调控TGF-β1/Smad4通路对宫颈癌SiHa细胞自噬基因LC3的影响

目的:探究调控TGF-β1/Smad4通路对宫颈癌SiHa细胞自噬基因LC3的影响。方法:取对数生长期的宫颈癌SiHa细胞加入不同浓度的TGF-β1和SIS3干预24小时后收取细胞,采用实时荧光定量PCR法及免疫印迹法检测自噬基因LC3在mRNA水平及蛋白水平上的表达量变化。结果:不同浓度的TGF-β1作用SiHa细胞24小时后,随TGF-β1浓度升高,LC3 mRNA及蛋白的表达量逐渐增高（P＜0.05）。不同浓度的SIS3作用SiHa细胞24小时后,随SIS3浓度升高,LC3 mRNA及蛋白的表达量逐渐降低（P＜0.05）。结论:外源性的TGF-β1/Smad4通路激活剂TGF-β1可使宫颈癌SiHa细胞自噬蛋白LC3 mRNA和蛋白表达量升高,诱导宫颈癌SiHa细胞发生自噬;外源性的TGF-β1/Smad4通路抑制剂SIS3可使宫颈癌SiHa细胞自噬蛋白LC3 mRNA和蛋白表达量降低,抑制宫颈癌SiHa细胞发生自噬;且随TGF-β1和SIS3浓度的增加,LC3的表达量出现变化,具有一定的浓度依赖性。     

羟喜树碱通过诱导自噬抗宫颈癌的机制研究

目的探讨抗肿瘤药物羟喜树碱(HCPT)对宫颈癌HeLa细胞作用的机制。方法 CCK8检测Hela细胞增殖,Western blot检测自噬和凋亡相关蛋白的表达,GFP-LC3 shRNA转染和Hoechst染色后,荧光显微镜下观察细胞自噬特异小体量的改变以及凋亡形态学的变化。结果 HCPT抑制Hela细胞生长呈浓度依赖性(P<0.05),IC503μmol/L HCPT作用Hela细胞后,自噬相关蛋白Beclin1、p62的表达以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值发生改变,差异有显著性意义(P均<0.05);凋亡相关蛋白Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2表达也发生明显改变(P均<0.05);荧光显微镜下观察Hela细胞带有GFP-LC3的自噬体增加,凋亡细胞也增多(P均<0.05)。结论 HCPT能够诱导HeLa细胞中自噬相关基因Beclin1、p62以及LC3的表达增强,从而激活细胞自噬发生;且HCPT能够激活宫颈癌HeLa细胞发生自噬,进而诱导细胞凋亡来达到抗肿瘤目的。     

miR-18a对胶质瘤细胞增殖和自噬的影响

目的:探讨miR-18a在神经胶质瘤细胞增殖和自噬中的作用。方法:采用瞬时转染的方法将miR-18a inhibitor及其阴性对照(negative control inhibitor,NC inhibitor)分别转染大鼠C6胶质瘤细胞;实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测miR-18a在C6胶质瘤细胞中的表达;CCK-8法检测转染miR-18a inhibitor后C6细胞的增殖活性;mCherry-EGFP-LC3B质粒瞬时转染各组细胞,以动态监测自噬通量;Western blot检测敲低miR-18a后C6细胞中自噬相关蛋白LC3、p62、Beclin1的表达情况;RT-qPCR检测转染miR-18a抑制剂后C6细胞中自噬相关基因Beclin1和LC3B的相对表达水平。结果:RT-qPCR结果显示,与NC inhibitor组相比,miR-18a inhibitor组的miR-18a表达量显著降低（P＜0.05）。敲低miR-18a后显著抑制C6胶质瘤细胞的增殖（P＜0.05）。倒置荧光显微镜下观察到抑制miR-18a后可阻断自噬流,抑制自噬小体和溶酶体融合。抑制miR-18a可使胶质瘤细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1蛋白的相对表达量显著降低（P＜0.05）,p62蛋白的相对表达量明显升高（P＜0.05）。敲低miR-18a后能抑制胶质瘤细胞中的Beclin1和LC3B mRNA表达（P＜0.05）。结论:miR-18a下调可抑制胶质瘤细胞的增殖和自噬。     

miR-216b-5p靶向ATG5介导自噬逆转食管癌Eca109细胞的顺铂耐药性

目的：探讨miR-216b-5p 对食管癌Eca109 细胞顺铂（DDP）耐药性的影响及其作用机制。方法:采用qPCR 法检测miR-216b-5p 在食管癌细胞TE-1、KYSE-150、Eca109 和耐药细胞Eca109/DDP 中的表达水平。利用脂质体转染技术分别将miR-216b-5p mimic 及mimic NC、自噬相关蛋白5（ATG5）过表达质粒转染到Eca109/DDP 细胞中,用CCK-8、EdU 法和FCM分别检测转染后细胞的增殖和凋亡;mRFP-eGFP-LC3双荧光标记实验检测mRFP-eGFP-LC3慢病毒感染后各组细胞自噬发生情况, WB法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin 1和P62 表达。用荧光素酶报告基因实验验证miR-216b-5p与ATG5的靶向关系,WB法检测ATG5的表达。建立裸鼠Eca109/DDP细胞移植瘤模型,观察miR-216b-5p过表达对移植瘤生长的影响。结果：miR-216b-5p在TE-1、KYSE-150、Eca109 和Eca109/DDP 细胞中均呈低表达（均P<0.05）。过表达miR-216b-5p可显著抑制Eca109/DDP 细胞的增殖并诱导凋亡（均P<0.05）,减少细胞中自噬小体数量（P<0.05）,下调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin 1蛋白水平、上调P62 蛋白水平（均P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验证实miR-216b-5p靶向并负调控ATG5的表达（P<0.05）,过表达ATG5 可使miR-216b-5p mimic 对Eca109/DDP 细胞增殖、自噬的抑制作用和凋亡的诱导作用明显减弱（均P<0.05）,自噬相关蛋白P62 表达降低、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin 1 表达升高（均P<0.05）。荷瘤实验结果表明,miR-216b-5p 过表达可显著抑制裸鼠移植瘤的生长（P<0.05）。结论：miR-216b-5p过表达可逆转食管癌Eca109/DDP细胞对DDP的耐药性,其机制可能与靶向负调控ATG5表达并影响细胞自噬有关。     

苹果多酚通过激活AMPK/SIRT1信号通路对LPS诱导的肺上皮细胞自噬反应的影响

目的:探讨苹果多酚通过调节腺苷酸活化蛋白激酶/沉默信息调节因子1（AMP-activated protein kinase/Sirtuin1,AMPK/SIRT1)信号通路对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的人肺泡上皮细胞（A549）自噬反应的影响。方法:使用不同浓度的苹果多酚提取物（apple polyphenol extract,APE）预处理A549细胞2 h后,LPS诱导A549细胞培养24 h,MTT法检测增殖活性,筛选APE最佳预处理浓度;将A549细胞分为对照组、LPS组（3 mg/L LPS）、LPS+APE组（3 mg/L LPS+20 μg/mL APE）、APE+Compound C组（3 mg/L LPS+20 μg/mL APE+50 μmol/L Compound C）,免疫荧光染色观察A549细胞自噬;流式细胞术检测A549细胞凋亡;Western blot法检测细胞中自噬相关蛋白及AMPK/SIRT1通路相关蛋白表达水平。结果:与对照组比较,经LPS诱导的A549细胞增殖活性、自噬水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、SIRT1、p-ULK1/ULK1、p-AMPK/AMPK蛋白表达降低,p62蛋白表达及细胞凋亡率升高（P＜0.05）;与LPS组比较,LPS+APE组细胞增殖活性、自噬水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、SIRT1、p-ULK1/ULK1、p-AMPK/AMPK蛋白表达水平显著升高,p62蛋白表达及细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）;与LPS+APE组比较,APE+Compound C组A549细胞增殖活性、自噬水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、SIRT1、p-ULK1/ULK1、p-AMPK/AMPK蛋白表达水平显著降低,p62蛋白表达及细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）。结论:苹果多酚通过激活AMPK/SIRT1 信号通路提高LPS诱导的肺上皮细胞自噬,降低细胞凋亡。     

莱菔硫烷对人黑色素瘤A375细胞自噬的影响

目的 探讨莱菔硫烷（sulforaphane,SFN）对人黑色素瘤A375细胞自噬的影响。方法 分别采用不同浓度（0 μmol·L^-1、5μmol·L^-1、10 μmol·L^-1、20 μmol·L^-1、40 μmol·L^-1）SFN及联合自噬抑制剂氯喹处理人黑色素瘤A375细胞后,采用MTT法检测细胞增殖情况,Real-time PCR和Western blot检测自噬相关分子LC3（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）、Beclin-1和p62以及凋亡相关分子Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达水平。 结果 MTT法检测结果显示,SFN呈剂量依赖式抑制A375细胞增殖（F=21.517,P＜0.001）。与对照组比较,不同浓度（5 μmol·L^-1、10 μmol·L^-1、20 μmol·L^-1和40 μmol·L^-1） SFN均能上调自噬相关分子LC3Ⅱ、Beclin-1 mRNA和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表达,上调促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达（P<0.05）,同时下调自噬相关分子p62及抑凋亡蛋白Bcl-2的表达（P<0.05）。氯喹联合不同浓度SFN处理A375细胞后各组细胞增殖率均较相应剂量的单纯SFN处理组低（P<0.05）。结论 SFN可诱导黑色素瘤A375细胞自噬并促进细胞凋亡,联合自噬抑制剂氯喹能增强细胞增殖抑制作用,可能是黑色素瘤有效的治疗药物。     

黑种草子总皂苷对人宫颈癌SiHa细胞生物学行为的影响

目的：研究黑种草子总皂苷提取物（TSNG）对人宫颈癌SiHa细胞的增殖、迁移、凋亡和自噬等生物学行为的影响。方法：将SiHa细胞分为空白对照组和不同浓度（0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.4、1.6、1.8 mg/mL）的TSNG作用组,以及10 μmol/L羟氯喹（HCQ）干预组;四甲基噻唑蓝（MTT）法检测各组细胞的生长抑制率;划痕实验检测细胞的相对迁移率;流式细胞术Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡率;Hoechst染色观察细胞核凋亡现象;单丹磺酰戊二胺（MDC）染色观察细胞内自噬体数量;Western blot实验检测LC3-Ⅱ和p62蛋白表达。结果：与空白对照组相比,TSNG对细胞的生长有抑制作用且呈剂量效应关系（P<0.05或0.01）;0.9、1.0、1.1 mg/mL TSNG处理组细胞相对迁移率分别为（20.40±2.49）%、（15.14±0.39）%、（5.05±1.04）%,均低于空白对照组的（36.63±2.52）%（P<0.01）;1.0、1.2、1.4 mg/mL TSNG处理组细胞的凋亡率分别为（39.10±0.22）%,（68.37±0.58）%和（80.93±0.12）%,均高于空白对照组的（10.73±0.82）%（P<0.05或0.01）;与空白对照组比较,TSNG处理组细胞核表现出凋亡现象细胞数量增多,且细胞内自噬体数量增加,LC3-Ⅱ和p62蛋白表达上升（P<0.05或0.01）;相较于TSNG作用组,HCQ预处理组LC3-Ⅱ蛋白表达无显著变化（P>0.05）。结论：TSNG对SiHa细胞体外增殖、迁移表现出明显的抑制作用,并在诱导细胞凋亡的同时阻断细胞自噬流。     

宫颈癌中自噬标记蛋白Beclin1、p62的表达及其临床意义

目的 研究宫颈癌中自噬标记蛋白Beclin1、p62表达的水平及其对临床诊断及治疗的意义.方法 选择子宫颈鳞状细胞癌组织标本140例,对纳入的组织标本使用Beclin1和p62蛋白标记.阳性结果 采用半定量评分方法进行判定.Beclin1、p62的表达与患者临床特征相关性分析采用χ2检验.结果Beclin1主要表达于细胞膜及细胞质,与正常子宫颈上皮相比,Beclin1在宫颈癌组织中的表达明显降低(P<0.05).但宫颈癌中Beclin1表达量与患者临床病理特征无相关性(P>0.05).p62在子宫颈鳞状细胞癌组织细胞质中的表达明显升高,且与淋巴结的转移密切相关(P<0.05).Beclin1和p62的阳性表达率之间未见明显的相关性(P>0.05).结论 Beclin1、p62的表达量与子宫颈癌的发生发展相关,且p62的核浆转移与子宫颈癌有相关性.临床上,可根据Beclin1和p62的表达对疾病进展进行评估.     

沙利度胺对人宫颈癌Hela细胞周期的影响及其作用机制

目的:探讨沙利度胺对人宫颈癌Hela细胞周期的影响及其作用机制。方法:沙利度胺（50 μg/ml、100 μg/ml和200 μg/ml）处理人宫颈癌Hela细胞24 h后,运用CCK-8法检测细胞活力;采用流式细胞术检测细胞周期分布;采用蛋白免疫印迹法检测Cyclin E、p53、p-p53和GAPDH蛋白表达水平。结果:沙利度胺(50 μg/ml、100 μg/ml和200 μg/ml)作用Hela细胞24 h后,细胞活力显著降低,且呈浓度依赖性(P<0.05)。50 μg/ml、100 μg/ml和200 μg/ml沙利度胺作用24 h后,Hela细胞G0/G1期细胞数明显增加,S期细胞数显著减少(P<0.05)。此外,沙利度胺作用Hela细胞24 h可明显下调Cyclin E蛋白的表达(P<0.05)。沙利度胺处理Hela细胞24 h后,p-p53/p53比值明显增大(P<0.05)。结论:沙利度胺可能通过促进p53蛋白的活化从而抑制人宫颈癌细胞周期进程。     

20（S）-人参皂苷Rg3对肝癌细胞自噬介导的索拉非尼敏感性的影响

目的 探索中药单体20（S）-人参皂苷Rg3（Rg3）对肝癌细胞自噬介导的索拉非尼药物敏感性的影响。方法 以人肝癌细胞株Hep3B为观察对象,分别接受Rg3、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）、索拉非尼、Rg3+索拉非尼和3-MA+索拉非尼处理,采用MTT法检测Hep3B细胞对Rg3、索拉非尼及3 MA的敏感性,CCK-8法检测Rg3、3-MA分别联合索拉非尼后对Hep3B细胞的增殖抑制作用,q值判断联合用药效果;LC3 Conversion实验及LC3 Turnover实验检测Rg3和索拉非尼对Hep3B细胞自噬的影响,Western blotting检测Rg3和索拉非尼对自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅰ／LC3-Ⅱ、p62水平的影响。结果 MTT检测显示,3种药物对Hep3B细胞的增殖抑制作用呈剂量和时间依赖性。CCK-8检测显示,低、中浓度（0.5、1 μg／ml）索拉非尼联合Rg3或3 MA对Hep3B细胞抑制作用均增强（P均＜0.01）,表现为协同作用;高浓度（2 μg／ml）索拉非尼联合Rg3亦呈抑制增强作用（P＜0.05）,但联合3-MA的差异无统计学意义（P＞0.05）,高浓度索拉非尼与两药联合后均表现为相加作用。LC3 Conversion实验显示,随着药物作用时间的延长,Rg3及索拉非尼均使LC3-Ⅱ蛋白水平逐渐升高;LC3 Turnover实验显示,索拉非尼联合溶酶体抑制剂氯喹（CQ）后,LC3-Ⅱ蛋白水平明显升高（P＜0.01）,而Rg3联合CQ前后则无明显差异（P＞0.05）。Western blotting检测显示,与对照组相比,Rg3、索拉非尼均可使Beclin1蛋白表达升高（P＜0.01）,索拉非尼联合3-MA后Beclin1水平明显降低（P＜0.01）,而联合Rg3后下降不明显（P＞0.5）。三药均可使LC3-Ⅱ水平升高（P＜0.05）,索拉非尼联合Rg3后LC3-Ⅱ水平高于索拉非尼单药（P＜0.01）,而联合3-MA后LC3-Ⅱ水平无明显变化（P＞0.05）。3-MA、索拉非尼作用后,p62蛋白水平明显低于对照组（P＜0.05）,索拉非尼联合Rg3后p62水平明显升高（P＜0.01）,联合3-MA后水平明显降低（P＜0.01）。结论 索拉非尼可通过增加Beclin1的表达诱导肝癌细胞自噬导致药物敏感性下降,Rg3可增加索拉非尼的敏感性,其机制可能是通过抑制自噬降解从而抑制肝癌自噬活性来实现的。     

苦参碱可能通过自噬抑制肺癌A549细胞的增殖

目的:探究苦参碱对肺癌A549细胞的增殖抑制作用及其对自噬的影响。方法:体外培养肺癌A549细胞，分别用不同浓度的苦参碱处理后，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖抑制率；倒置显微镜下观察不同浓度苦参碱时A549细胞的形态变化；采用细胞克隆实验检测不同浓度的苦参碱对A549细胞的增殖抑制程度；Western blot 检测自噬相关蛋白Beclin1、p62及LC3A/B的表达水平；透射电镜下观察经苦参碱处理后A549细胞内自噬泡的变化。结果:苦参碱对肺癌A549细胞有明显的抑制作用，并且呈剂量依赖性；倒置显微镜下发现经苦参碱处理后肺癌A549细胞皱缩、变小、胞内可见大小不一的颗粒状物质；随着苦参碱浓度的增加，肺癌A549细胞形成的克隆集落逐渐变小、变少；Western blot 检测自噬相关蛋白Beclin1、p62及LC3A/B的水平均随着苦参碱浓度的增加而增加，并呈剂量依赖性；透射电镜下观察到苦参碱处理的肺癌A549细胞内自噬空泡明显增加，并且可观察到吞噬线粒体的自噬泡。结论:苦参碱可抑制肺癌A549细胞的增殖，并能诱导细胞内自噬的发生及损伤自噬降解通路，因此我们推测苦参碱可能通过自噬造成细胞内物质和能量的循环紊乱从而抑制肺癌A549细胞的增殖。     

自噬因子Beclin 1和LC3表达与胃癌临床病理特征的相关性研究

目的 探讨自噬因子Beclin 1和LC3表达与胃癌临床病理特征的相关性.方法 采用免疫组织化学方法,检测胃癌组织中自噬因子Beclin 1和LC3的表达情况.结果 Beclin 1蛋白在胃癌组织中的表达率为42.5%(51/120),在癌旁组织其表达率为93.3%(112/120),两者比较有显著性差异(χ2=21.3,P<0.05);LC3蛋白在胃癌组织中的表达率为90.0%(108/120),明显高于癌旁组织的表达率(29.3%,34/120),两者有显著性差异(χ2=24.8,P<0.05).Beclin 1和LC3蛋白表达与胃癌肿瘤分化程度和淋巴结转移密切相关,P<0.05.结论 自噬因子Beclin1和LC3表达可能与胃癌的发生发展有关.     

环孢素A调控自噬诱导肿瘤相关巨噬细胞极化干预子宫内膜癌细胞的恶性生物学行为

目的:探究环孢素A（CsA）对肿瘤相关巨噬细胞极化的调控作用及其与子宫内膜癌（EC）细胞恶性生物学行为之间的联系,并初步探讨相关机制。方法:采用佛波酯（PMA）和白细胞介素-4（IL-4）诱导THP-1细胞向具有肿瘤相关巨噬细胞极化分型特点的M2样巨噬细胞分化,分别以50、100、150、200 ng/mL CsA处理诱导后的细胞24 h,CCK-8法检测细胞活性,流式细胞术检测CD86和CD206表达,实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测诱导型一氧化氮合酶 （iNOS）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β（TGF-β)、重组人精氨酸酶1（Arg-1)的mRNA相对表达量。将人子宫内膜癌Ishikawa细胞随机分为4组并进行相应处理:对照组,Ishikawa细胞加入细胞培养液培养24 h;CsA组,200 ng/mL CsA干预Ishikawa细胞24 h;肿瘤相关巨噬细胞（TAM）组,肿瘤相关巨噬细胞培养液上清干预Ishikawa细胞24 h;CsA+TAM组,经200 ng/mL CsA处理肿瘤相关巨噬细胞的培养液上清干预Ishikawa细胞24 h。处理结束后,CCK-8法检测细胞活性,Transwell小室实验检测细胞迁移与侵袭,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,Western Blotting检测自噬相关蛋白表达,免疫荧光染色检测自噬标记物LC3表达,透射电子显微镜观察自噬体形成。结果:经过不同浓度CsA处理肿瘤相关巨噬细胞后,细胞存活率未发生变化（P＞0.05）,而细胞中CD86表达增加、CD206表达下降,iNOS、TNF-α的mRNA相对表达量升高,TGF-β、Arg-1的mRNA相对表达量降低（P＜0.01）;与对照组比较,CsA组Ishikawa细胞存活率下降,迁移数目与侵袭数目减少,细胞凋亡率增加,Beclin-1蛋白表达下降、p62蛋白表达增加,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下调,LC3荧光表达减弱,细胞内未见自噬体,而TAM组细胞迁移数目与侵袭数目增加,细胞凋亡率减少,Beclin-1蛋白表达增加、p62蛋白表达下降,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上调,LC3荧光表达增强,细胞内自噬体数目较多（P＜0.01）;与TAM组比较,CsA+TAM组细胞存活率下降,迁移数目与侵袭数目减少,细胞凋亡率增加,Beclin-1蛋白表达下降、p62蛋白表达增加,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下调,同时,LC3荧光表达减弱,细胞内自噬体减少（P＜0.01）。结论:CsA通过调控肿瘤相关巨噬细胞的极化,抑制子宫内膜癌细胞增殖、迁移与侵袭能力,其机制可能与细胞自噬水平相关。     

WP1130对宫颈鳞癌细胞顺铂化疗增敏性的分析

目的:探索X染色体连锁的泛素特异肽酶9（ubiquitin-specific peptidase 9 X-linked,USP9X）抑制剂WP1130在宫颈鳞癌细胞中对顺铂（diaminodichloroplatin,DDP）化疗敏感性的影响。方法:CCK8筛选DDP及WP1130作用于SiHa细胞的最佳浓度剂量,并研究DDP与WP1130联用对SiHa细胞抑制率的影响;免疫细胞化学（immunocytochemistry,ICC）方法检测WP1130对SiHa细胞USP9X表达的影响;Western blot方法检测药物作用前后USP9X蛋白的表达水平,并探讨WP1130对SiHa细胞顺铂化疗敏感性的影响。结果:CCK8筛选的3 μg/ml DDP及1.5 μmol/L WP1130作用于SiHa 细胞72 h为最佳剂量, WP1130联合DDP组SiHa细胞的存活率较单用DDP组显著降低（P＜0.05）;ICC显示WP1130可抑制USP9X蛋白的表达;Western blot发现SiHa细胞中USP9X蛋白的表达水平在DDP及WP1130作用后降低（P＜0.05）,且在DDP联用WP1130组中最低（P＜0.05）。结论:WP1130能增强宫颈鳞癌细胞对DDP的敏感性,可为宫颈鳞癌综合治疗提供有力依据。