应用焦磷酸微测序技术行HLA-DRB基因型分析

目的应用焦磷酸微测序技术进行HLA-DRB基因型分析.方法PCR扩增外显子2基因片段,经链亲和素包被磁珠纯化、制备单链DNA测序模板,应用焦磷酸微测序技术进行实时测序和HLA-DRB基因分型.结果焦磷酸微测序技术-次可判读40～80个碱基,采用3-4个微测序可以判读全部扩增区域的多态性位点,测序结果与HLA数据库基因序列比较,可准确进行HLA-DRB基因型分析.结论焦磷酸微测序技术应用于HLA-DRB基因型分析具有高分辨率、高通量和快速等优点,该方法可应用于器官及骨髓移植的供体/受体筛查.     

应用单管PCR扩增测序分型法分析成都汉族HLA-DRB1基因多态性

目的应用DNA分型技术分析成都汉族个体HLA-DRB1等位基因分布频率,为进一步研究HLA-DRB1与疾病的关联提供背景资料.方法设计合成引物,建立HLA-DRB1单管PCR扩增测序分型法,对90名无血缘关系的健康个体进行HLA-DRB1基因分型.结果共检出39种HLA-DRB1等位基因,基因频率较高的有HLA-DRB10901（ 26.11% ）,1202（7.22%）,同时检测出HLA-DRB1AHAW、HLA-DRB1DRw12、HLA-DRB1w13b等少见等位基因.统计分析表明该群体HLA-DRB1位点的基因型分布符合Hardy Weinburg平衡（χ^2＝806.46, df ＝780, P ＞0.05）.结论证实了单管PCR扩增测序分型法用于HLA-DRB1基因分型的可靠性和适用性,并提供了成都汉族群体的基因分布频率资料.     

快速、高通量MTHFR基因C677T多态性检测方法的建立

目的:建立亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因C677T多态性的快速检测方法.方法:提取健康人外周血基因组DNA,采用PCR扩增含677位点的MTHFR基因片段.对PCR产物中残余的dNTPs和游离单链引物消化处理后进行TDI反应,测定荧光偏振值并分析C677T基因型.同时采用PCR-RFLP方法分析C677T基因型进行比较.结果:100例标本中,TDI-FP分析MTHFR C677T基因型:C/C 40例、T/T 14例、C/T 46例;PCR-RFLP分析MTHFR C677T基因型:C/C 40例、T/T 12例、C/T 48例;其中两种方法检测结果不一致的两例标本经焦磷酸微测序证实为T/T纯合子.结论:建立了一种新的基于TDI-FP的MTHFR C677T基因分型方法,该方法较RFLP方法更为准确,且快速、简便、通量高,适用于临床大批量标本的筛查.     

利用线性指数PCR-焦磷酸测序技术快速检测3种海洋弧菌

目的： 建立一种基于线性指数聚合酶链式反应(linear-after-the-exponential PCR,LATE-PCR)焦磷酸测序技术快速检测致病性海洋弧菌的方法。方法： 首先根据海洋弧菌的16S rRNA基因和外膜蛋白K(OmpK)基因的目的片段设计引物并优化反应条件进行LATE-PCR扩增,其次利用酶促反应处理PCR产物中干扰焦磷酸测序反应的副产物,最后加入退火引物后直接进行焦磷酸测序。结果： 成功进行了LATE-PCR扩增,制备出足量单链DNA模板供焦磷酸测序反应;取1~2 μL的PCR产物即可获得理想的焦磷酸测序信号。测序结果与Sanger法的结果一致,测得序列与GenBank所报道的相符合。通过对16S rRNA基因片段的检测,可以确认样品是否为海洋弧菌;通过对OmpK基因目的片段的检测可以初步区分弧菌种类,对3种常见弧菌：副溶血弧菌、哈维弧菌和溶藻弧菌成功地进行了检测。结论： 本方法结果准确,灵敏度高,操作简便且成本低,可快速检测大量样品,在弧菌快速检测和诊断中具有很好的应用前景。     

焦磷酸测序技术快速测定肾移植受体人群CYP3A5*3基因多态性方法的建立

目的 建立基于焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)肾移植受体CYP3A5*3基因多态性的简单、快速、准确、高通量的检测方法.方法 提取221例肾移植受体和200例健康人外周血基因组DNA,应用PyroMark ID焦磷酸测序仪进行焦磷酸测序,采用Sanger法DNA测序作为标准对照,观察分析焦磷酸测序法的可靠性,并分析肾移植受体人群CYP3A5*3多态性的分布.结果 建立了基于焦磷酸测序技术的CYP3AS*3基因多态性检测新方法,实现了DNA标本的快速、可靠、高通量检测,经重复性检测和Sanger标准法DNA测序可靠性检测,用焦磷酸测序技术检测CYP3A5*3多态性的突变检出率及重复率均达100%.221例肾移植受体CYP3AS*3基因型分布:*1/*1型为23例(10.4%),*1/*3型为89例(40.3%),*3/*3型为109例(49.3%),与正常人群比较等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡.结论 与传统的测序方法相比,焦磷酸测序法能够简单、快速、准确地测定肾移植受体CYP3A5*3基因型,适合临床推广应用.     

单管扩增测序分型技术用于人类白细胞抗原-DRB1基因分型的研究

目的:用单管PCR扩增方法建立高效的人类白细胞抗原(HLA)-DRB1基因测序分型技术并探讨其应用价值.方法:合成7个5'端特异性扩增引物和一个3'端共用引物,将上述引物混合在一起组成单个PCR反应用于120个临床样本的HLA-DRB1的DNA测序分型.结果:本组样本都能成功分型,且结果准确,重复性好.结论:本法改进了测序分型技术,具有高分辨率、高特异性和高效率的特点,值得推广应用.     

巢式PCR联合焦磷酸测序法在乙型肝炎病毒耐药基因检测中的敏感性与特异性分析

目的评价巢式PCR联合焦磷酸测序法在乙型肝炎病毒(HBV)耐药基因检测中的敏感与特异性。方法选取rtM204I(ATT)突变型和rtM204(ATG)未突变型质粒,按照不同比例混合后,采用巢式PCR联合焦磷酸测序法对突变位点进行检测,并与常规PCR焦磷酸测序法进行比较,对两种方法的线性及一致性进行分析;选取不同病毒载量临床标本,采用巢式PCR焦磷酸测序法检测耐药突变位点,并与巢式PCR Sanger测序法进行比较,对两种方法的敏感性及特异性进行分析。结果常规PCR焦磷酸测序和巢式PCR焦磷酸测序结果拟合曲线R2>0.99,P<0.05,线性模型有显著性意义。分别将常规PCR焦磷酸测序和巢式PCR焦磷酸测序结果与预测值的差值进行分析,巢式PCR能够较常规PCR更好的反映实际值,在90%比例处优于常规PCR。临床75例患者标本巢式PCR Sanger测序与巢式PCR联合焦磷酸测序结果灵敏性比较提示,Sanger测序的灵敏性为92%,巢式PCR联合焦磷酸测序的灵敏性达到100%,差异有统计学意义(P<0.01)。对于不同病毒拷贝数标本的灵敏性不同,其差异主要表现在低浓度组(HBV DNA≤3log10 copies/ml),Sanger测序的灵敏性为78%,而焦磷酸测序的灵敏性可以达到100%,差异有统计学意义(P<0.01)。阴性对照,两种方法均未检出HBV病毒,两种方法的特异性均较好。结论巢式PCR联合焦磷酸测序的方法监测乙肝病毒变异同巢式PCR联合sanger测序相比,有更好的灵敏性,尤其是在低病毒拷贝数时,差异明显,这对于临床提早发现耐药突变株,指导临床及时更换用药有重要意义。     

焦磷酸测序法鉴定临床常见病原菌

目的 建立高效的焦磷酸测序鉴定临床常见病原菌的方法.方法 在细菌16S rRNA的V1及V3可变区两端保守序列设计PCR扩增通用引物及焦磷酸测序引物,PCR扩增后焦磷酸测序测定V1及V3可变区序列,测序结果与数据库比对判断细菌种属.结果 在4 h内完成96株细菌的鉴定,所有菌株鉴定结果与常规鉴定结果一致.结论 焦磷酸测序技术可以用于临床分离菌株的鉴定,且具有费用相对低廉、高通量、鉴定能力强等优点.     

连接酶链反应结合荧光PCR法检测UGT1A1*28基因多态性

目的: 建立一种连接酶链反应结合荧光PCR的方法,检测结肠癌患者外周血UGT1A1*28基因多态性,并探讨其临床应用价值。方法: 设计连接酶荧光PCR引物和探针,首先通过连接酶反应,然后结合荧光PCR技术检测UGT1A1*28基因多态性,构建标准品评判该体系的特异性和敏感性,并检测50例结肠癌患者外周血标本,与DNA测序进行平行比较。结果： 此方法能准确地区分UGT1A1*28基因TA6/6、TA7/7及TA6/7基因型,且最低可检测5 ng人基因组DNA, 50例结肠癌患者外周血标本的检测结果与测序结果一致。 结论： 连接酶链反应结合荧光PCR可准确检测出UGT1A1*28基因多态性。     

乙型肝炎病毒耐药变异与基因型检测在临床上的应用

目的 建立直接测序法检测HBV P区耐药变异情况并分析基因型.探讨HBV基因型与临床病情的关系.方法 检测46例乙肝患者血清样本,采用特异的引物对待检标本HBV P区进行PCR扩增后作基因序列检测,利用Chromas2.23软件对测序结果 进行分析有无突变产生,测序结果 用软件clustalx1.81进行基因分型分析.结果 可通过一次测序反应完成对HBV.DNA P区的基因检测及基因型分析.检出YMDD变异株8例,其中YIDD 5例,YVDD 3例.在检测的46例标本中23例为B基因型,阳性率为50.0%;有21例为C基因型,其阳性率45.6;D基因型2例,阳性率4.4%.B基因型HBV感染者中HCC 2例,占8.7%;C基因型HBV感染者中HCC 8例,占38.1%.结论 直接测序法分析HBV常见耐药突变位点及基因型准确可行,B基因型乙肝患者预后优于C基因型患者.     

中国湖北汉族人群HLA-DRB1基因多态性研究

目的:调查湖北汉族人群人类白细胞抗原(HLA)-DRB1基因多态性,获得完整准确的遗传学数据。方法:应用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)方法对213名随机选取无亲缘关系的湖北籍汉族健康体检者或健康献血员进行HLA-PDRB1基因型检测。结果:在213名正常个体中,发现基因频率(GF)较高的有DRB1*1501-1502(GF=11.0%)、*1101-1105(GF=8.5%)、*0901(GF=6.8%)、*1301-1302(GF=6.6%)、DRB4*0101(GF=19.0%)、DRB5*0101(GF=16.9%),低频率等位基因是DRB1*04、*1001和*0101-0103。结论:从基因水平分析了HLA-DRB1基因在湖北汉族群体中的分布特征,提供了一套比较完整准确的DRB1基因频率,为人类学和疾病相关性等研究提供了重要的参考数据。     

内蒙古鄂温克族人群HLA-DRB1基因多态性与族源分析

目的：对内蒙古鄂温克族人群人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）Ⅱ类基因DRB1位点进行基因型检测.方法：采用DNA序列测定的分型技术（sequencing based typing,SBT）,对94名鄂温克族个体进行分析.结果：DRB1等位基因中,共检出25种等位基因,内蒙古鄂温克族以DRB^1＊090102 （16.0%）的频率最高,其次为DRB1^＊030101 （13.3%）、 DRB1^＊040101（10.1%）、DRB1^＊070101 （7.4%）、DRB1^＊120101/1206（7.4%）;系统树上鄂温克族与同样是北方人群的北方汉族、沈阳汉族和蒙古族聚在一起.结论：鄂温克族人群中HLA-DRB1分布特征有其独特性,鄂温克族基因频率和系统树显示鄂温克族属于中国北方人群.     

内蒙古地区蒙、汉族人HLA-DRB1基因多态性研究

目的 :了解内蒙古地区蒙、汉族人 HLA-DRB1的基因多态性。方法 :采用聚合酶链反应 -序列特异性引物 (PCR-SSP)技术对内蒙古地区 1 0 2例健康蒙古族标本和 1 0 8例健康汉族标本进行 HLA-DRB1等位基因型别分析。结果 :蒙古族中等位基因频率较高的分别是 :DRB1 * 1 2 0 x(genefrequency,GF=1 8.3 5 % ) ,* 0 40 x(GF=1 4.82 % ) ,* 1 5 0 x(GF=1 0 .84% )。汉族中 HLA-DRB1等位基因频率较高的分别是 :DRB1 * 0 90 1 (GF=1 6.67% ) ,* 1 5 0 x (GF=1 5 .0 3 % ) ,* 0 40 x (GF=1 1 .81 % )。其中 :DRB1 * 0 90 1、* 1 2 0 x位点的基因频率差异有显著性意义。结论 :内蒙古地区蒙古族和汉族具有不同的 HLA-DRB1等位基因分布频率。     

西藏珞巴族HLA-DRB1基因多态性

目的：检测西藏珞巴族HLA-DRB1等位基因及基因型频率，并将其与18个人群的HLA-DRB1频率进行比较，绘制系统发生树。方法：应用聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSO)技术，对我国西藏南部林芝地区3代内无血缘关系的92个珞巴族健康个体进行了HLA-DRB1位点的基因分型。采用不加权配对组算术方法（UPGMA）绘制系统发生树。结果：在92例珞巴族个体的184个等位基因中共检出11种HLA-DRB1等位基因，其中HLA-DRB1*04(27.20%)，DRB*12(25.50%)在珞巴族中最常见，共占珞巴族可检出等位基因的52.70％；其他频率大于5％的等位基因还有DRB1*14(15.20%)，DRB1*15(9.80%)和DRB1*08(8.20%)。结论：西藏珞巴族HLA-DRB1等位基因分布与其他华人群体均存在很大的差异，显示其HLA等位基因频率分布的民族独特性；在遗传距离上珞巴族和藏族最近，这与民族学、历史学和社会学研究结果相一致。     

HLA-DRB1 genes in 5 rheumatic disease multi-case families

OBJECTIVE: To detect HLA-DRB1 (DR1-10) alleles in 5 families with multi-case rheumatic diseases, and to study the possible influence of DRB1 genes in the pathogenesis of rheumatic diseases. METHODS: Sequence-Specific Primer PCR (PCR-SSP) method was used to examine HLA-DRB1 alleles. Totally 36 members of 5 families and 166 healthy people were involved in this study. The results were assessed by Chi-square test. RESULTS: The HLA-DRB1 allele frequency in the patients and their relatives was similar. No significant difference was found. But DR4 allele frequency in the patients (90.9%) and their relatives (68%) was much higher than that in normal controls (16.8%) and the difference was statistically significant (P < 0.0001). In family 4, two RA patients have different DRB1 alleles, while in family 5, two patients have the same DRB1 alleles, one developed SLE and the other developed RA. CONCLUSIONS: DR4 is closely related to rheumatoid arthritis. The nelatives of RA patients may be at greater risk to develop RA than individuals without family history. Some patients had the same DRB1 allele but developed different rheumatic diseases. This suggested that there might be some common pathways in genetic predisposing of rheumatic diseases. On the other hand, only a few patients with the same DRB1 allele developed rheumatic diseases during their life, so other factors besides DRB1 gene might also be involved in the pathogenesis of rheumatic diseases.     

人类白细胞抗原DRB1及DPB1等位基因多态性与南方部分地区汉族人多发性硬化的相关性研究

目的探讨人类白细胞抗原（HLA）-DRB1、HLA-DPB1基因多态性与我国南方汉族人群多发性硬化（MS）的相关性。方法采用基于测序的分型方法（SBT）对26例南方汉人普通型MS（C-MS）、13例视神经-脊髓型MS（OS-MS）患者及50名正常对照进行HLA-DRB1、HLA-DPB1等位基因分型,并比较各型MS之间及其与对照组之间等位基因型频率的差异。结果共检测到27种HLA-DRBI和13种HLA-DPB1等位基因片段,其中DRB1^＊0406和DRB1^＊1302的基因型频率在OS-MS患者中均高于正常人群（P值分别为0．014和0、007,OR值为2．09和2．84）;DRB1^＊120201频率在C-MS患者中高于正常人群（P=0．021,OR=3．89）和OS-MS患者（P=0．07,OR=6．87）;HLA-DPB1^＊2101频率在OS-MS患者组高于正常人群（P=0．04）。然而,以上差异经校正后均无统计学意义（均Pc〉0．1）。HLA-DRB1^＊150l和DPB1^＊0501的基因型频率在本组C-MS、OS-MS患者之间及其与正常对照之间差异均无统计学意义（均P〉0．1）。结论我国南方汉族人群MS与HLA-DRB1和-DPB1基因多态的相关性与西方、日本及我国北方人群者不同。南方汉人MS可能与HLA-DRB1^＊0406、DRB1^＊1302、DRB1^＊120201及HLA-DPB1^＊2101有关,而与HLA-DRB1^＊1501和DPB1^＊0501无关。     

人白细胞抗原—DRB1等位基因与中国西部泡状棘球蚴病易感性？…

目的 了解人白细胞抗原（ＨＬＡ）＝ＤＲＢ１等位基因与泡球蚴病相关性,阐明泡球蚴病的免疫学发病机制,探寻 球蚴病的易感基因或抗病基因提供线索。方法 应用ＰＣＲ／ＳＳＲ技术,对中国西部甘肃省漳县、岷县泡球蚴病高流行区４个 的３５例口才１０４例正常人九进行了ＨＬＡ－ＤＲＢ１基因型分析。结果 且ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０Ｘ基因频率为２６％（１８／７０）,正常对照组籽１０％（２０／２０８）（ＲＲ＝４．４５,Ｘ     

用PCR-SSP方法研究重庆地区人群HLA-DRB1基因多态性

目的了解重庆地区人群HLA-DRB1基因多态性,分析人群HLA-DRB1基因频率分布特征.方法采用PCR-SSP方法对来自中国造血干细胞捐献者资料库重庆分库的3 219名无血缘关系的捐献者进行基因分型,计算HLA-DRB1基因频率,并与南方汉族、北方汉族人群进行比较.结果在重庆地区人群中检出了HLA-DRB1基因型14种(低分辨率),其中以DRB1·09,DRB1·15,DRB1·12,DRB1·04出现频率高.结论重庆地区人群的HLA-DRB1基因多态性与南方汉族接近,并有其特点.     

2型糖尿病大血管病变患者人类白细胞抗原-DRB1*04等位基因多态性分析

目的分析2型糖尿病(DM)及其大血管病变患者人类白细胞抗原(HLA)-DRB1*04亚型的遗传多态性,探索糖尿病大血管病变的发病机制。方法应用聚合酶链反应-序列特异性引物(polymerasechainreaction-sequencespecificprimer,PCR-SSP)技术对合并/未合并大血管病变的北方汉族2型DM患者的HLA-DRB1*04亚型等位基因进行检测。结果东北地区汉族2型DM患者中共检出9种HLA-DRB1*04亚型。2型DM伴大血管病变组DRB1*0404等位基因频率较2型DM无并发症组显著增高;但DRB1*0403等位基因频率较无并发症组显著减少。结论1型DM与2型DM可能具有相似的HLA遗传背景。DRB1*0404单倍型可能是2型DM患者发生大血管病变的易患基因,DRB1*0403单倍型可能是2型DM患者发生大血管病变的保护性基因。HLA-DRB1*0404等位基因是患免疫相关性疾病患者发生血管内皮功能失调,尤其是大血管病变的预测因子。