自噬在视网膜母细胞瘤Y79细胞顺铂耐药中的作用及其机制

目的 研究自噬在视网膜母细胞瘤Y79细胞顺铂耐药中的作用及其机制。方法 CCK-8法检测细胞IC50;将Y79细胞随机分为对照组（Control）、顺铂组（Cis）和顺铂联合应用自噬阻断剂3-甲基腺嘌呤组（Cis+3-MA）,Western blot法、细胞自噬染色检测试剂盒（MDC法）和透射电子显微镜观察细胞自噬情况;CCK-8法检测顺铂对细胞的抑制率变化,Annexin V/PI双染流式法检测细胞凋亡变化,q-PCR检测相关耐药基因转录水平,Fluo-4 AM钙离子荧光探针染色检测细胞内钙离子变化,Western blot法检测CaMKK2、p-AMPK、mTORC1、LC3Ⅱ的表达。结果 视网膜母细胞瘤Y79细胞在顺铂的诱导下发生自噬,加入自噬阻断剂3-MA后细胞自噬水平下调。与顺铂组相比,Cis+3-MA组顺铂抑制率增加,凋亡率增加,相关耐药基因转录水平下调。细胞加入顺铂后,细胞内钙离子水平增加,CaMKK2、p-AMPK、LC3Ⅱ表达上调,mTORC1表达下调。结论 顺铂诱导肿瘤细胞产生的自噬对视网膜母细胞瘤细胞Y79耐药起保护作用,抑制自噬可以改善肿瘤细胞对顺铂的耐药性。顺铂可能是通过Ca2+激活CaMKK2/AMPK/mTORC1通路诱导Y79细胞自噬。     

藤茶双氢杨梅树皮素对人视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞凋亡的诱导作用

目的 观察中药单体成分双氢杨梅树皮素(ampelopsin,APS)对人视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)细胞株HXO-RB44凋亡的影响,以探讨中药治疗RB的可能性.方法 取对数生长期的人视网膜母细胞瘤细胞株HXO-RB44用于实验,不同浓度的APS作用于HXO-RB44细胞24小时后,以MTT法、生长曲线法、软琼脂克隆形成法观察APS对HXO-RB44的体外抑制作用;倒置显微镜观察其形态学变化;AO/EB染色观察细胞凋亡形态学变化;流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 MTT法检测证实,APS对HXO-RB.的IC50为14.71 mg/L;细胞生长曲线法提示其对HXO-RB44细胞生长有明显抑制作用;软琼脂克隆形成法观察APS浓度＞9.90 mg/L时抑制率为100.0％,药物浓度为4.40 mg/L,抑制率为52.2％.APS作用后出现了明显的凋亡细胞,表现为细胞皱缩、核染色质浓缩、核碎裂等凋亡特征性的形态学改变.流式细胞仪检测50.00 mg/L、14.84 mg/L、4.40 mg/L和0.00 mg/L APS作用24小时后的细胞凋亡率分别为88.1％、58.5％、14.8％和4.8％,各浓度组凋亡率与空白对照组(4.8％)比较,差异均有统计学意义(P＜0.05),各浓度组细胞凋亡率之间差异也均有统计学意义(P＜0.05).结论 APS对HXO-RB44细胞的体外增殖活性有明显的抑制作用,并可诱导体外培养的RB细胞凋亡,可作为中药治疗RB的候选药物.     

紫檀芪诱导人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞的细胞凋亡及其机制研究

背景与目的：紫檀芪是一种天然抗氧化剂,其抗视网膜母细胞瘤的效果仍不明确。拟探讨紫檀芪对人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞的细胞增殖、细胞凋亡及细胞自噬的作用,并初步阐明其作用机制。方法：采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)法测定细胞的增殖活力,Annexin V/PI流式细胞术检测细胞凋亡,吖啶橙染色观察细胞内自噬囊泡的变化,蛋白［质］印迹法(Western blot)检测LC3B及P62蛋白的表达。结果：紫檀芪显著抑制WERI-Rb-1细胞的增殖活力(P<0.01),以25、50和100 μmol/L的药物浓度作用细胞24 h时,细胞增殖活力分别为(93.02±0.47)%、(55.10±2.04)%和(30.33±1.45)%;50 μmol/L紫檀芪处理细胞12、24和48 h时,细胞增殖活力分别为(88.38±3.70)%、(53.37±1.17)%和(29.60±1.05)%。紫檀芪显著诱导细胞凋亡(P<0.01),对照组、24和48 h细胞的凋亡率分别为(4.08±0.79)%、(13.44±2.12)%和(23.49±2.01)%。紫檀芪能够激活WERI-Rb-1细胞发生细胞自噬,上调LC3蛋白的表达,下调P62蛋白的表达,增加细胞内自噬囊泡的数量(P<0.01)。3-MA及Beclin1 siRNA抑制细胞自噬后能够部分逆转紫檀芪的抗肿瘤作用(P<0.01)。3-MA抑制细胞自噬后,紫檀芪处理组的细胞凋亡率为(12.97±2.09)%,3-MA+紫檀芪组为(8.35±1.11)%。siRNA敲低Beclin1后,紫檀芪处理组和siRNA+紫檀芪组的细胞凋亡率分别为(13.80±2.19)%和(9.62±0.52)%。结论：紫檀芪可以显著抑制WERI-Rb-1细胞的细胞增殖并激活细胞自噬促进细胞凋亡。     

紫杉醇诱导视网膜母细胞瘤细胞凋亡及对磷酸化Bcl-2的影响

目的：研究紫杉醇(Tax)抑制视网膜母细胞瘤(Rb)细胞生长并诱导其凋亡及磷酸化Bc-2在其中的作用。方法：应用^3H-胸腺嘧啶掺入分析法观察Tax对细胞生长的抑制作用，以DNA片段凝胶电泳分析细胞凋亡，用Western blot分析Tax对磷酸化Bcl-2的影响，用cDNA细胞转染法观察突变型Bcl-2阻断Tax的作用。结果：Tax可明显地抑制Y79细胞的生长，1μmoL／L Tax处理24小时，^3H-胸腺嘧啶掺入率下降达55．43％，Tax可诱导Y79细胞凋亡。在此过程中，Bcl-2被磷酸化。当Y79细胞被转染突变型Bcl-2后，Tax对Y79细胞的作用被阻断。结论：Tax可抑制Y79细胞生长并诱导其凋亡，磷酸化Bcl-2参与其过程。     

Survivin基因沉默下调血管形成相关因子表达抑制视网膜母细胞瘤侵袭性及其分子机制研究

目的:研究基因沉默Survivin对视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞凋亡、侵袭以及血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶 2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）活性的影响。方法:培养视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞,构建Survivin-shRNA载体。按照处理不同分为Survivin-shRNA组、GFP组和CON组。分别检测三组HXO-RB44细胞凋亡指数、细胞侵袭能力以及VEGF、MMP-2、MMP-9、CAS-3蛋白的表达水平。结果:流式细胞术结果表明,与CON组和GFP组相比,Survivin-shRNA组细胞凋亡率增加,差异有统计学意义（P＜0.05）;Transwell侵袭小室实验显示Survivin-shRNA能明显降低HXO-RB44细胞的侵袭能力;Western blot结果发现,Survivin-shRNA可降低VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平,并提高CAS-3的表达水平。结论:Survivin-shRNA可诱导HXO-RB44细胞凋亡,抑制细胞侵袭能力,下调血管形成相关因子VEGF、MMP-2、MMP-9的表达,进而抑制肿瘤新生血管的形成。     

丙戊酸促进神经母细胞瘤细胞自噬性死亡

目的探讨丙戊酸(VPA)对神经母细胞瘤细胞自噬性死亡的调控。方法用含不同浓度的VPA培养基培养SH-SY5Y细胞,应用MTT法检测细胞的存活率,乳酸脱氢酶(LDH)检测细胞损伤,单丹磺酰尸胺(MDC)染色评价细胞质内酸性自噬泡的形成,Western blotting法检测巨自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值及Beclin-1的表达。结果与对照组比较,VPA孵育48 h后,SH-SY5Y细胞存活率明显降低,且具有剂量依赖性(P<0.05);SH-SY5Y细胞培养基中LDH明显增高,且具有剂量依赖性(P<0.05);VPA诱导细胞内LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值及Beclin-1的表达水平明显上调(P<0.05)。结论 VPA诱导神经母细胞瘤细胞细胞自噬性死亡,为神经母细胞瘤的治疗提供新的手段。     

自噬在胶质母细胞瘤化疗中的作用

胶质母细胞瘤是化疗耐药性最强的肿瘤,其对诱导凋亡的化疗抵抗,而越来越多的证据显示其对诱导自噬的化疗较少抵抗。虽然很多化疗方案都参与调节自噬过程,但胶质母细胞瘤的化疗效果一直不理想,这与其耐药性密切相关。目前,自噬在胶质母细胞瘤化疗中具体起什么作用及其作用机制还不十分清楚。作者对近年来自噬在胶质母细胞瘤化疗中的作用的研究进展进行了综述。     

芹菜素诱导胃癌SGC-7901细胞自噬及其对凋亡 的影响

目的：探讨芹菜素（API）是否诱导胃癌SGC-7901细胞发生自噬及其对细胞凋亡的影响。方法：采用不同浓度（0、20、40、60、80 μmol/L）的API处理胃癌SGC-7901细胞24 h,MTT法检测API对细胞生长的抑制情况。分别采用不同浓度（0、20、40、60、80 μmol/L）API处理细胞24 h,及60 μmol/L的API处理不同时间（0、12、24、36、48 h）,Western blot检测自噬标志蛋白微管相关蛋白l轻链3（LC3）、Beclin-1和磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/Akt/mTOR信号通路中关键分子p-Akt、p-mTOR的表达;电子显微镜下观察细胞自噬情况。细胞经自噬抑制剂氯喹（CQ）或3-甲基腺苷（3-MA）预处理后再加入API,Western blot检测聚二磷酸腺苷-核糖体聚合酶（PARP）的表达;流式细胞术流检测细胞凋亡率。结果：API对胃癌SGC-7901细胞生长具有明显抑制作用并呈剂量-效应关系。随着API浓度和作用时间的增加,SGC-7901细胞LC3Ⅱ与Beclin-1蛋白表达均增加,各剂量组与对照组相比较差异均具有统计学意义（P < 0.05）;API处理后的细胞逐渐出现自噬囊泡和自噬溶酶体;p-Akt、p-mTOR蛋白表达降低。采用自噬抑制剂抑制细胞自噬后,除API组LC3Ⅱ与Beclin-1蛋白表达明显高于对照组外（P < 0.05）,各组蛋白表达无显著差异。API+CQ组和API+3-MA组的PARP蛋白剪切片段表达及凋亡率均高于对照组和API组（P < 0.05）。结论：API可以诱导胃癌SGC-7901细胞发生自噬,其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路关键分子p-Akt、p-mTOR活性有关;抑制API诱导的自噬能够增强API的凋亡诱导效应,从而增强对胃癌SGC-7901细胞的杀伤作用。     

磷酸化JNK介导全反式维甲酸诱导视网膜母细胞瘤细胞凋亡

目的 探讨全反式维甲酸(ATRA)抑制视网膜母细胞瘤(Rb)细胞生长并诱导其凋亡的作用及信号转导机制。方法 应用^3H—胸腺嘧啶掺人分析法观察ATRA对细胞生长的抑制作用;用流式细胞仪分析ATRA对Y79细胞周期的影响;以DNA片段凝胶电泳分析细胞凋亡;用Western blot分析c—jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化。结果 ATRA可明显抑制Y79细胞的生长,1μmol/L处理36h时,^3H—胸腺嘧啶掺人率下降达40％,Y79细胞被阻滞于G0／G1期,并出现Sub—G1峰。ATRA可诱导Y79细胞凋亡,此凋亡过程可被JNK的阻断剂Curcumin阻断;在此过程中,JNK被激活并磷酸化。结论 ATRA可抑制Y79细胞生长并诱导其凋亡,其过程是由磷酸化的JNK介导,提示ATRA可能是一种潜在的抗Rb化疗药物。     

自噬与凋亡的相互关系在肿瘤方面的研究进展

肿瘤是一类涉及基因、代谢和信号传导异常等多方面因素引起的疾病,其发生的分子机制相当复杂,但本质上仍与细胞增殖与死亡的动态失衡有关。程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）是由基因控制的自杀程序引起的主动性死亡,对于多细胞生物个体发育的正常进行,维持内环境稳态以及抵御外界各种干扰因素方面有着关键性的意义。I型PCD（经典细胞凋亡）和II型PCD（自噬性细胞死亡）调控着肿瘤细胞的增殖与消耗,与肿瘤的发生、发展密切相关。本文结合近年来国内外研究进展,重点就自噬在肿瘤中的作用以及与凋亡的相互关系作一综述。     

RNA干扰抑制高迁移率族蛋白-1表达对人视网膜母细胞瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究siRNA抑制高迁移率族蛋白-1(high mobility group protein box-1, HMGB1)表达对人视网膜母细胞瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法:RT-PCR和Western blot检测HMGB1在人视网膜母细胞瘤中的表达。体外化学合成靶向HMGB1 siRNA,RT-PCR和Western blot检测其抑制效率。MTT法检测HMGB1沉默后Y79细胞的增殖情况。Caspase-3活性检测试剂盒检测HMGB1沉默后Y79细胞的凋亡情况。采用流式细胞仪来分析细胞周期的分布以及细胞凋亡率的变化。结果:HMGB1 mRNA和蛋白在人视网膜母细胞瘤细胞中高表达,siRNA抑制HMGB1表达后,Y79细胞增殖抑制,促进凋亡。结论:抑制HMGB1的表达可以降低人视网膜母细胞瘤细胞的增殖,并促进其凋亡,为人视网膜母细胞瘤的生物学治疗提供新的思路。     

Survivin-shRNA对裸鼠骨肉瘤生长的抑制作用及其机制

目的:研究Survivin-shRNA对裸鼠骨肉瘤生长的抑制作用,并探讨其与凋亡及PI3K/Akt信号通路之间的关系。方法:重组腺病毒Survivin-shRNA转染骨肉瘤MG-63细胞,以1∶5比例进行传代,挑选稳定转染的MG-63细胞并扩增,GFP组和CON组为阴性对照组。采用皮下异种移植法构建裸鼠骨肉瘤模型50只,每3天用卡尺测量肿瘤体积;颈椎脱臼法处死裸鼠,称取骨肉瘤标本的重量;免疫组织化学法检测磷酸化Akt（p-Akt）、生存素（Survivin)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白的表达。结果:骨肉瘤生长曲线显示,与CON组和GFP组相比,Survivin-shRNA组的肿瘤增长缓慢,差异有统计学意义（P＜0.05）;肿瘤的重量结果显示, CON组、GFP组及Survivin-shRNA组分别为（2.13±0.32） g、（1.94±0.27） g及（1.42±0.19） g,差异有统计学意义（P＜0.01）;免疫组织化学结果显示,p-Akt及Survivin的表达在Survivin-shRNA组中明显低于CON组和GFP组,差异有统计学意义（P＜0.05）,而Caspase-3高表达。结论:Survivin-shRNA可抑制裸鼠骨肉瘤的生长,其机制可能是通过调节PI3K/Akt信号通路及Survivin、Caspase-3的表达来实现。     

RNA干扰技术沉默宫颈癌Hela细胞Survivin基因对细胞生物学特点的影响

目的:通过RNA干扰技术沉默宫颈癌Hela细胞中的Survivin基因,观察干扰后核酸表达及细胞凋亡情况发生的变化,为进行宫颈癌的基因治疗提供理论依据.方法:设定空白组、阴性对照组及实验组,空白组Hela细胞未进行基因干扰,阴性对照组为非特异序列干扰,实验组为针对Survivin基因设计的干扰RNA(siRNA)干扰,每组均设三个平行标本.转染后48h收集细胞,RT-PCR技术检测Survivin mRNA表达,流式细胞术检测细胞凋亡情况.结果:转染siRNA 48h后,Hela细胞中Survivin mRNA拷贝数明显减少,实验组mRNA表达量为空白组的23.4％,存在显著性差别(P＜0.01);为阴性对照组的23.3％,存在显著性差别(P＜0.01).流式细胞术检测结果表明,实验组Hela细胞凋亡率是空白组的3.08倍(P＜0.01);是阴性对照组的2.69倍(P＜0.01),均有显著性差异.结论:通过RNA干扰沉默宫颈癌Hela细胞Survivin基因能够促进细胞凋亡的发生,Survivin可能成为基因治疗宫颈癌的理想靶基因.     

siRNA转染肝癌HepG2细胞Survivin基因凋亡机制探讨

Objective  

The aim of this study was to investigate the molecular mechanism of anti-apoptotic action of survivin to the hepatoma-cellular carcinoma cell line HepG2.     

FUNDC1调控肺癌A549细胞及其干细胞的生长、自噬、凋亡和细胞干性的研究

目的:本实验旨在阐明线粒体自噬受体蛋白FUNDC1(FUN 14 domain containing 1)在肺癌病理进程中对肿瘤细胞生长死亡以及细胞干性的调控作用.方法:使用RT-qPCR分析FUNDC1在肺癌组织和细胞中的表达情况.siRNAs和过表达载体转染A549细胞以及诱导形成的A549干细胞团(A549/CS...     

HMGB1基因沉默促进多柔比星诱导的胃癌BGC-823细胞自噬及调亡

目的 探讨高迁移率族蛋白l（high-mobility group box 1,HMGBl）基因沉默对化疗药物多柔比星（doxorubicin, DOX）诱导BGC-823胃癌细胞发生自噬和凋亡的影响。方法 MTT、Western blotting和激光共聚焦显微镜观察方法分别检测DOX对BGC-823细胞增殖及微管相关蛋白轻链3- I （microtubule light chain- I,LC3I）、LC3II表达和自噬小体形成的影响。构建靶向HMGB1的shRNA载体pSuper-shHMGBl及其对照载体pSuper-shNC并转染BGC-823胃癌细胞,建立HMGBl稳定沉默的细胞系。DOX处理不同质粒转染组的BGC-823胃癌细胞,激光共聚焦显微镜观察HMGBl沉默对DOX诱导的自噬小体形成的影响,MTT法、流式细胞术分别检测对细胞增殖和凋亡的影响,Western blot检测对自噬及凋亡相关蛋白（HMGB1, LC3, Bcl-2,Bcl-XL, Mcl-1 and cleaved caspase-3）表达的影响。结果 DOX可上调LC3-II蛋白的水平和促进细胞自噬体的形成(P<0.001)。与对照组相比,HMGBl基因沉默可降低DOX诱导的自噬作用(P<0.001),并促进胃癌细胞发生凋亡[12.37±2.84 % vs 46.12±3.15%, P<0.05],上调激活型caspase-3的表达水平。进一步分析发现,DOX诱导胃癌细胞发生自噬时,抗凋亡蛋白骨髓细胞白血病蛋白1（Mcl-1）的降解增加,而Bcl-2和Bcl-XL表达无明显变化;HMGBl基因沉默可抑制DOX诱导的Mcl-1降解。结论 DOX可诱导胃癌细胞发生自噬;HMGB1基因沉默有助于逆转BGC-823胃癌细胞对DOX耐药性,促进胃癌细胞发生凋亡。