脂肪基质干细胞诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的研究脂肪基质干细胞（ASCs）的分离、纯化、扩增以及在体外定向分化为心肌样细胞的能力。方法获取并培养正常人的ASCs，倒置显微镜下观察其形态；流式细胞仪检测其免疫表型。5-氮胞苷诱导ASCs在体外分化为心肌样细胞，倒置显微镜观察心肌样细胞的形态，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测心肌相关基因ANP、cTnT、cTnI和αMHc的表达；免疫荧光法检测cTnT和结蛋白的表达；Western blot法检测Connexin43的表达。结果ASCs呈纤维样贴壁生长，体外培养易扩增；ASCs表达相关抗原CD29和CD105，不表达CD31、CD34、CD45和HLA—DR；ASCs经5-氮胞苷的作用可呈现典型的心肌样细胞形态，ANP、cTnT、cTnI和aMHc基因及cTnT、结蛋白和Connexin43均呈阳性表达。结论脂肪组织中分离培养的ASCs具有体外大量扩增并保持低分化状态的特性，以及定向分化为心肌样细胞的能力，有望成为治疗心肌梗死的种子细胞。     

体内外诱导人脐血间充质干细胞向心肌细胞的定向分化

目的观察在体外5-氮胞苷诱导和体内心肌缺血微环境诱导下,人脐血间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）向心肌细胞的定向分化。方法收集健康产妇脐血细胞,采用密度梯度离心结合差速贴壁的方法分离MSCs,传代培养至第三代,应用流式细胞术分析MSCs表面分子CD34、CD45、CD44和CD90的表达。体外应用5-氮胞苷（5-aza）诱导MSCs四周后,免疫荧光染色和RT-PCR分别检测MSCs心肌标志物cTnT（肌钙蛋白）和Connexin43（缝隙连接蛋白）的表达;体内将GFP标记的MSCs移植入心肌梗死大鼠模型心肌梗死周边区,移植后1周,取大鼠心脏行冰冻切片,免疫荧光染色检测MSCs心肌特异性蛋白cTnT和Connex-in43的表达。结果分离的MSCs表达表面分子CD44和CD90,不表达CD34和CD45;MSCs体外经5-氮胞苷诱导后在mRNA和蛋白水平均表达心肌标志物cTnT和Connexin43;MSCs体内移植后1周,免疫荧光染色检测发现移植的MSCs表达心肌特异性蛋白cTnT和Connexin43。结论人脐血间充质干细胞可在体外诱导和体内心肌缺血微环境下向心肌细胞分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的研究

目的观察体外不同诱导条件下大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在不同时间段分化为心肌样细胞的能力及表达心肌细胞特异性标志物的差别。方法分离培养SD大鼠BMSCs和SD乳鼠心肌细胞并鉴定,取第3代BMSCs分别进行5-氮胞苷(5-Aza)诱导、与心肌细胞共培养及单独培养,分别于第2、4、6、8、10周使用倒置显微镜观察细胞生长情况和形态变化,反转录-聚合酶链反应检测每组细胞心肌特异性基因肌钙蛋白I(cTnI)、缝隙连接蛋白43(Cx43)和心肌特异性转录因子4(GATA-4)的表达。结果对照组未见有搏动细胞,cTnI、Cx43和GATA-4基因表达阴性;5-氮胞苷诱导组于第2周时细胞呈梭形且排列方向趋于一致,未见有搏动细胞,cTnI、Cx43基因表达第8周达到高峰,GATA-4基因表达第4周达高峰;共培养组细胞多为梭形,呈肌性排列,可见搏动频率不一致的搏动细胞,cTnI、Cx43基因表达于第2⁸周表达逐渐增加,GATA-4基因表达第6周达高峰;相同时段内,共培养组的cTnI、Cx43和GATA-4基因表达高于5-氮胞苷诱导组(P<0.05)。结论 BMSCs经5-氮胞苷诱导或与心肌细胞共培养可转化为心肌样细胞并表达基因cTnI、Cx43和GATA-4,且共培养组BMSCs分化为心肌样细胞的能力比5-氮胞苷诱导组强,推测心肌微环境可促进BMSCs定向分化为心肌样细胞。     

5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的:研究体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(mensenchymal stem cells,MSCs) 经5-氮胞苷(5-aza) 诱导定向分化为心肌样细胞形态学及分子生物学特征?方法:SD大鼠股骨骨髓经密度梯度离心及贴壁分离培养传代MSCs,体外用5-aza定向诱导向心肌样细胞分化?相差显微镜观察心肌样细胞形态学变化?免疫组化检测肌钙蛋白T(cTnT)?α-肌动蛋白和缝隙连接蛋白Cx43表达?结果:密度梯度离心及贴壁法分离培养的MSCs生长稳定,增殖快?5-aza诱导后,部分细胞形态发生变化,有肌管样结构形成?随诱导后培养时间延长MSCs中cTnT?α-肌动蛋白和缝隙连接蛋白Cx43表达逐渐增强?结论:密度梯度离心及贴壁分离培养可获得大量纯度较高的骨髓间充质干细胞?经5-aza诱导骨髓间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞?     

成人脂肪间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的实验观察

目的:探索成人脂肪组织来源的间充质干细胞(ADMSCs)体外分离、培养方法,并化学诱导使其向心肌细胞分化,为心肌再生医学提供理想的种子细胞来源. 方法:体外分离成人ADMSCs并进行传代培养,5-氮胞苷(5-aza)诱导其向心肌细胞分化. 分别于诱导后14,21,28 d时用免疫细胞化学染色、RT-PCR法进行心肌细胞鉴定. 结果:ADMSCs经5-aza诱导后14 d时细胞形态趋向于心肌细胞,诱导28 d免疫细胞化学显示心肌特异性肌钙蛋白I(cTN-I)、结蛋白(Desmin)表达阳性,RT-PCR检测心肌β-肌球蛋白重链(Cardiac β-MHC)基因表达阳性. 结论:成人脂肪组织存在丰富的间充质干细胞且易于分离扩增,体外5-aza诱导可使其向心肌细胞分化,可做为心肌再生医学的理想种子细胞.     

5-氮胞苷诱导脂肪间充质干细胞向心肌细胞分化的毒理遗传学研究

目的：观察5-氮胞苷（5-aza）对成人脂肪间充质干细胞（ADMSCs）向心肌细胞方向诱导分化的毒理遗传学影响.方法：自成人脂肪组织中分离培养ADMSCs,用5-aza对ADMSCs进行诱导,设立不同诱导浓度的I,II,III,（5,10,20μmol/L）组及对照组IV,光镜下观察细胞的生长情况及形态学变化,免疫细胞化学方法检测心肌特异性肌钙蛋白I（cT-nI）,RT-PCR方法检测cTnI基因的表达,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡,并对各诱导组常规核型分析.结果：诱导后4wk I,II,III组ADMSCs呈现类似心肌细胞的形态学特征.I,II,III组免疫组化结果见cTnI阳性表达,RT-PCR条带见cTnI基因表达.各组染色体结构及数目均未见异常.结论：5-aza作为诱导剂对ADMSCs遗传性无不良影响.     

含组织激肽释放酶1表达载体诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

目的 探讨组织激肽释放酶1(KLK1)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化的影响.方法 选取2015年3-7月购买的大鼠BMSCs,将大鼠BMSC细胞分为3组即正常组、组织激肽释放酶1组、5-Aza组.采用RT-PCR分别对诱导培养后的大鼠BMSCs进行心肌细胞特异性蛋白Actin、c-TnI和Desmin的检测,并用Western blot免疫印迹分析c-TnT蛋白表达量.结果 RT-PCR检测显示,5-Aza诱导的BMSCs(1.964±0.805)在心肌特异性蛋白Actin RNA、c-TnI RNA和Desmin RNA的表达均高于空白组(1.000±0.000)(P<0.05),KLK1诱导组(2.633±0.582)以上蛋白的RNA表达量又显著高于5-Aza诱导组(P<0.05).Western blot结果显示,5-Aza诱导组c-TnT蛋白的表达(0.799±0.101)高于空白组(0.112±0.001)(P<0.001),KLK1诱导组(1.294±0.134)显著高于5-Aza组.差异有统计学意义(P<0.001).结论 5-Aza能有效使BMSCs向心肌样细胞诱导分化,KLK1也能诱导BMSCs向心肌样细胞分化.KLK1较5-Aza诱导的BMSCs在心肌细胞特异性蛋白RNA表达,心肌特异性蛋白T表达其心肌特异性更为突出.     

3种体外培养方法诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化效果比较

目的：采用3种体外培养方法对骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行诱导分化,探讨体外诱导BMSCs向心肌细胞分化的最佳方法。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法体外分离培养大鼠BMSCs,分为5-氮胞苷（5-aza）组、扩张型心肌病（DCM）模型大鼠心肌细胞裂解液组和DCM模型大鼠血清+5-aza组,同时设对照组（同等条件下在含10%胎牛血清的L-DMEM培养基中培养）,观察细胞形态表现,采用RT-PCR法、Western blotting法和免疫组织化学染色法检测细胞中肌钙蛋白T（cTnT）的表达。结果：密度梯度离心法结合贴壁培养法获得大鼠BMSCs,BMSCs高表达间充质干细胞（MSCs）的特征性表面标记CD44、CD29和CD105,不表达造血干细胞的特征性表面标志CD34;特定诱导条件下,BMSCs可以向成骨细胞及脂肪样细胞分化。体外3种培养方法均可诱导BMSCs表达cTnT,分化为心肌样细胞;5-aza组细胞生长状态差,其余2组细胞生长状态较好,DCM模型大鼠血清+5-aza组细胞中cTnT阳性表达率最高。结论：采用DCM模型大鼠血清联合5-aza诱导BMSCs向心肌细胞分化的效果最佳。     

黄芪甲苷体外诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究

【目的】观察黄芪甲苷体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化为心肌样细胞的作用。【方法】采用密度梯度离心和贴壁培养法分离大鼠MSCs,反复传代及纯化后,取第3代MSCs,采用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34和CD44;取第8代MSCs进行分组诱导:黄芪甲苷组(终浓度为250 mg/L)、5-氮胞苷(5-aza,终浓度为10μmol/L)、黄芪甲苷加5-aza组(终浓度分别为250 mg/L与10μmol/L),并设空白对照组,诱导后继续培养4周;计算心肌样细胞诱导率,采用免疫组化法鉴定诱导后MSCs中结蛋白(Desmin)和心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)的表达,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法鉴定诱导后MSCs中心肌特异性蛋白α-心肌肌球蛋白重链(-αMHC)和β-心肌肌球蛋白重链(-βMHC)信使核糖核酸(mRNA)的表达。【结果】原代培养的MSCs首先形成集落,传代细胞体积变大,诱导后细胞呈梭形,并出现肌管;MSCs表面抗原CD44表达阳性,而骨髓造血干细胞表面抗原CD34表达阴性,表明本实验方法所得细胞为均一的MSCs细胞群;各组在不同时间的心肌样细胞诱导率无明显差异;免疫组化结果显示诱导后MSCs表达心肌特异性蛋白Desmin和cTnI;RT-PCR结果显示诱导后MSCs表达成熟的心肌特异性蛋白-αMHC和-βMHC。【结论】黄芪甲苷可在体外诱导大鼠MSCs定向分化为心肌样细胞,但诱导率仍有待提高。     

5-氮杂胞苷对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖及成肌分化的影响

[目的]观察5-氮杂胞苷(5-Aza)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外增殖和成肌分化的影响.[方法]无菌条件下取SD大鼠骨髓组织,采用密度梯度离心法分离大鼠MSCs,传3代后的MSCs采用双标免疫组化法鉴定后,随机分为4组:浓度为5、10、15μmol/L的5-Aza组和空白对照组,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度5-Aza对MSCs生长增殖的影响;以含5、10、20μmol/L5-Aza的培养基诱导培养MSCs 24 h后,改用完全培养基继续培养,采用免疫组织染色法鉴定5-Aza诱导分化3、7、14d后细胞肌分化相关蛋白肌凝蛋白(myosin)和结蛋白(desmin)的表达情况.[结果]双标免疫组化染色结果显示:所培养细胞同时表达Brdu和CD44、CD54,表达率达96%,鉴定结果表明所培养细胞为MSCs;5、10μmol/L5-Aza对MSCs增殖无显著影响(P>0.05),15μmol/L5-Aza可显著抑制MSCs生长(P<0.05);不同浓度5-Aza诱导培养MSCs后第3天,部分细胞出现desmin阳性表达,诱导后14 d,部分细胞表达myosin,以10μmol/L5-Aza组作用为佳.[结论]高浓度5-Aza可抑制MSCs体外增殖;适宜浓度的5-Aza可诱导MSCs向成肌细胞定向分化.     

外泌体对过表达GATA-4小鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化能力促进作用的研究

目的　探讨过表达GATA-4小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）通过外泌体促进BMSCs向心肌细胞分化的能力。方法　2016年1—6月选取健康4周龄SPF级C57BL/6小鼠10只,通过慢病毒载体GV308携带GATA-4转染小鼠BMSCs,构建过表达GATA-4的BMSCs,并加入基因开启剂多西环素（DOX）。采用ExoQuick-TC提取分泌的外泌体。将GATA-4-BMSCs-外泌体与BMSCs共同培养（A组）、空载体-BMSCs-外泌体与BMSCs共同培养（B组）、BMSCs-外泌体与BMSCs共同培养（C组）、BMSCs单独培养（D组）及小鼠心肌细胞单独培养（E组）72 h,采用荧光染色定性检测和反转录聚合酶链式反应（qPCR）定量检测肌钙蛋白T（cTnT）、α肌动蛋白（α-actin）、Connexin 43、肌间线蛋白（Desmin）的表达。结果　免疫荧光定性检测结果显示,A组GATA-4-BMSCs-外泌体与BMSCs共同培养72 h可见细胞核被DAPI染为蓝色,表达出绿色的cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin;B、C、D组可见细胞核被DAPI染为蓝色,没有表达出绿色的cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin;E组可见细胞核被DAPI染为蓝色,表达出绿色的cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin。qPCR法检测结果显示,5组cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表达水平比较,差异均有统计学意义（P<0.05）;其中E组cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表达水平较A组升高;A组和E组cTnT、α-actin、Connexin 43、Desmin表达水平较B组、C组和D组升高（P<0.05）。结论　过表达GATA-4的BMSCs分泌的外泌体可以有效促进BMSCs向心肌细胞分化。     

骨形态发生蛋白-2、梗死心肌裂解液对骨髓间充质干细胞体外诱导分化作用的研究

目的探讨骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、梗死心肌裂解液模拟的生物微环境诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化及在模拟的微环境中BMP-2对诱导的影响。方法 BMSCs分离与体外培养,构建大鼠心肌梗死模型制成梗死心肌裂解液;分4组:单纯DMEM培养组(A组)、梗死心肌裂解液组(B组)、梗死心肌裂解液加BMP-2阻断剂noggin组(C组)、BMP-2组(D组),通过倒置相差显微镜形态学观察、应用免疫细胞化学技术检测心肌特异性肌钙蛋白(cTnT)、心肌特异性肌球蛋白重链(MHC)的表达,并对诱导的心肌样细胞进行统计学分析。结果诱导3周后免疫细胞化学染色分析cTnT、MHC,A、C组呈阴性表达,B、D组呈阳性表达,B、D组与A、C组相比阳性细胞数增加(P<0.05)。结论 BMP-2、梗死心肌裂解液可诱导BMSCs分化为心肌样细胞;且BMP-2是梗死心肌裂解液诱导过程中重要的组成成分之一。     

脐血MSCs移植对急性心肌梗死大鼠心肌的修复作用

目的:观察体内心肌缺血微环境诱导下人脐血间充质干细胞(umbilical cord blood mesenchymal stem cells,UCBMSCs)向心肌样细胞的定向分化及对急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)大鼠心功能、新生血管的影响。方法:收集健康产妇脐血细胞,采用密度梯度离心结合差速贴壁的方法分离MSCs;健康成年SD大鼠30只,制备成AMI大鼠模型后分为2组,移植组在心肌梗死周边区注射移植GFP标记的UCBMSCs;对照组在心肌梗死周边区注射等量生理盐水。术后4周行超声心动图检测及血流动力学检查,并取心脏组织行冰冻切片,免疫荧光染色检测UCBMSCs心肌特异性蛋白cTnT和Connexin43的表达;并进行抗Ⅷ因子抗体免疫组化染色,观察心肌毛细血管密度(myocardial capillary density,MCD)的变化。结果:与对照组相比,术后4周移植的UCBMSCs表达心肌特异性蛋白cT-nT和Connexin43,对照组无心肌特异蛋白表达;移植组LVEDD、LVESD明显减小,而LVEF、LVFS明显增加,血流动力学指标明显改善;免疫组化染色结果显示,移植组梗死周边区MCD较对照组明显增加,移植组为(4.16±0.2)个/HP(×400),对照组为(2.29±0.3)个/HP,两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:UCBMSCs移植可在大鼠AMI部位存活,并向心肌样细胞分化;UCBMSCs移植后明显改善AMI大鼠心功能及心室重构,促进毛细血管新生。     

黄芪注射液与5-氮杂胞苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的研究

目的研究黄芪注射液与5-氮杂胞苷（5-Aza）对大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）分化为心肌细胞的影响。方法在无菌条件下从成年大鼠胫骨骨髓分离出MSCs。以1：3的比例传代,取第3代的细胞．接种后随机将MSCs分为黄芪注射液诱导分化组、5-Aza诱导分化组、黄芪注射液预处理后5-Aza诱导分化组。分别以黄芪注射液、5-Aza及黄芪注射液＋5-Aza进行诱导,用相差显微镜观察各纽细胞形态变化;免疫细胞化学鉴定MSCs表面标志物及心肌特异性肌钙蛋白I。结果各组诱导后细胞形态发生改变,细胞之问形成连接,排列方向趋于一致,免疫组化检测结果显示肌钙蛋白I（eTnI）表达均阳性。黄芪注射液组与5-Aza组相比其诱导率无明显区别．但黄芪注射液＋5一Aza组阳性细胞比率均高于5-Aza组及黄芪注射液组．差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论黄芪注射液可体外诱导MSCs分化为心肌样细胞,采用黄芪注射液预处理后5-Aza诱导分化的方法优于单纯采用黄芪注射液或5-Aza谤导法。     

MSC体外诱导分化为心肌样细胞的鉴定及Nesprin蛋白表达研究

目的 体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)向心肌细胞分化并进行相关鉴定,观察分化过程中细胞Nesprin蛋白表达的变化.方法 大鼠MSC经Ficoll密度梯度离心法分离获得后贴壁传代培养,流式细胞术鉴定第2代MSC表面抗原表达.以10μmoL/L 5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导第2代MSC向心肌细胞分化,观察细胞形态学改变;RT-PCR、免疫组织化学法和免疫荧光细胞化学染色鉴定心肌细胞相关蛋白Desmin、α-sarcomeric actin、cardiac Troponin I(cTn I)mRNA和蛋白表达;Western blotting检测MSC分化前后Nesprin蛋白表达.结果 经5-Aza诱导分化后的MSC细胞及细胞核增大,形态渐趋一致,大部分呈长梭形;细胞Desmin、α-sarcomeric actin、cTn I mRNA和蛋白呈阳性表达.免疫荧光细胞化学染色显示Nesprin蛋白定位于核膜,Western blotting分析发现诱导分化后细胞Nesprin蛋白表达明显增加(P<0.05).结论 成功诱导大鼠MSC向心肌细胞分化;Nesprin蛋白在分化后细胞中的表达明显增加,提示Nesprin可能参与MSC向心肌细胞样变化的过程.     

体外诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为心肌细胞实验方法的建立

目的:探讨体外培养并诱导人骨髓间充质干细胞(hMSCs) 分化为心肌细胞（CMs）的实验方法。方法:采用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离、纯化hMSCs,采用5-氮杂胞苷( 5-Aza)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对hMSCs进行联合诱导,诱导3～4周,观察细胞形态学的变化,免疫组织化学方法鉴定肌细胞及心肌细胞特异蛋白的表达。结果:hMSCs体外经5-Aza 和bFGF联合诱导1～2周后,细胞体积较诱导前增大,呈长梭形。诱导2～3周后细胞伸出伪足呈多爪形;诱导3～4周后细胞伪足间相互连接形成肌管样结构。联合诱导3～4周后免疫组织化学鉴定结蛋白(Desmin)、肌钙蛋白(cTnⅠ)和横纹肌肌动蛋白（α-sarcomeric actin）表达均呈阳性。结论:hMSCs在体外经5-Aza和bFGF联合诱导可以分化为CMs。     

心脏肌钙蛋白T,I检测对病毒性心肌炎和扩张型心肌病的诊断价值

应用酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）检测２０例病毒性心肌炎（ＶＭＣ）,２０例扩张型心肌病（ＤＣＭ）和２０例正常人血清心脏肌钙蛋白Ｔ、Ｉ（ｃＴｎＴ、ｃＴｎＩ）水平,以探讨其对心肌损伤的诊断价值。结果发现,ＶＭＣ和ＤＣＭ患者血清ｃＴｎＴ、ｃＴｎＩ水平均较正常人显著升高（Ｐ＜０．０５）;而血清ｃＴｎＴ、ｃＴｎＩ水平及其阳性率在ＶＭＣ和ＤＣＭ两组间差异均无显著性（Ｐ＞０．０５）。提示,血清ｃＴｎＴ、ｃＴｎＩ水平是反映微小心肌损伤的敏感指标,拟诊ＶＭＣ、ＤＣＭ患者若血清ｃＴｎＴ、ｃＴｎＩ水平升高,有助于临床诊断。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

[目的] 探讨体外培养定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞 ( MSCs )向心肌样细胞分化的潜能.[方法] 取大鼠下肢骨骨髓,分离培养 MSCs,用 5-氮胞苷 ( 5-aza )定向诱导 24 h,相差显微镜下观察其形态变化,免疫组化法检测肌钙蛋白 ( cTnT )和心肌细胞结蛋白 ( desmin )表达,并通过 RT-PCR对肌球蛋白重链 ( MHC )在细胞中的表达进行鉴定.[结果] MSCs经 5-aza诱导后,部分细胞呈梭形,并可见肌管样结构.免疫组化检测示诱导后 MSCs的 cTnT阳性细胞数为 15%, Desmin表达强阳性, RT-PCR示诱导后 MSCs有 MHC表达.[结论] MSCs在体外能在一定条件下被诱导分化为心肌样细胞,是心肌缺血干细胞移植的较理想的细胞来源.