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。 方法 将10-5、10-6、10-7、10-8 mol/L的阿维A分别作用于HaCaT细胞24、48、72 h后,采用CCK8法检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测阿维A对HaCaT细胞凋亡率的影响;Western印迹和RT-PCR法检测阿维A对HaCaT细胞IGFBP7、VEGF蛋白及其mRNA表达的影响。 结果 10-8 mol/L阿维A处理HaCaT细胞48 h时表现出对细胞增殖的抑制作用,随着时间延长和药物浓度升高,抗增殖作用亦增强,当药物浓度增加到10-5 mol/L时,48 h和72 h的抑制率分别为39.94% ± 2.27%和49.77% ± 1.87%。与对照组相比,10-5 mol/L阿维A作用48 h后,凋亡率由1.803% ± 0.313%（对照组）上升至7.617% ± 0.767%（阿维A组）（P ＜ 0.05）,IGFBP7的表达由0.436 ± 0.013上升至0.939 ± 0.040（P ＜ 0.05）,IGFBP7 mRNA的表达由0.190 ± 0.056上升至0.872 ± 0.079（P ＜ 0.05）,VEGF的表达由0.798 ± 0.036下降至0.213 ± 0.032（P ＜ 0.05）,VEGF mRNA的表达由0.933 ± 0.054下降至0.274 ± 0.041（P ＜ 0.05）。 结论 阿维A可促进HaCaT细胞的体外凋亡,并可在蛋白及mRNA水平上调IGFBP7及下调VEGF的表达。     

尖锐湿疣角质形成细胞中陷窝蛋白1的表达与细胞增殖和凋亡的相关性

目的 探讨陷窝蛋白1在尖锐湿疣角质形成细胞中的表达及其与角质形成细胞增殖和凋亡的相关性.方法 免疫组化En Vision法和TUNEL技术检测40例尖锐湿疣皮损组织和10例健康人包皮组织中角质形成细胞陷窝蛋白1、增殖细胞核抗原的表达和细胞凋亡,计算陷窝蛋白1平均吸光度、增殖指数和凋亡指数,比较两组之间的差异,并分析尖锐湿疣组中陷窝蛋白1表达与增殖指数、凋亡指数的相关性.针对陷窝蛋白1基因设计3条siRNA,用脂质体转染法将siRNA导人HaCaT细胞,用荧光定量PCR方法筛选出于扰效果最佳的siRNA,转染HaCaT细胞为实验组,转染非特异序列的细胞为阴性对照组,未转染的细胞为空白对照组.Western印迹和免疫荧光检测转染48 h后陷窝蛋白1的表达水平;MTS法分别测定干扰陷窝蛋白1基因24、48、72 h后HaCaT细胞增殖的变化;流式细胞仪(FCM)检测干扰陷窝蛋白1基因48 h后HaCaT细胞的凋亡情况.结果 尖锐湿疣角质形成细胞中陷窝蛋白1的表达(0.042±0.021)显著低于正常包皮组织(0.181±0.075),差异有统计学意义(t=5.843,P＜0.001).尖锐湿疣皮损中角质形成细胞的增殖指数(65.63％±19.86％)和凋亡指数(24.12％±10.86％)均显著高于正常包皮组织(23.51％±4.00％,3.13％±1.12％),两组差异有统计学意义(t=12.440、11.970,均P＜ 0.001).尖锐湿疣组陷窝蛋白1表达与增殖指数呈显著负相关(r=-0.798,P＜0.05),与凋亡指数呈显著正相关(r=0.825,P＜ 0.05).荧光定量PCR显示siRNA-2在浓度25 nmol/L下抑制效果最佳.Western印迹和免疫荧光显示,转染siRNA 48 h后,实验组陷窝蛋白1的表达显著低于空白对照组和阴性对照组(P＜0.05).MTS结果显示,实验组细胞24、48和72 h时的A值分别为0.563±0.013、0.628±0.006和0.811±0.018,高于空白对照组(0.541±0.009、0.575±0.012和0.722±0.004)和阴性对照组(0.536±0.006、0.571±0.015和0.719±0.002),差异有统计学意义(均P＜0.05),空白对照组和阴性对照组间差异无统计学意义(P＞0.05).实验组HaCaT细胞凋亡率为(8.90％±0.06％),低于空白对照组(20.59％±0.87％)和阴性对照组(20.64％±0.09％),差异有统计学意义(均P＜ 0.05),空白对照组和阴性对照组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 尖锐湿疣角质形成细胞中陷窝蛋白1表达下降,可能与角质形成细胞增殖加快、细胞凋亡减少有关.     

沙利度胺对人真皮成纤维细胞增殖活性及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响

目的：研究沙利度胺对健康人真皮成纤维细胞增殖活性及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白α1 mRNA和Ⅰ型胶原蛋白α1表达的影响,初步探讨沙利度胺抗真皮纤维化的潜在作用。方法原代培养人正常真皮成纤维细胞,选用第4代成纤维细胞用于后续试验。细胞分为3组,分别用10?3、10?4、10?5 mol/L沙利度胺处理,同时设空白对照组（仅用DMEM培养基处理）。24 h后,采用CCK?8法检测细胞增殖活性,荧光定量PCR法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白α1 mRNA表达,Western印迹法测定Ⅰ型胶原蛋白α1表达。结果10?3、10?4 mol/L沙利度胺组细胞存活率为77.40%±4.25%、88.56%±6.43%,均显著低于空白对照组（100.00%±6.74%,均P<0.05）,但10?5 mol/L沙利度胺组（96.66%±1.098%）与空白对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）。10?3、10?4、10?5 mol/L沙利度胺组Ⅰ型胶原蛋白α1 mRNA相对表达水平分别为0.279±0.025、0.427±0.040、0.658±0.032,均显著低于空白对照组（1.016±0.003,均P<0.05）,Ⅰ型胶原蛋白α1表达水平亦显著低于空白对照组（均P<0.05）。Ⅲ型胶原蛋白α1 mRNA表达水平在10?3、10?4、10?5 mol/L沙利度胺组分别为0.551±0.039、0.756±0.025、0.826±0.018,与空白对照组（0.988±0.012）比较显著降低（均P<0.05）。结论沙利度胺在一定浓度范围内可抑制健康人真皮成纤维细胞增殖,并抑制Ⅰ型胶原蛋白α1 mRNA和蛋白表达及Ⅲ型胶原蛋白α1 mRNA表达。     

阿维A对缺氧培养的HaCaT细胞体外增殖和缺氧诱导因子1α及血管内皮生长因子表达的影响

目的 通过阿维A作用于缺氧培养的HaCaT细胞,初步探讨阿维A治疗银屑病的可能机制.方法 将浓度为10-5、10-6、10-7、10-8mol/L的阿维A分别作用于HaCaT细胞,用CCK-8法检测缺氧培养12、24、36h对HaCaT细胞体外增殖的影响.反转录PCR和Western印迹检测不同浓度阿维A对缺氧培养24 h的HaCaT细胞HIF-1α、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白及mRNA表达的影响.结果 阿维A 10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L作用24 h,HaCaT细胞体外增殖抑制率分别为(13.31±1.15)％、(21.86±5.31)％、(32.05±2.99)％、(37.28±3.21)％,且随着缺氧培养时间延长和阿维A浓度增加,对HaCaT细胞体外增殖的抑制作用逐渐增强.当阿维A浓度为10-5mol/L时,HIF-1α蛋白的表达由1.196±0.088降至0.319±0.180(P＜ 0.05),而HIF-1α mRNA表达水平无明显下降;VEGF mRNA的表达由1.108±0.073降至0.442±0.090(P＜ 0.05),VEGF蛋白的表达则由1.174±0.186降至0.216±0.066(P＜ 0.05).结论 阿维A可抑制缺氧培养的HaCaT细胞体外增殖,并在蛋白水平下调HIF-1α及VEGF的表达,在mRNA水平下调VEGF的表达.     

熊果酸对干扰素γ刺激HaCaT细胞产生白细胞介素33的影响

目的：探讨熊果酸对干扰素γ（IFN?γ）刺激HaCaT细胞产生白细胞介素33（IL?33）的影响及其机制。方法不同浓度熊果酸（0、0.1、1、5、10、20、40、80μmol/L）分别刺激HaCaT细胞24、48、72 h,MTT法检测其对细胞增殖的影响。将HaCaT细胞与200μg/L IFN?γ共培养建成炎性细胞模型,再与10和15μmol/L熊果酸共培养,以IFN?γ诱导的HaCaT炎性细胞模型为对照,探讨熊果酸的抗炎作用,RT?PCR法检测IL?6和IL?33 mRNA的表达,Western印迹法检测IL?33、p?ERK1/2和ERK1/2蛋白的表达。结果 MTT法检测显示,5~20μmol/L熊果酸作用24 h对细胞活力影响不大,而40~80μmol/L熊果酸在各个时间点均可明显抑制HaCaT细胞增殖（P<0.05）,故后续实验采用10和15μmol/L浓度。HaCaT细胞经IFN?γ刺激后,IL?33 mRNA（0.812±0.036）、IL?6 mRNA（0.947±0.091）表达量和IL?33蛋白表达（1.317±0.119）均显著高于空白对照组（分别为0.412±0.021、0.595±0.030和0.147±0.036,均P<0.05）;而IFN?γ+10μmol/L熊果酸组（分别为0.447±0.042、0.437±0.099和0.923±0.058）和IFN?γ+15μmol/L熊果酸组（分别为0.438±0.028、0.350±0.075和0.564±0.113）又较IFN?γ组（分别为0.812±0.036、0.947±0.091和1.317±0.119）显著降低（均P<0.05）,且这两个熊果酸组IL?33 mRNA水平与空白对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）,而IFN?γ+15μmol/L熊果酸组IL?33蛋白水平显著低于IFN?γ+10μmol/L熊果酸组（P<0.05）。HaCaT细胞分别经IFN?γ刺激5、60 min后,p?ERK1/2蛋白表达均明显高于空白对照组。IFN?γ+15μmol/L熊果酸5 min组和60 min组p?ERK1/2蛋白的相对表达量（0.458±0.053、0.302±0.054）分别低于IFN?γ5 min组（0.941±0.042）和60 min组（0.509±0.032）,差异均有统计学意义（P<0.05）,而总ERK1/2蛋白表达量不变。结论熊果酸能够降低IFN?γ刺激的HaCaT细胞IL?33的表达量,其机制可能与调节ERK信号通路相关蛋白的表达有关。     

普萘洛尔对体外培养血管瘤内皮细胞的影响及其分子机制

目的 研究普萘洛尔对体外培养的血管瘤内皮细胞(HemEC)增殖及凋亡的影响,探讨其分子机制.方法 收集7例增生期血管瘤患儿的手术切除血管瘤组织用于体外培养HemEC,同时培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为对照.采用0、25、50、75、100、125、150 μmol/L普萘洛尔分别处理两种细胞24、48、72 h.MTT法检测各组细胞的存活率,流式细胞仪检测凋亡率.采用含或不含100 μmol/L普萘洛尔的培养基分别培养HemEC(分别为普萘洛尔干预组及空白对照组)18h,提取两组细胞总RNA,采用表达谱基因芯片技术检测两组HemEC中差异表达的基因,并通过实时定量PCR验证.结果 25 μmol/L普萘洛尔作用24、48 h可引起HemEC轻微增殖(P＜0.05),而≥100 μmol/L普萘洛尔作用≥24 h可引起HemEC存活率下降,作用≥48 h可引起HUVEC存活率下降.100 ～150 μmol/L普萘洛尔作用24～72 h,HemEC细胞存活率比HUVEC低(P＜0.05).100 ～ 150 μmol/L普萘洛尔作用下,HemEC凋亡率随普萘洛尔作用时间及浓度逐渐升高(均P＜0.05).普萘洛尔干预HemEC后,表达谱基因芯片技术筛选出186个表达差异倍数≥1.5的基因,其中表达明显上调的基因128个,明显下调的58个.实时定量PCR显示,普萘洛尔干预组前蛋白转化酶枯草溶菌素9 mRNA表达水平为空白对照组的(9.88士2.19)倍,脂肪酸结合蛋白3 mRNA为(21.90±8.18)倍,差异均有统计学意义(t=7.028、4.427,P＜0.05).结论 高浓度普萘洛尔对HemEC及HUVEC的增殖均有抑制作用,且对HemEC的抑制作用更强.普萘洛尔抑制HemEC的增长可能与抑制HemEC增殖及促进其凋亡有关.     

MiR-146a 在长波紫外线诱导人皮肤成纤维细胞光老化中作用机制的研究

目的：探讨长波紫外线（UVA）诱导人皮肤成纤维细胞（HSF）光老化中 miR-146a 的表达情况,以及上调 miR-146a 表达对其靶基因 Smad4及细胞光老化的影响。方法以10 J/cm2 UVA 照射 HSF （UVA 照射组）,分别在0、3、7、14 d 提取 RNA,实时定量 PCR 检测 miR-146a 的表达量。通过慢病毒转染上调 miR-146a 的表达（miR-146a 过表达组）,在7 d、14 d 后用荧光显微镜观察转染效率,并通过实时定量 PCR 验证细胞内miR-146a 表达量。空白对照组为正常培养的 HSF（不做任何处理）,miR-146a 过表达组为慢病毒转染 HSF 后,再用 UVA 照射。MTT 法检测空白对照组、UVA 照射组、miR-146a 过表达组、miR-146a 过表达组细胞增殖吸光度（A 值）,实时定量 PCR 检测各组细胞内老化相关基因 p53、p16和 p21 mRNA 的表达,Western 印迹法检测各组细胞内 Smad4蛋白表达。采用重复测量的方差分析、析因设计的方差分析进行统计学分析。结果重复测量的方差分析显示,随培养时间的延长,UVA 照射组和空白对照组 miR-146a 的表达量均逐渐下降（F =213.840, P <0.01）;UVA 照射组表达量低于空白对照组（F =52.55,P <0.01）,且照射时间越长,下调越明显。慢病毒转染HSF 后,细胞内均有较高的荧光表达,miR-146a 过表达组在第7天（10.31±0.17）与第14天时（9.65±0.19）的miR-146a 表达量差异无统计学意义（P >0.05）,但较空白对照组（分别为8.33±0.13和7.86±0.11）显著增高,组间差异有统计学意义（F =42.49,P <0.01）。析因设计的方差分析显示,UVA 照射对细胞增殖活性有抑制作用（P <0.01）,UVA 照射组、UVA + miR-146a 组细胞增殖均分别低于空白对照组、miR-146a 过表达组（P <0.01）;慢病毒转染上调 miR-146a 的表达对细胞增殖活性也有影响（P <0.01）,但 miR-146a 过表达组与空白对照组差异无统计学意义（P >0.05）,UVA + miR-146a 组显著高于 UVA 照射组（P <0.01）。实时定量 PCR 和 Western 印迹法结果显示,UVA 照射可上调 p21、p53、p16 mRNA 的表达（均 P <0.01）,同时对细胞内 Smad4蛋白表达有促进作用（P <0.01）;UVA 照射组、UVA + miR-146a 组 p21、p53、p16 mRNA 和 Smad4蛋白表达均分别高于空白对照组、miR-146a 过表达组（均 P <0.01）,而 miR-146a 过表达组与空白对照组相比差异均无统计学意义（均 P >0.05）, UVA + miR-146a 组均显著低于 UVA 照射组（均 P <0.01）。结论在 UVA 诱导光老化的 HSF 中,miR-146a 的表达受到抑制,上调其表达能够抑制 Smad4的表达,促进光老化细胞增殖,起到抗细胞光老化的作用。