血管内皮细胞替代角膜内皮细胞的可行性

目的:探讨培养的人脐静脉内皮细胞行猫眼角膜内皮细胞移植的可行性。方法:取第三代体外培养人脐静脉内皮细胞,种植在处理过的人羊膜上,待完全形成单层后用于细胞移植手术。正常健康家猫20只,分为A人脐静脉内皮细胞移植组:将载有完全融合的人脐静脉内皮细胞的羊膜移植到去除自体角膜内皮细胞及后弹力层的猫角膜上;B单纯羊膜移植对照组:将保存人羊膜移植到去除自体角膜内皮细胞及后弹力层的猫角膜上;C去除内皮细胞对照组:去除猫眼自体角膜内皮细胞及后弹力层后,既不移植羊膜,也不移植血管内皮细胞。术后1,2,4,8,12,24wk以裂隙灯观察角膜的透明度、眼前节炎症情况,同时行大体及裂隙灯照相。并以角膜厚度仪测量角膜厚度,A组在术后1,2,4,8wk各取1例植片制备光镜标本进行组织病理学检查。对照组均取术后2wk植片做光镜检查。结果:A组共11例植片术后3d水肿渐消退,植片渐透明,并在1wk内保持完全透明。4例在术后1～2wk因排斥反应而混浊,其中3例于混浊后4wk逐渐恢复透明,1例持续混浊。6例在术后12～24wk植片持续透明,光镜观察显示,移植的内皮细胞在前房内成连续单层排列。B组植片持续水肿混浊,但较C组轻,未见免疫排斥反应发生;2wk植片光镜观察羊膜与基质贴附较好无皱折。C植片持续高度水肿混浊,在长达24wk的观察中未发现恢复透明现象。2wk植片光镜观察完全没有后弹力层及内皮细胞层,基质高度水肿,结构疏松紊乱。结论:以人羊膜为载体移植的人脐静脉内皮细胞在前房环境内存活24wk,并可行使角膜内皮细胞的屏障及液泵功能。与角膜基质贴附紧密,不发生免疫排斥反应。     

人脐静脉内皮细胞移植治疗角膜内皮功能衰竭的动物实验研究

目的：探讨异种脱细胞角膜基质为载体培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行后板层角膜移植（PLEK）治疗角膜内皮衰竭的可行性。方法：新西兰白兔30只,随机分为3组,实验组、基质组和对照组,每组10只,术中去除角膜内皮细胞,建立角膜内皮衰竭动物模型,实验组和基质组行后板层角膜移植术,对照组仅去除角膜后板层组织,不进行移植。术后观察3mo,对三组角膜的水肿混浊程度和中央角膜厚度进行统计学分析。结果：术后7d,实验组角膜水肿程度较基质组和对照组明显减轻,透明度增加。术后3mo时,实验组内皮细胞密度为2 026.4±129.3个/mm2,中央角膜厚度平均为505.2±25.4μm,基质组中央角膜厚度平均为1 535.6±114.5μm,而对照组为1 493.5±70.2μm。结论：实验以异种脱细胞角膜基质为载体培养人脐静脉内皮细胞,行后板层角膜移植术,治疗角膜内皮衰竭取得了初步成功。移植的人脐静脉内皮细胞能够在活体上成活,并具有一定的角膜内皮细胞的生物学功能,维持角膜透明,为临床上治疗角膜内皮疾病提供了新的思路和方法。     

视网膜特异性表达人血管内皮生长因子 基因载体的构建

目的构建在视网膜组织特异性表达的人血管内皮生长因子（VEGF）₁₆₅基因。方法用聚合酶链反应(PCR)方法从BLAB/C鼠全基因组扩增能在视网膜组织特异性表达的rho启动子，经限制性内切酶纯化后克隆于质粒pcDNA^3.1+-VEGF₁₆₅中，建立重组质粒pcDNA^3.1+-rho-VEGF₁₆₅，通过限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确重组质粒pcDNA^3.1+-rho-VEGF₁₆₅,由jetPEI介导转染人视网膜色素上皮细胞和人脐静脉内皮细胞，并通过免疫组织化学染色以及绘制细胞生长曲线检测在人视网膜色素上皮细胞和人脐静脉内皮细胞中VEGF蛋白的表达。结果在人视网膜色素上皮细胞中，重组质粒pcDNA^3.1+-rho-VEGF₁₆₅比质粒pcDNA^3.1+-rho-VEGF₁₆₅的VEGF蛋白表达强，在人脐静脉内皮细胞，两者的表达量无明显差别。结论pcDNA^3.1+-rho-VEGF₁₆₅载体的构建为进一步研究VEGF在视网膜新生血管形成中的致病机理提供基础材料，并为进一步建立视网膜特异性表达VEGF转基因鼠模型建立了基础。(中华眼底病杂志,2005,21:106-109)     

ZA-76对大鼠脉络膜新生血管形成、兔眼血流及血管内皮细胞的影响

目的观察ZA-76对激光诱发大鼠脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)形成、高眼压兔眼血流及人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)增殖的影响。方法氪激光诱发雄性棕色挪威大鼠CNV。30只(60眼)模型大鼠随机分为治疗组和对照组,每组15只(30眼)。治疗组在光凝后第2天开始腹腔注射20g·L-1ZA-76(20mg·kg-1),对照组给予等体积的溶媒二甲基亚砜,每天1次,时间均为4周。光凝后2周、4周分别行眼底照相和眼底荧光血管造影,评估CNV的形成率。光凝后4周处死大鼠,取材作病理切片,用于HE染色及免疫组织化学检测VEGF、COX-2的表达;用彩色微球技术检测20g·L-1ZA-76(50μL)对高眼压兔眼血流的影响;MTT法检测不同浓度ZA-76(100mg·L-1、200mg·L-1、400mg·L-1)对HUVEC细胞增殖的影响。结果治疗组光凝后2周、4周CNV形成率分别为80.83%、79.58%,明显低于对照组的94.58%、95.00%(均为P<0.01);治疗组VEGF、COX-2阳性染色密度分别为(51.13±6.15)mm-2、(37.22±5·18)mm-2,低于对照组[分别为(71.55±9.89)mm-2、(58.78±7.02)mm-2(均为P<0.01)];治疗组脉络膜血流在30min、60min、120min均明显高于对照组;不同浓度ZA-76干预48h,各浓度组ZA-76对HUVEC细胞增殖抑制作用均强于对照组,以400mg·L-1ZA-76作用更显著。结论 ZA-76能抑制激光诱导大鼠CNV形成,抑制VEGF、COX-2的表达;抑制血管内皮细胞增生;改善脉络膜血流。     

内皮抑素和avastin对小鼠脉络膜新生血管抑制作用的比较观察

目的：观察内皮抑素（恩度）对C57BL/6J小鼠脉络膜新生血管的抑制效应,并与avastin作比较。方法：采用532nm激光光凝建立小鼠脉络膜新生血管模型,2wk后进行病理组织学检查,观察CNV的形成情况。取40只成功造模的小鼠,随机分成空白对照组（1组,10只）、生理盐水组（2组,10只）、内皮抑素组（3组,10只）和avastin组（4组,10只）,光凝后2wk玻璃体腔给药1次,1wk后取材行HE、免疫组化染色观察结果。统计分析采用SPSS 16.0,方法为方差分析,多个样本两两比较用LSD-t检验,取P〈0.05作为检验水准。结果：2wk后HE病理组织学检查,光镜下可见大量新生血管形成,CNV阳性检出率为72.8%。生理盐水组与对照组比较,P〉0.05,对CNV无抑制作用; 内皮抑素组与空白对照组比较,P〈0.05,具有一定的抑制效应; avastin组与空白对照组比较,P〈0.05,对CNV有明显的抑制效应; 对avastin和内皮抑素组进行LSD-t检验,得出P〈0.05,差别有统计学意义,可以认为两者抑制CNV的效应是不相等的,由于（-overx）avastin =26.90,（-overx）内皮抑素=29.13,（-overx）avastin〈（-overx）内皮抑素,我们可推测,内皮抑素的抗CNV作用弱于avastin。结论：激光诱导有色小鼠C57BL/6J的CNV动物模型,成模时间短,成模率高,是进行CNV研究的理想模型。内皮抑素对CNV具有一定的抑制作用,未来很有可能成为眼科临床抗击CNV相关疾病的重要药物。     

人脐静脉内皮细胞体外分离培养方法改进的探索及鉴定

目的:建立能大量分离人脐静脉内皮细胞的体外培养的简便方法,分析人脐静脉内皮细胞抗原表达的特点.方法:采用玻璃接管连接医用三通管灌注0.133%胶原酶I法分离脐静脉内皮细胞,培养于10%胎牛血清的人内皮细胞培养液(含β-促内皮细胞生长因子和肝素钠),培养皿用1.5%明胶包被,促进内皮细胞贴壁.培养过程中观察细胞的形态特征,同时行免疫组织化学染色检测第八因子相关抗原、CD31表达情况,鉴定内皮细胞来源.结果:成功获取人脐静脉内皮细胞,原代人脐内皮细胞24 h贴壁,第5日细胞融合;第八因子相关抗原和CD31呈广泛的阳性表达.第八因子相关抗原阳性染色程度高于CD31,证实为人脐静脉内皮细胞.结论:应用玻璃接管连接医用三通管灌注胶原酶消化法分离脐静脉内皮细胞,利用10%优质胎牛血清的人内皮细胞培养基,添加β-促内皮细胞生长因子和肝素钠,并用1.5%明胶包被培养皿,能简单有效培养人脐静脉内皮细胞.     

内皮细胞生长因子和肝素对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的 研究内皮细胞生长因子(ECGF)和肝素对人脐静脉内皮细胞的促增殖作用，探讨ECGF在新生血管发生中的作用。方法 通过在第4代人脐静脉内皮细胞培养瓶中加入不同浓度ECGF和肝素，应用流式细胞仪分析其细胞周期。结果在ECGF浓度为5—30μg／m1范围内，肝素和ECGF有提高人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞周期中的S期细胞数、促进细胞的DNA合成的作用。结论 ECGF和肝素对内皮细胞有促进增殖作用。     

高糖对人脐静脉内皮细胞促红细胞生成素表达的影响

目的:探讨高糖条件下促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)mRNA和蛋白在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的表达。方法:体外培养HUVECs,实验组分别给予22mmol/L葡萄糖作用6,12,24,48,72h,对照组1为生理糖浓度组(5.5mmol/L),对照组2为甘露醇组(与22mmol/L高糖组等渗)。运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HUVECs EPO mRNA的表达。采用免疫荧光细胞化学方法测定HUVECsEPO蛋白质的表达。结果:HUVECs在22mmol/L高糖刺激12,24,48h后,EPO mRNA和蛋白表达均显著高于对照组1(P<0.05),72h开始下降。结论:HUVECs在高糖条件下EPO mRNA和蛋白表达增强,且与时间相关。EPO表达增加有可能促进新生血管生成。     

保存人羊膜对人脐静脉内皮细胞生长状态的影响

目的:观察保存人羊膜对体外培养及移植状态下人血管内皮细胞生长状况的影响,研究羊膜移植治疗角膜新生血管性疾病的机制。方法:取健康产妇胎盘羊膜,以酶消化加机械分离法去上皮,-80℃甘油保存。使用时复水,平铺于培养板底,干燥备用。1g/L胰蛋白酶灌流消化法收获人脐静脉内皮细胞,以1～1.7×108/L分别接种于培养板及铺有羊膜的培养板孔内培养。倒置显微镜及电镜进行形态学观察。待羊膜上细胞生长成完整单层后,将载有血管内皮细胞的羊膜移植到去内皮细胞的猫眼角膜内皮侧,3mo后取角膜植片行组织病理学观察。结果:羊膜及培养板上培养的细胞均在24h完全贴壁,2～3d形成单层,细胞为铺路石样,Ⅷ因子染色阳性。植入猫眼内的人脐静脉内皮细胞在长达3mo的观察期内仍存活,有些甚至增生成多层排列。结论:体外培养及移植状态下,保存人羊膜都不能抑制血管内皮细胞增殖,其抑制角膜新生血管形成的机制可能不是通过内皮细胞途径。     

高糖对人脐静脉内皮细胞促红细胞生成素受体表达的影响

目的探讨高糖条件下促红细胞生成素（EPO）受体mRNA及蛋自在人脐静脉内皮细胞（UVECs）的表达差异。方法体外常规培养人UVECs细胞株,实验组分别给予22mmol／L葡萄糖作用12、24、48、72h,5．5mmol／L葡萄糖组（生理糖浓度）设为正常对照组,5．5mmol／L葡萄糖＋16．5mmol／L甘露醇组为渗透压对照组。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、免疫细胞化学法对高糖条件下人UVECsEPO受体mRNA和蛋白的表达进行检测。结果正常对照组和渗透压对照组相比,人UVECsEPO受体mRNA和蛋白表达差异均无统计学意义（P〉0．05）。人UVECs在22mmol／L高糖作用12、24、48、72h后,EPO受体mRNA和蛋白表达均显著高于正常对照组（P〈0．05）,且随着时间的延长,EPO受体mRNA和蛋白的表达均逐渐增加。结论高糖条件下人UVECsEPO受体mRNA和蛋白表达均增强,且呈时间依赖性。人UVECs在22mmol／L高糖条件下EPO受体mRNA及蛋白表达的增加与渗透压无关。     

Effect of human vitreous and hyalocyte-derived factors on vascular endothelial cell growth

Purpose: In the present study we have examined the effects of human vitreous and hyalocyte-conditioned medium on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Methods: Human umbilical vein endothelial cells were cultured and treated in quadruplicate with human vitreous and hyalocyte-conditioned medium at different concentrations. Cell numbers were counted on days 1, 3, 5 and 7. Morphological changes and the viability of cells after treatment were also monitored. Results: The results indicate that both human vitreous and hyalocyte-conditioned medium inhibit proliferation and reduce the viability of HUVEC in vitro. These inhibitory effects were dose- and time-dependent. Conclusions: The observations suggest that human hyalo-cytes and vitreous contain anti-angiogenic factors that influence vascular endothelial cell growth. These results, combined with those of previous studies, may yield important information about the functional role of vitreous and hyalocytes in intraocular vascular regression.     

LPS活化的小胶质细胞对人脐静脉内皮细胞VEGF及ZO-1表达的影响

目的研究活化的小胶质细胞对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）和ZO-1表达的影响。方法原代培养视网膜小胶质细胞,纯化鉴定后分为三组：A组,空白对照组;B组,未激活的小胶质细胞组;C组,100ng／mL脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）激活的小胶质细胞组,然后采用Transwell小室与HUVECs共培养。用免疫荧光染色观察各组HUVECs紧密连接蛋白ZO-1的表达,并用Western Blot方法检测各组细胞VEGF和ZO-1的表达。结果细胞免疫荧光染色结果显示,LPS活化的小胶质细胞作用于HUVECs后,HUVECs的ZO-1表达明显低于未活化的小胶质细胞作用组和空白对照组。Western Blot结果亦显示,LPS活化的小胶质细胞作用组ZO-1的表达明显低于未活化的小胶质细胞作用组和空白对照组（P〈0．05）,而VEGF表达则高于未活化的小胶质细胞作用组和空白对照组（P〈0．05）。结论活化的小胶质细胞影响血管内皮细胞表达VEGF和ZO-1,可能是导致屏障功能破坏的重要机制之一。     

血管内皮细胞生长因子抑制剂对视网膜血管内皮细胞自噬的促进作用

目的　观察血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）抑制剂对小鼠视网膜血管内皮细胞（retinal vascular endothelial cells,RVECs）自噬水平的影响。方法　将RVECs随机分为五组:正常对照组、缺氧对照组、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）组、VEGF抑制剂（anti-VEGF）组和3-MA+anti-VEGF组。采用Western blot法检测RVECs中两种自噬标志蛋白微管相关蛋白1 轻链 3 （LC3）及Beclin-1的表达;计算绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）阳性斑点细胞占比;透射电子显微镜下观察细胞内形成的自噬体的超微结构。结果　正常对照组、缺氧对照组、3-MA组、anti-VEGF及3-MA+anti-VEGF组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ分别为0.182±0.125、0.587±0.101、0.309±0.151、0.914±0.037及0.585±0.098;Beclin-1分别为0.205±0.035、0.590±0.120、0.425±0.082、0.842±0.087及0.607±0.022;GFP阳性斑点细胞比例分别为17.107%±3.521%、90.278%±2.684%、82.591%±4.490%、94.798%±1.760%及89.472%±3.764%。与正常对照组相比,缺氧对照组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白表达增高,GFP阳性斑点细胞的比例增加（均为P<0.05）,同时自噬体增多。与缺氧对照组相比,3-MA组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平及GFP阳性斑点细胞比率降低（均为P<0.05）,同时自噬体减少;anti-VEGF组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平及GFP阳性斑点细胞比率升高（均为P<0.05）,同时自噬体增多。与anti-VEGF组相比,3-MA+anti-VEGF组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平及GFP阳性斑点细胞比率降低（均为P<0.05）,同时自噬体减少。结论　VEGF抑制剂对缺氧状态下视网膜血管内皮细胞的自噬水平有促进作用。     

白藜芦醇对视网膜血管内皮细胞增殖及VEGF表达的影响(英文)

目的:探讨白藜芦醇对缺氧诱导的视网膜血管内皮细胞增殖的影响。方法:用100μmol/LCoCl2模拟缺氧环境,以体外培养的人视网膜血管内皮细胞为模型,采用MTT法测定细胞增殖、SABC法检测血管内皮生长因子的表达,并以计算机图像分析仪进行分析,观察研究白藜芦醇对CoCl2诱导的视网膜血管内皮细胞增殖的影响。结果:白藜芦醇对CoCl2诱导的视网膜血管内皮细胞增殖具有显著抑制作用(P<0.01),且呈时间和剂量依赖关系;同时,各给药组均抑制VEGF的表达(P<0.01)。结论:白藜芦醇能抑制CoCl2诱导的视网膜血管内皮细胞增殖及VEGF的表达,将为视网膜新生血管疾病的药物治疗提供一条新思路。     

神经生长因子对兔角膜内皮细胞增殖的影响

目的 探讨神经生长因子（NGF）对角膜内皮细胞增殖的影响。方法 在培养兔角膜内皮细胞的培养液中分别添加5U／ml,50U／ml和500u/ml的NGF,加药后第3,7天采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法,在酶标仪上测定570nm波长处的吸光度值来观测细胞增殖情况。结果 与对照组比较,加药后第3,7天,3组的NGF对培养的兔角膜内皮细胞增殖均促进作用（P＜0．01）,且呈剂量依赖性。其中50U／ml组及500U／ml组作用强于5U／ml（P＜0．05）,而50U／ml组和500U／ml组比较作用无差异（P＞0．05）。结论 外源性NGF对培养的兔角膜内皮细胞增殖有明显的促进作用。     

粉防己碱抑制人脐静脉内皮细胞增殖的实验研究

目的观察粉防己碱(Tet)对体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响。探讨其抗新生血管形成的药物效应。方法以脐带来源的脐静脉内皮细胞行原代及传代培养,以光镜、第Ⅷ因子相关抗原的SABC免疫细胞方法进行观察及鉴别。应用MTT法测定不同浓度(10-3、10-4、10-5、10-6mol/L)Tet对HUVEC的抑制作用。用流式细胞仪检测Tet对细胞周期的影响。结果(1)Tet能抑制HUVEC增殖且具有量效依赖关系。(2)流式细胞仪显示HUVEC经105mol/LTet处理后,G1期增加了19·69%,S期下降了12·31%,G2期下降了7·38%。结论Tet能抑制内皮细胞增殖,是一种潜在的新生血管抑制剂。     

葛根素对体外培养的视网膜血管内皮细胞增殖的影响

目的观察不同浓度葛根素对体外培养的视网膜血管内皮细胞增殖的影响。方法取第7代牛视网膜血管内皮细胞用于实验。葛根素组中加入含不同浓度葛根素的培养液,对照组加入等量空白培养液。24h及48h后采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测视网膜血管内皮细胞的增殖情况。结果与空白对照组比较,0.05mg·L-1、0.50mg·L-1、5.00mg·L-1、50.00mg·L-1和500.00mg·L-1葛根素组作用24h及48h后视网膜血管内皮细胞增殖明显。24h葛根素组OD值(按照葛根素浓度由低到高分别为:0.283±0.060、0.337±0.030、0.349±0.030、0.405±0.030、0.352±0.020)明显高于对照组(0.161±0.060),差异均有统计学意义(均为P<0.01);48h葛根素组OD值(按照葛根素浓度由低到高分别为:0.371±0.030、0.377±0.040、0.410±0.040、0.400±0.020、0.310±0.040)也明显高于对照组(0.279±0.050),差异均有统计学意义(均为P<0.01)。结论葛根素对体外培养的视网膜血管内皮细胞有明显的促增殖作用,其作用与葛根素的剂量有关。     

姜黄素抑制人血管内皮细胞增殖的研究

目的观察姜黄素对体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖和凋亡的影响,寻找辅助治疗和预防翼状胬肉复发的新方法。方法用0~160μmol/L姜黄素作用体外培养的HUVEC,24~96h后观察不同浓度姜黄素对HUVEC的影响。MTT法及免疫组织化学染色增殖细胞核抗原(PCNA)检测细胞生长活性,流式细胞仪测定细胞周期时相变化。结果在40~160μmol/L浓度作用24~72h范围内,姜黄素可剂量和时间依赖性的抑制HUVEC增殖(P<0.05)。20,40,80,160μmol/L姜黄素作用24h后,流式细胞仪检测结果发现,姜黄素作用组均出现典型的亚二倍体凋亡峰,G0/G1期细胞百分比上升(P<0.05),S期细胞百分比下降(P<0.05),说明细胞阻滞于G0/G1期。当姜黄素的浓度在40~160μmol/L范围内能浓度依赖性地抑制细胞表达PCNA(P<0.05)。结论姜黄素可显著抑制HUVEC增殖,使细胞周期停滞于G0/G1期,并诱导其凋亡,作用呈时间和剂量依赖性。提示姜黄素通过抑制新生血管治疗翼状胬肉具有潜在的应用前景。     

Comparison of conventional and directional freezing for the cryopreservation of human umbilical vein endothelial cells

AIM:To compare conventional slow equilibrium cooling and directional freezing (DF) by gauze package for cryopreservation of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).METHODS: HUVECs were randomly assigned to conventional freezing (CF) and DF by gauze package group. The two groups of HUVECs were incubated with a freezing liquid consisting of 10% dimethylsulfoxide (DMSO), 60% fetal bovine serum(FBS) and 30% Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) and then put into cryopreserved tubes. CF group, slow equilibrium cooling was performed with the following program:precool in 4℃ for 30min, -20℃ for 1h, and then immersion in -80℃ refrigerator. DF group, the tubes were packaged with gauze and then directional freezing in -80℃ refrigerator straightly. One month later, the vitality of HUVECs were calculated between two groups.RESULTS: There was no significant difference in the survival rate and growth curve between CF and DF groups. The DF group was significantly better than CF group in adherent rates, morphological changes and proliferative ability.CONCLUSION:In the conventional cryopreserved method, cells are slow equilibrium cooling by steps (4℃, -20℃ and finally -80℃), which is a complicated and time-consuming process. But the improved DF by gauze package method is better than conventional method, for which is convenient and easy to operate.