牛蒡子苷元对体外C6胶质瘤细胞的抑制效果和凋亡机制

目的:探讨牛蒡子苷元对体外C6胶质瘤细胞的抑制效果和凋亡机制。方法:将牛蒡子苷元作用于C6胶质瘤细胞,采用CCK-8法测定各组细胞的生长抑制率;流式细胞术检测细胞凋亡情况;酶联免疫吸附试验检测TNF-α、IL-2的水平;Western blot检测Bax、Bcl-2、NF-кB蛋白表达水平。结果:与空白组比较,牛蒡子苷元组(2.5～40μmol/L)显著抑制C6胶质瘤细胞生长,诱导肿瘤细胞凋亡,其诱导效应具有浓度依赖性;牛蒡子苷元处理后,细胞中TNF-α、IL-2水平增加;牛蒡子苷元可以显著上调Bax蛋白表达,下调Bcl-2、NF-кb蛋白表达。结论:牛蒡子苷元可以促进C6胶质瘤细胞凋亡,可能是通过增强TNF-α、IL-2水平及上调Bax蛋白、下调Bcl-2、NF-кB蛋白水平而诱导肿瘤细胞凋亡。     

红花黄色素对乳腺癌耐药细胞MCF－7／ADR 缝隙连接蛋白 Cx43的影响

目的：观察红花黄色素对乳腺癌耐药细胞MCF－7／ADR缝隙连接蛋白Cx43的影响。方法取对数生长期的MCF－7／ADR细胞,以2×105 cells／孔接种于6孔培养板,24 h后分为4组,每组3孔,其中3组分别加入红花黄色素至终浓度25、50、100 mg／L,另一孔设为空白对照组,作用48 h。 Western blot法检测各组MCF－7／ADR细胞中Cx43表达水平。结果不同浓度红花黄色素作用于MCF－7／ADR细胞48 h后, Cx43表达水平均增高,有明显的剂量依赖关系,以50、100 mg／L浓度作用显著（ P＜0．01）。结论红花黄色素能提高乳腺癌耐药细胞MCF－7／ADR缝隙连接蛋白Cx43的表达水平。     

青藤碱对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用

目的:研究青藤碱对人肝癌HepG2细胞增殖的影响及其机制。方法:以不同浓度青藤碱处理体外培养的A549细胞,采用MTT法检测24h、48h、72h后HepG2细胞的增殖状态;流式细胞仪测定青藤碱处理过的细胞凋亡、细胞周期分布及凋亡率,相对定量RT-PCR测定Cox-2mRNA的表达、Western blot检测细胞凋亡相关基因Cox-2的表达。结果:青藤碱能显著抑制人肝癌HepG2细胞增殖,并具有时间和剂量依赖性。青藤碱处理组细胞早期凋亡率较对照组升高,呈时间剂量依赖性。相对RT-PCR结果显示其能下调HepG2细胞Cox-2mRNA的表达。Western blot检测Cox-2蛋白表达明显抑制。结论:青藤碱在体外能有效抑制肝癌细胞增殖。     

虎杖对大鼠肝癌细胞Cx43蛋白表达的影响

目的:研究虎杖对大鼠肝癌细胞Cx43蛋白表达的影响。方法:用Western blot来检测虎杖对大鼠肝癌细胞Cx43表达的影响。结果:随着研究深入,发现虎杖抗肿瘤的功效表现为对肿瘤的起始、促进和进展三个阶段均有抑制作用。结论:虎杖能促进大鼠肝癌细胞Cx43蛋白的表达。     

过表达及定点突变缝隙连接蛋白Cx43小鼠黑色素瘤细胞模型的构建

目的 构建小鼠黑色素瘤细胞（B16）过表达野生型及点突变型缝隙连接蛋白43（Connexin43,Cx43）细胞模型,为以缝隙连接（Gap Junction,GJ）为靶点的中药复方、中药单药及药物单体的研究提供可靠阳性对照和阴性对照。方法 构建野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R重组荧光蛋白融合慢病毒表达质粒,用定点突变技术获得Cx43G21R和Cx43G138R突变体,对上述3种质粒进行双酶切和测序鉴定,并分别包装病毒感染B16细胞,使B16细胞过表达野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R。Western blot检测Cx43蛋白表达水平变化,荧光示踪法观察缝隙连接通讯（Gap Junction Intercellular Communication,GJIC）功能变化。结果 ①酶切及测序证明,成功构建pLVCx43-mCherry、pLVCx43-mCherryG21R、pLVCx43- mCherryG138R重组荧光蛋白融合慢病毒表达质粒。②成功感染B16细胞并筛选稳定过表达Cx43、Cx43G21R、Cx43G138R细胞株,Western blot检测显示上述细胞株Cx43蛋白表达均高于对照组。③过表达野生型Cx43后B16细胞GJIC功能较对照组增强;过表达突变型Cx43后B16细胞GJIC功能较对照组减弱。结论 过表达野生型Cx43可增强B16细胞GJIC功能,过表达突变型Cx43可抑制B16细胞GJIC功能。     

次乌头碱对乳大鼠原代培养心肌细胞Ca2+及Cx43表达的影响

目的 观察次乌头碱对原代培养的心肌细胞内Ca2+浓度及缝隙连接蛋白Cx43表达的影响.方法 体外培养乳大鼠心肌细胞,采用流式细胞技术观察30,60,120 μmol/L的次乌头碱在15,30,60 min对心肌细胞内Ca2+浓度变化的影响,并应用Western blot技术检测次乌头碱作用心肌细胞15 min后的细胞缝隙连接蛋白Cx43的表达水平.结果 次乌头碱能提高心肌细胞[ Ca2+]i,这种作用在给药后15 min时最显著,随着作用时间的延长,细胞[Ca2+]i下降;次乌头碱作用心肌细胞15 min能降低心肌细胞Cx43的表达量,但无显著性差异.结论 次乌头碱能促进心肌细胞内Ca2+增高,进而导致细胞Cx43表达降低,增加心肌细胞发生心律失常的易感性.     

基因治疗联合六味地黄丸对肝癌荷瘤小鼠缝隙连接蛋白表达的影响

目的:探讨六味地黄丸联合基因治疗对小鼠移植性肝癌缝隙连接蛋白(connexin,Cx)表达的影响,初步阐明六味地黄丸对肝癌HSV-tk/GCV自杀基因治疗的增效作用机制是否与缝隙连接相关。方法:昆明种小鼠90只,随机分为模型对照组、六味地黄丸治疗组(ig六味地黄丸10 g·kg-1·d-1)、自杀基因治疗组(ip丙氧鸟苷100 mg·kg-1·d-1)、联合治疗组(ig六味地黄丸10 g·kg-1.d-1+ip丙氧鸟苷100 mg·kg-1.d-1);选用H22与H22/tk细胞株皮下接种建立小鼠肝癌模型,取荷瘤小鼠肿瘤组织进行常规病理制片,采用SABC免疫组化法检测各组肿瘤组织Cx26,Cx32,Cx43蛋白表达。结果:阳性表达定位于细胞浆和细胞膜,Cx43在癌旁组织,特别是有纤维组织浸润部位表达呈强阳性,而在癌结节中肿瘤细胞表达相对较弱;Cx26,Cx32在肿瘤细胞特别是脂肪组织浸润附近的癌组织中呈现强阳性表达。与肿瘤模型组相比,联合治疗组则能增强Cx26,Cx43,Cx32蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05);与单独六味地黄丸和自杀基因治疗组相比,联合治疗组能明显提高Cx32蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论:六味地黄丸联合自杀基因治疗能增强Cx26,Cx43,Cx32蛋白表达,尤其是促进Cx32的表达,提示六味地黄丸增强自杀基因旁观者效应的机制与缝隙连接相关。     

补阳还五汤通过调节血管平滑肌细胞Cx43作用于动脉粥样硬化的研究

目的:研究补阳还五汤抗同型半胱氨酸(Hcy)诱导血管平滑肌细胞(HUVSMC)增殖的作用及其机制。方法:以14.9g/kg补阳还五汤剂量连续灌胃SD大鼠1周,提取补阳还五汤含药血清,并与胎牛血清(FBS)按一定比例,配置成20%(20%补阳)、10%(10%补阳+10%FBS)、5%(5%补阳+15%FBS)补阳还五汤含药血清组组。血管平滑肌细胞长满培养瓶或培养板后,用同型半胱氨酸分组造模,将细胞随机分为10组:空白组、模型组、乙酰半胱氨酸(NAC)组、20%、10%、5%补阳还五汤含药血清组、NF-kB阻断剂PDTC组、MAPK阻断剂SB20组、ERK阻断剂PD98组、PKC阻断剂Stau组。蛋白质印迹法(Western blot)测定血管平滑肌细胞Cx43蛋白的表达量;RT-PCR技术检测各组血管平滑肌细胞Cx43 mRNA水平;建立血管内皮-平滑肌细胞共培养体系,Western blot分别检测内皮细胞和平滑肌细胞内Cx43的表达;电镜检测血管内皮-平滑肌细胞共培养体系细胞缝隙连接的变化。结果:Western blot实验中,平滑肌细胞与共培养体系中的内皮细胞、平滑肌细胞的Cx43蛋白表达水平,模型组与空白组比较,模型组中Cx43蛋白表达量均显著升高;乙酰半胱氨酸组,20%、10%、5%补阳还五汤含药血清组与模型组比较,Cx43蛋白表达显著下调。RT-PCR实验中,模型组与空白组比较,模型组中Cx43mRNA表达量显著升高;乙酰半胱氨酸组、20%、10%、5%补阳还五汤含药血清组与模型组比较,Cx43mRNA表达量显著降低。电镜检测细胞缝隙连接实验中:模型组与空白组比较,内皮-平滑肌细胞之间形成的缝隙连接遭到破坏,而20%补阳还五汤含药血清组却能形成与正常组相似的连接。结论:补阳还五汤可能通过下调Cx43蛋白以及其mRNA的表达,改善细胞之间的缝隙连接,减少血管平滑肌细胞增殖而发挥抗动脉粥样硬化的作用。     

南蛇藤对人肝癌HepG2细胞侵袭能力的影响

目的:研究南蛇藤乙酸乙酯提取物(Celastrus orbiculatus extracts,COE)对人肝癌HepG2细胞侵袭能力的影响。方法:不同浓度COE(20、40、80、160、320μg/ml)处理人肝癌HepG2细胞24 h后,用MTT法检测细胞毒作用;Transwell小室法检测细胞的侵袭能力;Western blot法检测人肝癌HepG2细胞蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又名Akt)、磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)、NF-κBp65、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases2,MMP-2)、MMP-9蛋白的表达水平。结果:COE(20、40、80、160、320μg/ml)能显著抑制人肝癌HepG2细胞的增殖能力,呈明显的剂量依赖性;COE(20、40、80μg/ml)能降低人肝癌HepG2细胞的穿膜细胞数;COE(20、40、80、160μg/ml)下调人肝癌HepG2细胞中p-Akt、NF-κBp65、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平。结论:COE能抑制人肝癌HepG2细胞侵袭能力,其机制可能与下调p-AKT、NF-κBp65、MMP-2和MMP-9蛋白的表达有关。     

人参总皂苷增强小鼠黑色素瘤B16细胞缝隙连接功能的实验研究

目的探讨人参总皂苷(total ginsenosides,TGs)对小鼠黑色素瘤B16细胞缝隙连接(Gap junction,GJ)功能的影响及其作用机制。方法 MTT法测TGs对B16细胞生长的影响,荧光显微镜结合荧光示踪法分析GJ功能变化,以各试验组受体细胞均数与对照组的比值作为评价GJ功能的指标,流式细胞仪检测对照组和实验组的绿色荧光供体细胞(G4)与双阴性受体细胞(G3)比值(G4/G3)变化分析GJ功能改变,Western blot分析连接蛋白(Connexin,Cx)表达。结果 1~8μmol·L-1TGs处理B16细胞48 h对其生长状态无明显影响;用1,2,4,8μmol·L-1TGs处理细胞48 h后,荧光显微镜下观察,TGs能明显提高B16细胞荧光染料Calcein传递,对照组和实验组G4/G3比值分别是0.06±0.01,0.09±0.02,0.10±0.01,0.12±0.03和0.13±0.02,各实验组G4/G3值明显高于对照组(P0.01);Western blot分析结果显示,用1,2,4,8μmol·L-1TGs处理B16细胞48h对其连接蛋白Cx32表达有明显的增强作用,但对Cx43和Cx26表达无影响。结论体外较低浓度TGs能够有效促进B16细胞GJ功能,并具有一定的剂量-效应关系。1~8μmol·L-1TGs虽能显著促进B16细胞Cx32蛋白的表达,但在本试验浓度范围内并无明显的量效关系,且对Cx43和Cx26表达无明显影响。     

松果菊苷对人肝癌细胞HepG2生长和缝隙连接细胞通讯的影响

目的观察松果菊苷(ECH)对人肝癌细胞Hep G2生长和缝隙连接细胞通讯(GJIC)的影响。方法 Alamar Blue法绘制Hep G2细胞生长曲线,并检测ECH的细胞毒作用;划痕标记染料示踪技术(SL/DT)法观察空白对照组、API阳性对照组、AGA阴性对照组和ECH组对GJIC的影响;异硫氰酸荧光素(FITC)间接免疫荧光法观察ECH对缝隙连接蛋白Cx43表达的影响。结果 Hep G2细胞在20 000个/m L的细胞密度Alamar Blue还原率与时间有线性关系。ECH(5、10、20、40和80μM)处理Hep G2细胞24 h,细胞存活率分别为(92.69±3.35)%、(88.33±2.12)%、(80.97±2.50)%、(76.95±1.40)%和(69.09±1.11)%(P0.01)。抑制率最高(80μM浓度下)为30.91%。IC50为467.8μM(368.3μg/m L)。SL/DT显示阳性对照芹黄素和ECH处理24 h后,荧光染料在划痕外4列细胞出现了明显荧光(++++),说明细胞出现染料传输的现象。间接免疫荧光法对Cx43表达进行计分,空白对照组细胞得分为(1.40±0.55)分,ECH组得分为(1.60±0.55)分。结果表明ECH组的Cx43表达增强不明显。结论 ECH对Hep G2细胞有细胞毒作用,同时可增强GJIC功能,但Cx43表达不明显,为ECH抗肿瘤机制提供依据。     

黄连解毒汤有效部位对脑缺血半暗带区星形胶质细胞活化及Cx43表达的影响

目的 观察黄连解毒汤水提物及其有效部位（总生物碱、总黄酮、总环烯醚萜）对局灶性脑缺血半暗带区星形胶质细胞活化及缝隙连接蛋白43（connexin 43,Cx43）表达的影响。方法 线栓法建立大鼠永久性大脑中动脉栓塞模型,雄性SD大鼠随机分成假手术组、模型组、黄连解毒汤水提物组（800 mg/kg）、总生物碱组（44 mg/kg）、总黄酮组（50 mg/kg）、总环烯醚萜组（80 mg/kg）,连续ig给药7 d,每天给药1次。HE染色观察脑组织病理学改变;胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫荧光染色观察星形胶质细胞活化;GFAP/Cx43免疫荧光双标染色检测Cx43表达;实时RT-PCR检测Cx43基因表达。结果 模型组大鼠缺血半暗带区神经元数目减少,GFAP、Cx43基因及蛋白表达上调（P<0.01）。黄连解毒汤水提物及其3个有效部位（总生物碱、总黄酮、总环烯醚萜）均可增加脑缺血大鼠缺血半暗带区神经元数目（P<0.05、0.01）;降低缺血半暗带区GFAP及Cx43基因、蛋白表达（P<0.05、0.01）。结论 黄连解毒汤水提物及其有效部位（总生物碱、总黄酮、总环烯醚萜）通过抑制星形胶质细胞过度活化,干预Cx43表达,保护缺血半暗带区神经细胞。     

针刺对Cx43基因敲除小鼠痛经反应的影响

目的:观察针刺对缝隙连接蛋白43(Cx43)基因敲除小鼠痛经反应的影响,探讨Cx43与针刺效应的关系。方法:选取杂合子[Cx43(+/-)]及野生型[Cx43(+/+)]2月龄雌鼠各20只,随机分为正常组、模型组、针刺组及益母草膏组,每组5只。其中模型组、针刺组及益母草膏组用己烯雌酚灌胃(2mg/g,容积0.2ml/10g),每日1次,连续12d,于末次给药1h后,腹腔注射催产素2U/kg;正常组以等量生理盐水灌胃,每日1次,连续12d。针刺组于造模第7天针刺双侧"三阴交"地机"穴,每日1次,连续5d;益母草膏组于第7天予以益母草膏0.6mg/g灌胃,连续5d。于造模第12天注射催产素后观察各组小鼠扭体潜伏期和30min内扭体数,随后剖腹取子宫组织,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定催产素受体(Oct-R)和血管加压素受体(Vas-R)的mRNA表达水平,免疫组化法检测Oct-R蛋白的表达水平。结果:针刺能够延长Cx43(+/+)痛经模型小鼠的扭体潜伏期,减少其扭体次数,并能降低子宫组织中Oct-R、Vas-RmRNA及Oct-R蛋白的表达水平(均P<0.05),但对Cx43(+/-)痛经模型小鼠上述指标的表达无显著性影响(P>0.05)。结论:针刺对野生型小鼠痛经反应有治疗作用,敲除Cx43基因后,针刺的治疗作用显著降低,表明Cx43可能参与针刺治疗效果的产生。     

房颤大鼠心肌细胞缝隙连接蛋白Cx43磷酸化水平改变及青蒿提取物的干预作用

目的：通过建立房颤大鼠模型,研究房颤状态下Cx43磷酸化水平对房颤发生的影响以及中药青蒿提取物对Total-Cx43、NP-Cx43表达与分布的影响。方法：建立房颤大鼠模型,使用青蒿提取物进行干预,以卡托普利作为对照组。实验当日处死动物后Western-blot法检测Cx43表达及磷酸化水平。激光共聚焦显微镜检测Total-Cx43、NP-Cx43分布情况。结果：Total-Cx43的表达中对照组的表达量最高,模型组表达量最低,较对照组下降了（57.2±12.5）%（P〈0.05）,青蒿组与卡托普利组相比,表达量没有统计学差异（P〉0.05）。NP-Cx43的表达中对照组的表达量最高,模型组表达量最低,模型组、青蒿组、卡托普利组之间没有统计学差异（P〉0.05）。结论：房颤的发生与Total-Cx43表达减少以及重新分布有密切关系。青蒿提取物以及卡托普利对房颤的改善作用机制之一是通过改变Total-Cx43的表达与分布实现的。在房颤的发生过程中,Total-Cx43的表达与分布发生改变,NP-Cx43的表达与分布无异常,说明P-Cx43是诱发房颤的重要因素。     

Effects of Gingko biloba extract on gap junction changes induced by reperfusion/reoxygenation after ischemia/hypoxia in rat brain

Gap junction communication between astrocytes plays an important role in the brain. The purpose of this study was to investigate the effects of Gingko biloba extract (GBE) on the changes of connexin 43 (Cx43) mRNA and protein expression levels of rat cortex and hippocampus induced by ischemia-reperfusion and astrocyte gap junction intercellular communication (GJIC) induced by hypoxia-reoxygenation. After 2 hours of middle cerebral artery occlusion (MCAO) followed by 24 hours of reperfusion, there was obvious neurological deficit in rats. Cx43 mRNA and protein expression levels of rat cortex and hippocampus in the ischemia hemisphere were decreased significantly. When GBE at doses of 50 and 100 mg/kg body weight was administrated by p.o. daily for 7 days, the neurological deficit was improved, and lower Cx43 mRNA and protein expression levels induced by ischemia-reperfusion were recovered to normal. The i.p. injection of nimodipine (0.7 mg/kg weight body) also showed improvement on neurological deficit and Cx43 expression levels. Astrocyte GJIC was measured by the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). Hypoxia-reoxygenation induced a significant decrease in GJIC. Pretreatment with GBE (100 mg/l) and nimodipine (1.6 mg/l) significantly prevented the hypoxia-reoxygenation inhibition of GJIC. These results suggest that GBE could exert its neuroprotective effects by improvement of Cx43 expression and GJIC induced by hypoxia/ischemia-reoxygenation/ reperfusion injury.     

牛蒡子萌发特性研究

目的：研究菊科植物牛蒡（Arctium lappa L.）种子萌发习性,确定牛蒡子萌发的最适条件,为牛蒡栽培提供一定参考依据。方法：采用室内实验观察方法。结果：牛蒡子发芽适宜的条件为：25℃,光照,用400 mg/L赤霉素浸种24小时,发芽率可达88.67%,适合弱酸性环境,且有一定的耐碱性。结论：本实验为研究牛蒡的萌发习性做了初步的研究,可作为其GAP栽培参考依据。     

芪术抗癌方对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨芪术抗癌方对肝癌HepG2细胞增殖与凋亡的调控作用。方法：体外培养HepG2细胞，加入不同浓度芪术抗癌方（0,250,500,1 000 mg/L）处理48 h。采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）检测细胞活力，采用免疫印记法检测凋亡相关蛋白c-Caspase-3和c-Caspase-9表达变化。结果：CCK-8结果显示芪术抗癌方可呈浓度依赖性抑制HepG2细胞增殖，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05),1 000 mg/L组抑制效果最好，芪术抗癌方刺激HepG2细胞后，凋亡相关蛋白c-Caspase3及c-Caspase9表达增加，呈浓度依赖性，在1 000 mg/L组达到最高且差异有统计学意义（c-Caspase3增加1.83倍，P<0.05；c-Caspase9增加1.06倍，P<0.05）。结论：芪术抗癌方可抑制肝癌HepG2细胞增殖并诱导细胞凋亡。     

荧光双重标记Cx43在大鼠“足三里”表达的实验研究

目的:研究缝隙连接蛋白Cx43在大鼠“足三里”穴的表达及其与穴位、经络的可能关系。方法:20只健康成年SD大鼠随机分为非针刺组、针刺组,每组10只。应用荧光双重标记免疫组织化学方法和激光扫描共聚焦显微镜技术对成年大鼠皮肤肌肉组织的Cx43进行定位、定量分析。结果:皮肤肌肉组织中Cx43主要在表皮上皮细胞、皮下筋膜的肥大细胞中表达;非针刺组中穴位处Cx43的表达显著高于非经非穴处,两者相比有极显著性差异(P<0.01);穴位针刺后Cx43表达显著增加,与非针刺组中穴位比较有极显著性差异(P<0.01)。结论:电针可使“足三里”穴区皮肤及肌肉组织中的Cx43表达明显增加,缝隙连接蛋白及缝隙连接可能在经络活动中起重要作用。