实时荧光定量PCR检测O139群霍乱弧菌研究

目的：利用荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异检测O139群霍乱弧菌的定量方法。方法：选取O139群霍乱弧菌糖基转移酶基因（LPSgt）作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan探针,探针的两端均进行荧光标记。对PCR扩增体系进行优化,进一步评价实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性后,对收集的临床样本进行鉴定。结果：本文所建立的实时荧光定量PCR方法可准确、特异的检测和鉴定O139群霍乱弧菌,其他菌株均无阳性结果产生;该方法的灵敏度可达到10 cfu/ml;定量检测的批间和批内的变异系数均小于5%;对85例临床样本进行评价,结果获得9例O139群霍乱弧菌阳性,与常规培养法结果完全一致。结论：本文建立的检测O139群霍乱弧菌实时荧光定量PCR方法快速、准确,结果可靠,实用性强,可对结果进行定量分析,为O139群霍乱弧菌的实验室诊断和现场流行病学调查提供了较好的分析手段。     

呼吸道病原体多重实时荧光定量PCR的检测

目的 建立多重实时荧光定量PCR检测方法,为实现对呼吸道病原体的快速、灵敏特异性检测.方法 采用经报道的引物和探针对合胞病毒、腺病毒等8种呼吸道病原体进行多重实时荧光定量PCR检测.结果 多重荧光定量PCR阳性检测率高达57.8%,无假阳性及假阴性,特异性强.结论 多重实时荧光定量PCR具有经济、快速、特异性强等优点,在呼吸道病原体检测方面有巨大应用价值.     

霍乱弧菌多重PCR检测方法的建立和运用

[目的]建立一种快速检测霍乱弧菌O1群、O139群、非O1非O139群及是否产毒株的方法。[方法]以霍乱弧菌的外膜蛋白基因（ompW）、编码O1群O抗原基因（O1rfb）和编码O139群O抗原基因（O139 rfb）、霍乱肠毒素A亚单位基因（ctxA）为目的基因,建立一种多重PCR方法对霍乱弧菌进行检测和分型。[结果]根据相关基因携带情况分为6种型别,并分产毒株和非产毒株。以该法对140株霍乱弧菌分型结果与血清学诊断结果相一致,而其它弧菌和肠杆菌等均未检出相关基因。[结论]该方法快速、特异,可应用于霍乱弧菌的检测和分型。     

霍乱弧菌多重PCR检测方法的建立及优化

[目的]建立一种快速检测样品中霍乱弧菌的多重PCR方法,优化霍乱弧菌多重PCR的反应体系和循环参数.[方法]根据霍乱毒素ctxA、toxR、O139群特异性基因、O1群特异性基因序列,设计特异性引物,对引物浓度、PCR缓冲液的浓度、Mg2+浓度、退火温度及其延伸时闻等条件进行优化.[结果]4对引物在不同血清型霍乱弧菌DNA模板中能特异扩增出不同的条带.在同一反应体系中,较低的延伸温度可以提高霍乱弧菌多重PCR检测的灵敏度.[结论]通过对霍乱毒素多重PCR反应体系不同因素的优化,建立了稳定可靠的霍乱弧菌多重PCR检测平台.     

多重荧光定量PCR测定登革热Ⅰ～Ⅳ型方法的建立

目的建立能同时检测登革热4种血清型的一步法多重荧光定量PCR检测方法,用于登革热病毒分型的早期实验室诊断。方法针对病毒Ⅰ~Ⅳ型使用优化的引物探针,调整反应温度和条件,稀释阳性样本,进行特异性、灵敏度、重复性检测,评估该反应体系的性能。结果 16份样本中,6份经抗体确证的登革热阳性样本使用自建方法检测全为阳性,且1型3份,2、3、4型各1份,均与预期结果一致。流感、乙脑、诺如阳性样本以及健康人血清检测未见特异性扩增曲线,特异性高。登革热病毒2、3、4型最低检测限为10~2 copies/ml。1型最低检测限为10~3 copies/ml。不同型别各浓度梯度检测变异系数小于10%。结论本实验设计的登革热单管多重荧光定量PCR检测体系特异性、灵敏度、重复性都较好。     

多重荧光定量PCR同时检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌的方法研究

目的:利用多重荧光定量PCR技术检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌。方法:以溶藻弧菌等17种相关试验菌株做特异性检测;并将标准菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测。结果:与传统的检测方法相比,该方法有很好的特异性且灵敏度高,检测时间短并可节省人力,具有快速方便等优点。结论:适用于样品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌的快速检测。检测限分别为:霍乱弧菌为280 cfu/ml;副溶血性弧菌为:100 cfu/ml;创伤弧菌为:450 cfu/ml。     

伯氏疏螺旋体分型多重实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种检测伯氏疏螺旋体的分型多重实时荧光定量PCR方法,可对3种致病基因型伽氏疏螺旋体B.garinii、阿氏疏螺旋体B.afzelii、狭义伯氏疏螺旋体B.burgdorferi sensu stricto检出并分型。方法针对3种基因型菌株的外膜蛋白osp C基因,在保守序列设计通用引物并分别设计型特异Taqman探针,3条探针分别标记FAM、Texas Red和CY5荧光报告基团,建立和优化多重实时荧光定量PCR反应体系,检测其敏感性和特异性。结果建立的多重荧光定量PCR的最低检测值为B.garinii 40copies/μl、B.afzelii 5.17copies/μl和B.burgdorferi sensu stricto 37.8copies/μl,通过检测立克次体、土拉弗朗西斯菌无交叉反应,检测100只游离蜱与常规PCR结合测序结果分型一致,说明本方法有较好的灵敏性和特异性。结论该方法能快速检测伯氏疏螺旋体并同时分型,为莱姆病的诊断提供新方法。     

黄热病毒实时荧光定量PCR方法的建立

目的 建立黄热病毒的实时荧光定量PCR检测技术,以实现黄热病毒感染早期的筛选和检测.方法 以带有黄热病毒基因质粒为阳性模板,采用TaqMan探针法,制作标准曲线,以实现对黄热病毒的简单快速的高灵敏度、高特异性实时检测.结果 该方法检测的最低拷贝数可以达到3.457 copies/μl.组内及组间变异系数均低于5％,证明该方法具有良好的敏感性及稳定性.以1～4型登革病毒和乙脑病毒基因组为模板,检测结果为阴性,证明该方法有良好的特异性.结论 该方法可快速、灵敏、特异、定量检测黄热病毒,能用于黄热病毒感染的早期诊断.     

非O1非O139群霍乱弧菌多重PCR和SYBR Green实时PCR检测方法的建立

目的建立检测非Ol非0139群霍乱弧菌的多重PCR和SYBRGreen实时PCR方法。方法分别以霍乱弧菌的外膜蛋白基因(ompW)、01和0139群O抗原编码基因(咖)设计引物,建立多重PCR和SYBRGreen实时PCR方法,评价两种方法检测非01非0139群霍乱弧菌的特异性、重复性和一致性及最低检测菌量。结果建立了检测非01非0139群霍乱弧菌的多重PCR和SYBRGreen实时PCR方法,根据特异性条带(多重PCR)和特异性熔解温度(SYBRGreen实时PCR),两种方法均能特异性检测非01非0139群霍乱弧菌,并能鉴别其他弧菌(5种)和肠道杆菌(3种);两种方法的最低检测菌量分别为7×10⁴ cfu／ml(多重PCR)和7×10²cftdml(SYBR Green实时PCR),差异有统计学意义(P<0.05);对实时PCR的重复性检测,批内变异系数(CV)为 0.22％～0.92％,批间cv为0.27％～1.41％;经370株非01非0139群霍乱弧菌的检测,两种方法的一致性均为100％。结论建立的两种方法其特异性、敏感性及重复性均好,可适用于不同条件下非0l非0139群霍乱弧菌的检测和鉴定。     

Taq-Man实时荧光定量PCR同时检测O1和O139群霍乱弧菌

目的针对霍乱弧菌血清群各自编码O抗原的特异性基因建立能够快速、准确地同时检测O1和O139群霍乱弧菌的荧光PCR检测方法,并克服常用PCR检测方法中经常出现的假阳性现象。方法分别以rfbM和wbfR基因作为O1和O139群霍乱弧菌的模板设计引物和探针,通过优化反应条件建立了能够同时检测O1群和O139群霍乱弧菌的二联实时荧光定量PCR方法(FQ-PCR)。对该方法的特异性、灵敏度进行评估,并对10份模拟食品样品和133份临床样品进行了检测。结果特异性试验表明,该方法能选择性检测O1和O139群霍乱弧菌,能有效地避免O141群霍乱弧菌和拟态弧菌的假阳性,特异性为100%;灵敏度试验表明,O1群霍乱弧菌和O139群霍乱弧菌检出限分别为92cfu/ml和116cfu/ml;另外,试验建立的检测方法对模拟样品和临床样品检测结果与国标法的检测结果完全一致,符合率为100%。结论该实时荧光PCR检测方法能够同时检测O1和O139群霍乱弧菌,而且特异性好、灵敏度高,能有效克服假阳性,适用于基层疾病控制、口岸检疫单位日常疫情监测和临床诊断。     

与O139霍乱弧菌血清交叉凝集的麦氏弧菌

目的：对基层实验室上送的6株疑似O139霍乱弧菌进行检测及研究。方法：参照1999年《霍乱防治手册》第五版及相关资料进行检测。结果：该6株菌均系与O139霍乱弧菌血清有交叉凝集的麦氏弧菌。结论：该批菌株不是O139霍乱弧菌。而是麦氏弧菌。     

霍乱弧菌多重PCR-DHPLC分型方法建立

目的 建立霍乱弧菌多重PCR-变性高效液相色谱(DHPLC)快速分型方法。方法 分别合成扩增霍乱弧菌胶原酶基因(vcc基因)、O1群和O139群的毒力基因(ctxA基因和tcpA基因)以及O139群毒力基因(LPSgt基因),并对4对引物的PCR退火温度进行优化,建立多重PCR-DHPLC分型方法。结果 4种基因可同时被扩增,应用多重PCR-DHPLC方法对霍乱弧菌进行分型的结果与预期的一致。结论 多重PCR-DHPLC分型方法可用于快速、准确地鉴定细菌纯培养物是否为霍乱弧菌以及具体的菌群。     

霍乱弧菌O139感染棘阿米巴的实验研究

目的探讨霍乱弧菌能否在阿米巴原虫内生存。方法采用霍乱弧菌O139与多噬棘阿米巴的共培养方法，通过倒置显微镜、革兰染色和电镜超薄切片观察霍乱弧菌在阿米巴滋养体和包囊内生存情况。结果培养24h，革兰染色可见霍乱弧菌O139已进人阿米巴滋养体的吞噬泡内，随共培养时间的延长，可见吞噬泡内霍乱弧菌O139增多。电镜下可见霍乱弧菌O139在阿米巴环境中的不同感染期：包括胞饮期、吞噬泡形成期、增殖期及滋养体裂解释放，部分感染的滋养体发生包囊化，胞浆吞噬泡内可见存活O139弧菌。结论霍乱弧菌O139能在棘阿米巴滋养体内生存繁殖，并存活于包囊胞浆的吞噬泡中，因此棘阿米巴原虫可能是霍乱弧菌O139的环境贮存宿主之一。     

湖北省咸宁市学龄前儿童营养不良危险因素的病例对照研究

营养不良威胁儿童的生存、生命质量和后续发育，也关系到我国人口素质的提高。本研究旨在了解湖北省咸宁市学龄前儿童营养不良的危险因素，为有效防治儿童营养不良提供科学依据。     

龙泉市首例O139群霍乱弧菌耐药性及毒力基因携带情况研究

目的：研究龙泉市首例O139群霍乱弧菌耐药性及毒力基因携带情况。方法：运用药敏试验及PCR方法．分要该霍乱弧菌的耐药性以及携带ctxA、tcpA毒力基因的情况。结果：该O139群霍乱弧菌对庆大霉素等9种抗生素多重耐药：仅对丁胺卡那、诺氟沙星和环丙沙星敏感；该O139群霍乱弧菌携带ctxA、tcpA毒力基因。结论：在对O139群霍乱弧菌引起霍乱的防治工作中应密切监测其耐药性以及携带毒力基因的情况。     

52株O139群霍乱弧菌脉冲场凝胶电泳分析

目的:为探讨宁波市不同地区、不同年份、不同来源的霍乱病原菌之间的分子分型和遗传相关性,研究宁波市霍乱分子流行病学特点。方法:采用限制性内切酶NotⅠ对2004~2006年宁波地区霍乱疫情中分离的52株O139群霍乱弧菌进行脉冲场凝胶(PFGE)分子分型研究。结果:52株O139群霍乱弧菌基因组DNA经NotⅠ酶酶切、PFGE图谱分析,DNA条带得到有效分离,在20~500 KB区间产生约20条带。所有菌株按条带数量和位置的不同分为5个型别。结论:PFGE对来自不同地区、不同年份、不同来源的霍乱弧菌遗传相关性有较好的分辨能力。     

4重荧光PCR技术在霍乱监测与菌株鉴定的应用研究

目的 应用4重荧光PCR技术检测霍乱弧菌并对菌株进行鉴定.方法 用PCR法对2008-2010年监测的水样、水产品标本及食物中毒疑似菌株以进行检测.同时用细菌学方法分离菌株.再进行PCR检测.结果 1606份标本中.PCR法检出O1群霍乱弧菌阳性标本188份.从中分离到菌株150份(79.8％).O139群霍乱弧菌的P...     

杭州市O139群霍乱弧菌耐药变迁及毒力基因携带

目的 研究杭州市1994～2003年分离的O139群霍乱弧菌耐药性变迁以及携带ctxA、tcpA毒力基因的情况。方法 运用K—B法和PCR，检测90株O139群霍乱弧菌对抗生索的敏感性以及是否携带ctxA、tcpA毒力基因。结果 90株O139群霍乱弧菌中无丁胺卡那耐药的菌株，13株对诺氟沙星和环丙沙星耐药；对氨苄青霉索、复方新诺明分别有5年和6年的耐药率为100％；2002、2003年耐药谱增加到7种。87．87％的O139群霍乱弧菌同时携带ctxA、tepA毒力基因。结论10年来分离自杭州的O139群霍乱弧菌的耐药情况日益严重；O139群霍乱弧菌是否携带ctxA、tcpA毒力基因在对抗生素敏感性方面差异有统计学意义。     

可疑霍乱弧菌的实验鉴定

目的:对4株可疑霍乱弧菌进行种属鉴定。方法:对可疑菌落在传统血清学和系统生化鉴定的基础上进行细菌的分子鉴定:应用16S rDNA的序列分析进行细菌种属鉴定和实时荧光PCR检测O1、O139群霍乱弧菌。结果:16 s rDNA基因序列分析显示041和067为麦氏弧菌,059和074为霍乱弧菌;荧光定量PCR检测结果说明4株菌都不是O1和O139霍乱弧菌。结论:结合血清凝集和系统生化实验,可以确定041和067为麦氏弧菌,059和074为非O1/非O139霍乱弧菌。对于可疑和难鉴别的霍乱弧菌,不能单纯依靠血清学和表型鉴定方法,需要分子诊断方法,尤其是16SrDNA的序列分析,可以从分子水平为弧菌科细菌的种属鉴定提供更为直接的证据。